栀子苷或栀子总环烯醚萜苷的脂质体制剂

摘要

本发明公开了一种栀子苷或栀子总环烯醚萜苷的脂质体制剂，包括由磷脂、胆固醇形成的脂质体和包载于所述脂质体中的栀子苷或栀子总环烯醚萜苷；磷脂和胆固醇的重量比为3∶1至7∶1，优选的是5∶1；栀子苷或栀子总环烯醚萜苷与磷脂的重量比为1∶2至1∶8，优选的是1∶4。所述磷脂选自卵磷脂、大豆磷脂、蛋黄磷脂或磷脂胆酰碱，优选的是大豆磷脂或蛋黄磷脂。该制剂可以延长栀子苷或栀子总环烯醚萜苷与黏膜的接触时间。所述脂质体制剂装入鼻用吸入装置制成喷雾剂，通过鼻腔给药有效地提高栀子苷或栀子总环烯醚萜苷在脑组织的分布。本发明还公开了所述的脂质体制剂在制备治疗缺血性脑损伤疾病中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域，特别涉及包载了栀子苷或栀子总环烯醚萜苷的脂质体制剂。

背景技术

缺血性脑损伤疾病占脑血管病80％左右，是指局部脑组织包括神经细胞、胶质细胞及联 系纤维由于供血障碍发生的变性、坏死或功能丧失。脑动脉一旦闭塞，脑组织得不到足够的 血液灌注，发生缺血、缺氧，也就开始了缺血性脑血管病的生理、病理演变过程，这一过程 最终导致神经元死亡和神经功能的缺损。它是临床上的常见病、多发病，死亡率及致残率很 高，现已经成为世界公认的三大致死疾病之一。

近年来研究表明，栀子苷及栀子总环烯醚萜苷在脑缺血级联反应病理过程多个环节的主 要靶点，发挥清热泻火，凉血解毒之功，使邪去络通而收醒神之效，对缺血性脑血管病具有 较好的防治作用(朱晓磊，张娜，李澎涛等.栀子苷阻抑脑缺血损伤级联反应的作用环节探讨 [J].中国中药杂志，2004，29(11)：1065-1068.)。多篇专利文献都详细报道了栀子苷对缺血性脑 血管病的防治作用。如公开号1437973、1437974、1539444、1602893、1460483、1546507等 中国发明专利申请，公开了栀子苷、栀子总环烯醚萜苷以及以栀子苷为主要有效成分的药物 组合物在治疗脑栓塞、脑出血等疾病上的应用；公开号101385796、101361831等中国发明专 利申请，还公开了栀子苷或以栀子苷为主要有效成分的清开灵制剂在预防和治疗血管性痴呆 方面的作用。

栀子苷或栀子总环烯醚萜苷要发挥上述对缺血性脑血管病的治疗作用，必须使损伤脑区 获得有效的药物浓度。但由于血脑屏障(Blood-Brain Barrier，简称BBB)的存在，使得经胃 肠道、肌肉注射等给药途径的制剂无法使栀子苷或栀子总环烯醚萜苷在损伤脑区达到有效的 药物浓度。如何使有效浓度的栀子苷或栀子总环烯醚萜苷通过血脑屏障，顺利到达脑组织内 从而发挥作用，成为栀子苷或栀子总环烯醚萜苷是否能够成功开发出治疗上述脑部疾病新药 的关键。

鼻腔与颅腔在解剖生理上有着独特的联系。嗅神经上皮是中枢神经系统(CNS)与外界直 接相接触的唯一组织。被鼻纤毛覆盖的嗅神经感觉神经元的轴突形成束，能够穿过筛板进入 颅腔，并且与脑内嗅球的僧帽细胞和从细胞(mitral and tufted cells)而形成突触连接，这是 药物从鼻腔吸收人脑的嗅黏膜上皮通路。鼻腔给药后药物分子滞留于嗅部黏膜而易吸收进人 脑脊液，因而可绕过BBB进入CNS，发挥治疗作用。由于上述嗅神经通路和嗅黏膜上皮通 路的存在，使得鼻腔已成为向脑内非侵袭性输送药物的有效途径。

