人类非梗阻性无精子症相关的精浆微小核糖核酸标志物及其应用

摘要

本发明属于基因工程及生殖医学领域，公开了人类非梗阻性无精子症相关的精浆微小核糖核酸标志物及其应用。该标志物选自hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*中的多种。该标志物对非梗阻性无精子症具有特异性和敏感性，可用于制备非梗阻性无精子症诊断或监测的试剂，可避免侵入性诊断，可反复检测，且易于动态监测精子生成障碍的程度。

说明书

发明领域

本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及人类非梗阻性无精子症相关的精浆微 小核糖核酸(microRNA，miRNA)标志物及其应用。

背景技术

不孕不育是一类常见的生殖疾病，在我国育龄夫妇中的发病率约为10％。其中有 近一半与男方因素有关，由此被称为男性不育。在所有导致男性不育病因中，精子生 成障碍是最为常见的病因，也是我国成年男性生殖健康面临的最主要威胁之一。精子 生成障碍的发生是一个多因素、多阶段的过程，主要临床表现为射出精液中精子密度 的降低，按WHO标准可分为少精子症、无精子症等(WHO定义无精子症：显微镜 检未见精子的标本，经3000g离心15min，仍无精子)。目前，对于精子生成障碍程 度的评估主要依靠常规的精子密度判别(人工计数或利用计算机辅助系统分析，即 CASA)，尚无其他有效的手段。而常规的精子密度分析也存在以下缺点：个体精液 质量波动较大，尤其易受到禁欲天数、温度、采集精液方法等因素的影响，从而造成 精子密度测量不准确；无法及时反映治疗后的结果，且不易进行动态监测，对相应疾 病的早期诊断效果也远不能满足需要；而作为男性不育的最重要表现之一的非梗阻性 无精子症，其明确诊断常需进行睾丸穿刺活检，这给寻求生育帮助的人群带来极大的 痛苦。

尽管目前国内外研究者正努力探索非梗阻性无精子症的新型评估和监测生物标 志物，并对现有评估手段进行有效的补充，但一直难以突破传统生物标志物发展和男 性生殖实际应用中的瓶颈，即有创穿刺活检、精液质量分析结果波动、以及早期诊断 /动态监测困难。

综上所述，由于非梗阻性无精子症起病比较隐匿，现有诊疗手段还存在一些不足， 发现、应用新的诊断、监测生物标志物是本领域亟待解决的问题。另外，非梗阻性无 精子症的病因还不清楚，尚缺乏有效的治疗手段，大多数精子生成障碍病人只能选择 ICSI或AID等辅助生育手段，无法满足心理上的要求，并有可能出现后代的遗传缺陷。 并且，有创伤的无精子症确诊手段可对患者的生理和心理造成影响。这都要求我们寻找 到灵敏、特异、易于检测的标志物，这些新的标志物及其指标变化也可以作为相应疾病 药物筛选、药效评价及靶向治疗的新途径。

微小核糖核酸(microRNA，即miRNA)是近年刚刚兴起的研究热点，它是一类 长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，可 在转录后水平对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、 组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在 着紧密的联系。自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA已逐渐 成为调控mRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，分别在2002年和2003年两度入选 Science杂志年度十大科技突破。现在预测miRNA至少能调控5300个人类基因，也 就是所有基因的30％。随着研究的深入，越来越多的miRNA被发现。目前，miRNA 与肿瘤的关系已成为研究的重点，已发现若干miRNA通过负调控基因的表达与慢性淋 巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。然而，miRNA与男性生殖尤其是 精液质量的关系研究仍十分罕见，目前仅有极少量动物实验结果，而未见人类精浆 miRNA水平的研究。

最新的研究成果发现血清/血浆中存在上百种的miRNA，性质稳定、含量丰富、 易于定量检测，且存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血清miRNA 的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。这一发现令人振奋，血清miRNA作为一 类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓 了生物标志物的新境界。该研究迅速引起国际媒体的广泛关注，路透社、合众社、《科 学的美国人》、美国《技术评论》等都对该研究成果进行了专门报道，《Nature》杂志 也在其网站首页的“最新研究进展”专栏中展示了这一最新研究进展。然而同样作为 体液的精浆还未得到相应的关注，若能发现稳定的与精子生成障碍相关的特异精浆 miRNA作为生物标志物，并研发相应疾病的诊断、监测试剂盒，不仅在该领域处于国 际领先地位，可创造令人瞩目的经济效益，对我国男性生殖健康也将是一次强有力的 推动。

目前，对精子生成障碍程度的评估多局限于常规精液分析，易出现结果的波动， 且难以早期诊断和动态监测，对于无精子症的确诊还有赖于睾丸穿刺活检。迄今为止， 还未见关于精浆miRNA用于精液质量和男性生殖功能的评价与治疗方面的任何报道， 尤其是精浆miRNA在人类非梗阻性无精子症的评价与诊疗方面。

发明内容

本发明的目的是提供人类非梗阻性无精子症相关的精浆microRNA标志物。

本发明的另一个目的是提供上述精浆microRNA标志物的引物。

本发明还有一个目的是提供含有上述精浆microRNA标志物或其引物的应用。

本发明再有一个目的是提供含有上述精浆microRNA标志物或其引物的人类非梗 阻性无精子症诊断或监测试剂盒。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

人类非梗阻性无精子症相关的精浆microRNA标志物，选自hsa-miR-141、 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*中的多种。

所述的精浆microRNA标志物，由hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p 和hsa-miR-7-1*构成。

所述的精浆microRNA标志物，其中hsa-miR-141的序列为SEQ ID No.1， hsa-miR-193a-5p的序列为SEQ ID No.2，hsa-miR-590-5p的序列为SEQ ID No.3， hsa-miR-7-1*的序列为SEQ ID No.4。

所述的精浆microRNA标志物的引物，其中序列为SEQ ID No.1的标志物的上游引 物为SEQ ID No.5，下游引物为SEQ ID No.6；序列为SEQ ID No.2的标志物的上游引 物为SEQ ID No.7，下游引物为SEQ ID No.8；序列为SEQ ID No.3的标志物的上游引 物为SEQ ID No.9，下游引物为SEQ ID No.10；序列为SEQ ID No.4的标志物的上游引 物为SEQ ID No.11，下游引物为SEQ ID No.12。

所述的精浆microRNA标志