但是栀子苷及栀子总环烯醚萜苷易溶于水，其本身穿透黏膜的能力差；如果以溶液剂形 式直接滴鼻或喷雾入鼻腔，很容易被鼻腔中的酶降解和被鼻纤毛清除，因此，有必要开发出 能够延长栀子苷及栀子总环烯醚萜苷与鼻粘膜接触的时间，提高药物穿透黏膜的能力的鼻腔 给药制剂，从而提高栀子苷及栀子总环烯醚萜苷在脑组织中的浓度，减少栀子苷及栀子总环 烯醚萜苷的流失。

脂质体公认为是潜在的有价值的药物载体，常作为不溶性药物的无毒性载体，更有价值 的是应用于药物的释放或定位，以避开或达到特定组织。

发明内容

本发明的目的是提供一种栀子苷或栀子总环烯醚萜苷的脂质体制剂，该制剂可以延长栀 子苷或栀子总环烯醚萜苷与黏膜的接触时间，通过鼻腔给药有效地提高栀子苷或栀子总环烯 醚萜苷在脑组织的分布。

本发明的另一个目的是提供所述栀子苷或栀子总环烯醚萜苷的脂质体制剂的用途。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

一种栀子苷或栀子总环烯醚萜苷的脂质体制剂，包括山磷脂、胆固醇形成的脂质体和包 载于所述脂质体中的栀子苷或栀子总环烯醚萜苷；磷脂和胆固醇的重量比为3∶1至7∶1，栀子 苷或栀子总环烯醚萜苷与磷脂的重量比为1∶2至1∶6。

优选的是，磷脂和胆固醇的重量比为5∶1；栀子苷或栀子总环烯醚萜苷与磷脂的重量比为 1∶4。

本发明所述磷脂选自卵磷脂、大豆磷脂、蛋黄磷脂或磷脂胆酰碱，优选的是大豆磷脂或 蛋黄磷脂。

本发明所述栀子总环烯醚萜苷中栀子苷的含量不得少于25％，可以通过如下方法制备：

取栀子粗粉，加6倍水煎煮3次，每次30分钟，滤过，合并煎煮液，浓缩至每1ml相当 1g药材的稠膏状，加入乙醇至含醇量40％，放置24小时，取上清液，回收乙醇，再浓缩至 每1ml相当2g药材的稠膏，加入乙醇至含醇量80％，放置24小时，滤过，滤液浓缩至60℃ 相对密度为1.05～1.10的清膏，喷雾干燥，即得。

本发明所述脂质体制剂，还包括防腐剂和/或等渗剂。所述防腐剂选自本领域常用的具有 防腐作用的化合物，如苯扎氯胺、苯扎溴铵、度米酚、三氯叔丁醇、苯甲酸、桂皮醛、山梨 酸、山梨酸钾、尼泊金类、邻羟基苯甲酸、苯甲酸钠、苯甲酚、氯甲酚、紫苏油、硫柳汞中 的一种或几种。所述等渗剂常选择氯化钠。

在临床使用时，可以将本发明所述脂质体制剂装入鼻用吸入装置制成喷雾剂。

本发明还提供所述的栀子苷或栀子总环烯醚萜苷脂质体制剂在制备治疗缺血性脑损伤疾 病中的应用。所述缺血性脑损伤疾病包括缺血性中风及其后遗症、血管性痴呆等。

发明人通过下述实验例证明对于大鼠脑缺血模型，鼻腔给药的治疗效果好于灌胃给药， 与静脉注射相当。因此，非侵入性的鼻腔给药对于缺血性脑损伤疾病的治疗是一条有效的给 药途径，尤其对于缺血性中风后遗症、血管性痴呆等需要长期服药的患者。

实验例1不同给药途径对大鼠脑缺血模型的治疗作用比较

本研究以线栓法复制大鼠脑缺血模型，根据临床上常用的iv、im、ig、ns四种不同给药 途径给予栀子苷，检测其脑含水量、脑梗死而积、血清中SOD、NOS及MDA的含量，比较 其不同给药途径的治疗脑缺血损伤的药效优势。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

雄性大鼠90只，每组15只，体重(260±20)g，由江西中医学院实验动物中心提供，合格 证号：SCXK(赣)2005-0001，实验期间饲以固体饲料，自由饮水。实验前禁食不禁水)。

1.1.2药物及试剂

栀子苷(四川双子叶生物科技有限公司，含量96.2％，批号：syz090911)；鱼线：(4-0号， 自购于渔具商店)；SOD、MDA、NOS试剂盒(购于南昌建成生物有限公司)；水合氯醛(上 海品纯试剂有限公司)；肝索钠(Solarbio试剂公司)；TTC：氯化2，4，5-三苯基四氮唑(中 国医药上海化学试剂公司生产，批号：20030325)；多聚甲醛(色谱纯，江苏汉邦科技有限公 司)；甲醛溶液(油头市西陇化工厂有限公司)；其余试剂(分析纯，市售)；双蒸水(自制)。

1.1.3仪器

SIGMA3-18K型高速冷冻离心机(厦门精艺兴业科技有限公司)；722可见分光光度计(上 海欣茂仪器有限公司)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器有限公司)；漩涡混合器(上 海医科大学仪器厂)；恒温水浴箱(常州国华电器有限公司)；超声清洗器(上海必能信超声有 限公司)；超纯净水发生器(美国Miliipore公司)；微量移液器。

2实验方法

采用线栓法制备脑缺血模型，分别ig、iv、im、ns给予(25mg/mL)栀子苷溶液，选用 脑含水量及脑梗死而积、SOD、MDA、NOS为评价指标，比较其药效，从而筛选合适的给药 途径。

2.1分组及给药

动物随机分为6组，即假手术组、模型组、栀子苷ig、iv、im、ns组、每组大鼠给三次药， 分别是手术前给药一次、术后4小时给第二次、12小时给第三次，24小时后处死大鼠，取脑。

2.2动物模型的制备

2.2.1栓子制备

4～0号直径0.25mm尼龙线，用手术刀片切制成等长(40mm)的线段，此切制方法能使断端 平整无毛刺，酒精浸泡消毒，生理盐水冲洗。将头端3mm涂黑，并在距离前端18mm处作标 记。然后用手术镊夹持线段一端，将线段头端3mm埋于硅胶中(也可将其靠近热源烫钝呈鼓 锤状)。在硅胶凝固前使线段头端3mm表而均匀包裹一薄层硅胶，头端要圆钝，避免形成锐 尖或弯钩。晾干后线栓头端用游标卡尺筛选，取头端直径为0.26-0.30mm的线栓，使用前肝 素浸润。

2.2.2模型的建立

根据改良longa制备^[3]：用10％水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹面向上，剪除颈 部毛发并用碘酊及酒精消毒。取颈正中切口，钝性分离右侧胸锁乳突肌与胸骨舌肌之间的肌 间隙，暴露颈总动脉(CCA)和迷走神经，眼科弯镊挑出CCA，结扎CCA的近心端。向上分 离右侧颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，继续沿ICA向上分离翼腭动脉(PPA)(ICA的第一个 分支)，分离后不结扎。在近CCA分叉处结扎ECA，用小动脉夹夹住CCA的远心端，在此处 放一打好结的丝线，暂时不收紧丝线。在丝线下端用眼科剪剪一小口，将制备好的线栓经该 切口顺CCA插入。收紧丝线以防止其中的栓线滑出和出血，松开动脉夹.沿CCA经ICA将栓 线缓慢送至颅内，(注意观察不可使栓线插入PPA中)遇阻力而止，稍微回撤。以分叉处为标记， 栓线插入长度约为19.0±0.1mm此时栓线头正好位于大脑中动脉(MCA)的起始部位，阻断了 MCA的血流。缝合切口。假手术组只分离CCA、ICA、PPA而不插线结扎。各组动物在手术 中均以白炽灯加热保温，室温控制在25-28℃。在分离动脉过程中要保护沿着颈外动脉、颈总 动脉走行的迷走神经，避免刺激气管。否则会使大鼠呼吸道分泌物增多，严重时窒息死亡。

2.3标本采集

2.3.1神经功能缺陷评分

采用longa的评分方法，缺血24h后评分。评分标准：0分：无神经损伤症状；1分：不能 伸展对侧前肢；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾斜；4分：不能自发行走.意识丧失。0与4 分的动物弃之不用。

2.3.2血清的采集

大鼠10％水合氯醛麻醉后，心脏取血，将血放于100×12mm塑料试管中，直立放置于4℃ 冰箱内2小时，待血液完全凝固后，3000rpm离心15min，分离血清，将血清分成两份转移到 0.5mL 有盖EP管中，-20℃冰箱保存待测。

2.3.3脑梗死而积的测定

缺血24h后，立即断头处死大鼠，剪开颅骨取出大脑用4E的生理盐水冲洗后，置于-20℃低 温冰箱中快速冷冻15分钟后。由前向后每隔2mm切取组织片若干片，置于2％的TTC生理盐 水溶液中保持37℃孵育约30分钟，TTC被线粒体内过氧化氢酶还原，可见脑片中皮质梗死区 不染色而呈现白色，所有未受损脑组织呈红色。先用photoshop软件处理图片，再用Osiris 4 软件算面积。

2.3.4脑组织含水量的测定

快速剥出大鼠脑组织。分别称重，然后置于90-100℃烘箱内烘干至恒重(5天后两次检查 无变化)。分别称量大脑组织干重。按下式计算大脑半球的含水量。含水量(％)＝(湿重-干重) /湿重×100％。

2.4试剂盒的测定

根据试剂盒说明书进行SOD、NOS及MDA试剂盒的操作，并用722可见分光光度计进行 检测。

2.5统计学处理

运用spss16.0for windows软件进行数据统计分析，实验结果以表示，采用one Way-ANOVA、Independent Samples Test进行组间比较，采用Excel 2003作图。

3实验结果

3.1神经学评分

造模缺血24h后采用Longa的评分方法评分，结果显示假手术对照组：0分；造模缺血组： 2-3分；造模组与假手术组及正常组比较有极明显的差异(p＜0.01)。种给药组与模型组比较无 明显差异。说明造模成功。

3.2药效指标考察

栀子苷可降低大鼠脑缺血/再灌注后神经病学评分及梗塞范围，降低脑组织MDA，NOS 含量及升高SOD活性。缺血时NOS诱导大量的NO迅速产生，此NO具有神经毒作用，能引起 细胞和缺血后神经元迟发性损伤的重要因素。结果见表1。

表1不同给药途径的药学指标比较n＝10，

注：^＊p＜0.05与模型组比较具有显著性差异，^＊＊p＜0.01与模型组比较具有极显著性差异；

^△p＜0.05与假手术组比较具有显著性差异，^△△p＜0.01与假手术组比较具有极显著性差异。

4讨论

4.1实验例1对栀子苷在临床上常见的四种给药方式的对脑缺血损伤疾病的药效学进行了研 究。造模后大鼠体重与假手术组大鼠比较明显减轻，说明脑缺血模型对大鼠有损伤，但给药 后的造模大鼠体重减轻与模型组比较有所缓解，体重减轻大小顺序为模型组＞iv组＞im组＞ig 组＞ns组，且ns、im、ig给药与模型组比较存在着极显著性差异，ns给药最明显，故初步认 为鼻腔给药对大鼠脑缺血模型修复能力最强。

4.2大脑脑缺血后梗死部分细胞会坏死及局部会出现水肿，脑含水及脑梗死面积可以宏观评 判脑缺血损伤程度的大小。给予栀子苷后能够修复部分脑组织细胞的活性及减少脑含水量， 其脑梗死面积大小顺序为：模型组＞ig组＞im组＞ns组＞iv组，脑含水大小为：模型组＞ig组＞iv 组＞ns组≈im组，结果可以推测出iv与ns组对于大鼠脑缺血的治疗效果较好。

4.3脑缺血时，血清中MDA、NOS、NO明显上升(均P＜0.01)，SOD明显下降(p＜0.01)， 其发生机理可能为脑缺血再灌注时，大量钙离子内流造成细胞内钙离子超载，激活了NOS， 使NO明显升高。NO通过抑制含铁酶，生成毒性过氧化业硝酰基离子或羟自由基，介导巯

基失活以及影响DNA  的合成而导致死亡；同时，钙离子超载，激活了蛋白水解酶，使细胞 骨架崩解，细胞膜损伤，激活脂酶产生毒性自由基，攻击生物细胞膜，使细胞膜不饱和脂肪 酸发生脂质过氧化反应。MDA作为氧自由基生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代 谢产物，其含量的变化可间接反映组织中氧自由基含量的变化。在脑缺血期间，氧自由基大 量生成，MDA升高，SOD活性会明显下降。本实验结果显示栀子苷具有改善脑缺血损伤的 作用。其含量大小顺序为：SOD ：模型组＜ig组＜im组≈ns组＜iv组；NOS：模型组＞ig组＞im 组＞ns组＞iv组；MDA：模型组＞ig组＞ns组≈im组＞iv组，故可推测出iv给药后对因子的调 节作用最强，故可间接说明其药效最好，其次是ns及im组。

实验例1说明非侵入性的鼻腔给药对于缺血性脑损伤疾病的治疗是一条有效的给药途 径。

栀子苷(Geniposide)纯品为白色粉末，分子式：C₁₇H₂₄O₁₀，分子量：388.366，分子式如 下：

栀子苷在水中极易溶解，溶解度为0.18g·mL^-1，为亲水性化合物，易溶于乙醇、丙酮、 正丁醇等极性有机溶剂，因此其被包含在脂质体囊泡中的水化介质中。

通过本领域公知的方法即可制备本发明所述脂质体，如薄膜分散法、逆相蒸发法、超声 波分散法、高压乳匀法、乙醚注入法、硫酸铵梯度法等。通常过程是：将干脂质膜用水相介 质水化，形成多层囊泡，囊泡在脂质体形成过程中被动地将栀子苷或栀子总环烯醚萜苷包载。 在预实验基础上，优选了PH＝7.0磷酸盐缓冲液(PBS)作为水相介质，所述PBS缓冲液的制 备方法是：

取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L 氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml，即得。

实施例2～13分别描述了采用上述不同方法，以所述PBS缓冲液为水相介质，制备包载 栀子苷或栀子总环烯醚萜苷的脂质体。

实施例14显示了制备的各种脂质体的载药量和粒径。计算载药量的公式中，脂质体的初 始投料量指的是制备脂质体的磷脂和胆固醇的投料量的总和。

栀子总环烯醚萜苷制备方法的研究和优选已经详细地记载在申请号为201010202229.5的 发明专利申请说明书中。

本发明所述的包载栀子苷或栀子总环烯醚萜苷的脂质体能够提高药物在脑组织中的分布 浓度。与灌胃的途径给药相比，本发明所述脂质体能显著提高对大鼠脑水肿的治疗作用，这 一结果也佐证了通过鼻腔给药，脂质体起到了使药物脑靶向分布的作用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1栀子总环烯醚萜苷的制备

取栀子粗粉1kg，加6倍水煎煮3次，每次30分钟，滤过，合并煎煮液，浓缩至稠膏状 1000ml(每1ml相当药材1g)，加入95％乙醇730ml至含醇量40％，放置24小时，取上清 液，回收乙醇，浓缩至无醇味的稠膏500ml(每1ml相当药材2g)，加入95％乙醇2700ml 至含醇量80％，放置24小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(60℃)，干燥，得到 干膏130g，经紫外分光光度法测定栀子苷总环烯醚萜苷的含量为55％，高效液相测定栀子苷 含量为27.4％。

实施例2逆向蒸发法制备栀子苷脂质体

取栀子苷50mg、氯化钠9mg溶于10ml PBS(PH＝7.0)缓冲液中，另取蛋黄磷脂 (EPC)160mg、胆固醇40mg溶于30ml有机相中(氯仿∶异丙醇＝14∶1)，两者混合，水浴超 声8min直至形成稳定的水/油(W/O)型乳剂(水浴温度控制在20℃)，然后于旋转蒸发仪中减 压蒸发除去有机溶剂，达到胶态后滴加1～2ml PBS(PH＝7.0)缓冲液，水化，继续短时减压蒸 发，使成白色脂质体混悬液。加入防腐剂，灌装于鼻腔给药装置中即得。

实施例3逆向蒸发法制备栀子总环烯醚萜苷脂质体

取实施例1制备的栀子总环烯醚萜苷50mg、氯化钠9mg溶于10ml PBS(PH＝7.0)缓冲液 中，另取大豆磷脂(SPC)100mg、胆固醇50mg溶于30ml有机相中(氯仿∶异丙醇＝14∶1)， 两者混合，水浴超声8min，得到白色乳剂，旋转蒸发仪上水浴蒸发有机溶剂(使成凝胶状)， 滴加少量PBS(PH＝7.0)缓冲液，水化，继续短时减压蒸发，使成脂质体混悬液。加入防腐剂， 灌装于鼻腔给药装置中即得。

实施例4薄膜分散法制备栀子苷脂质体

取大豆磷脂(SPC)100mg、胆固醇50mg溶于30ml有机相中(氯仿∶异丙醇＝14∶1)，然 后将有机相在烧瓶中旋转蒸发，使在烧瓶内壁上形成薄膜，取栀子苷50mg、氯化钠9mg溶 于10mlPBS(PH＝7.0)缓冲液中为水相，混合，不断振摇或搅拌即可得栀子苷脂质体混悬液。 加入防腐剂，灌装于鼻腔给药装置中即得。

实施例5薄膜分散法制备栀子总环烯醚萜苷脂质体

取卵磷脂(EPC)160mg、胆固醇40mg溶于30ml有机相中(氯仿∶异丙醇＝14∶1)，然后 将有机相在烧瓶中旋转蒸发，使在烧瓶内壁上形成薄膜，取栀子总环烯醚萜苷50mg、氯化钠 9mg溶于10mlPBS(PH＝7.0)缓冲液中为水相，混合，不断振摇或搅拌即可得栀子总环烯醚萜 苷脂质体混悬液。加入防腐剂，灌装于鼻腔给药装置中即得。

实施例6超声波分散法制备栀子苷脂质体

取卵磷脂(EPC)160mg、胆固醇40mg溶于30ml有机相中(氯仿∶异丙醇＝14∶1)， 然后将有机相在烧瓶中旋转蒸发，使在烧瓶内壁上形成薄膜，加入栀子苷50mg及氯化钠9mg 溶于10ml PBS(PH＝7.0)缓冲液中为水相，水化，使脂质膜溶于水相，超声5min，即可得栀 子苷脂质体混悬液。加入防腐剂，灌装于鼻腔给药装置中即得。

实施例7超声波分散法制备栀子总环烯醚萜苷脂质体

取大豆磷脂(SPC)100mg、胆固醇50mg溶于30ml有机相中(氯仿∶异丙醇＝14∶1)，然 后将有机相在烧瓶中旋转蒸发，使在烧瓶内壁上形成薄膜，加入栀子总环烯醚萜苷50mg及 氯化钠9mg溶于PBS10ml(PH＝7.0)缓冲液中为水相，水化，使脂质膜溶于水相，超声5min， 即可得栀子总环烯醚萜苷脂质体混悬液。加入防腐剂，灌装于鼻腔给药装置中即得。

实施例8高压乳匀法制备栀子苷脂质体

取栀子苷50mg、氯化钠9mg溶于10mlPBS(PH＝7.0)缓冲液中，另取大豆磷脂(SPC) 100mg、胆固醇50mg溶于30ml有机相中(氯仿∶异丙醇＝14∶1)，两者混合，水浴超声成 初乳，再经微射流或高压均质机乳化、分散得栀子苷脂质体混悬液。加入防腐剂，灌装于鼻 腔给药装置中即得。

实施例9高压乳匀法制备栀子总环烯醚萜苷脂质体

取栀子总环烯醚萜苷50mg、氯化钠9mg溶于10mlPBS(PH＝7.0)缓冲液中，另取卵磷脂 (EPC)160mg、胆固醇40mg溶于30ml有机相中(氯仿∶异丙醇＝14∶1)，两者混合，水浴 超声成初乳，再经微射流或高压均质机乳化、分散得栀子总环烯醚萜苷脂质体混悬液。加入 防腐剂，灌装于鼻腔给药装置中即得。

实施例10乙醚注入法制备栀子苷脂质体

称取卵磷脂(EPC)100mg，胆固醇25mg溶于15ml乙醚中，栀子苷25mg及氯化钠4.5mg 溶于的PBS(pH＝7.0)缓冲液5ml，保持恒温45℃在不断搅拌下将上述栀子苷的PBS溶液用5 号针头注射器匀速注入乙醚溶液中，继续搅拌2h直到乙醚挥尽，即得栀子苷脂质体混悬液。 加入防腐剂，灌装于鼻腔给药装置中即得。

实施例11乙醚注入法制备栀子总环烯醚萜苷脂质体

称取大豆磷脂(SPC)100mg，胆固醇25mg溶于15ml乙醚中，栀子总环烯醚萜苷25mg及 氯化钠4.5mg溶于的PBS(pH＝7.0)缓冲液5ml，保持恒温45℃在不断搅拌下将上述栀子总环 烯醚萜苷的PBS溶液用5号针头注射器匀速注入乙醚溶液中，继续搅拌2h直到乙醚挥尽， 即得栀子总环烯醚萜苷脂质体混悬液。加入防腐剂，灌装于鼻腔给药装置中即得。

实施例12硫酸铵梯度法制备栀子苷脂质体

取大豆磷脂(SPC)100mg，胆固醇25mg，加入十八胺，溶于30ml氯仿中，旋转蒸发成 均匀薄膜，加入5％硫酸铵溶液超声使膜脱落，再于45℃水浴孵化30min，将空白脂质体装 于透析袋中用0.9％氯化钠溶液透析，透析后的脂质体中加入5％栀子苷的PBS(pH＝7.0)缓冲 液10ml，摇匀，于37℃水浴锅中保温20min，加入防腐剂，灌装于鼻腔给药装置中即得。

实施例13硫酸铵梯度法制备栀子总环烯醚萜苷脂质体

取卵磷脂(EPC)100mg，胆固醇25mg，加入十八胺，溶于30ml氯仿中，旋转蒸发成均匀 薄膜加入5％硫酸铵溶液超声使膜脱落，再于45℃水浴孵化30min，将空白脂质体装于透析 袋中用0.9％氯化钠溶液透析，透析后的脂质体中加入5％栀子总环烯醚萜苷的PBS(pH＝7.0) 缓冲液10ml，摇匀，于37℃水浴锅中保温20min，加入防腐剂，灌装于鼻腔给药装置中即 得。

实施例14脂质体的评价

14.1载药量的测定

高效液相法测定脂质体载药量

色谱条件：按2005年版《中国药典》中栀子药材的栀子苷含量测定方法，色谱柱： TSK-GEL，ODS-100S(4.6mm×150mm，5μm)，流动相∶乙腈-水(15∶85)，流速： 1.0mL·min^-1，检测波长：238nm，柱温：25℃，进样量：20μL。

对照品溶液的制备：精密称取栀子苷对照品1.29mg加甲醇溶解，稀释定容至 50mL，制成25.8μg·mL^-1的对照品溶液，即得。

供试品溶液的制备：将上述实施例2～13任一实施例制备的脂质体混悬液定容到 25mL，于冷冻离心机上4℃离心10min，转速13000r/min，所得沉淀为栀子苷脂质 体，未包封的栀子苷存在于上清液中。将上清液用水定容转移于100ml定容瓶中，并 稀释10倍，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入色谱柱，测定峰 面积，计算供试品中栀子苷的含量。

按照下式计算脂质体的载药量，结果见表2：

其中，W₁表示栀子苷的初始投料量，

W₂表示未包封的栀子苷的量，

W₃表示脂质体的初始投料量。

14.2脂质体的粒径测定

取上述实施例2～13任一实施例制备的脂质体适量，用0.9％氯化钠稀释后，于流 变仪上测其粘度，再用马尔文纳米粒度仪测定脂质体的平均粒径，结果见表2。

表2脂质体评价结果

表2表明，上述脂质体的优选处方制备的栀子苷脂质体载药量均＞15％，粒径分布 较窄，其各项指标均比较理想。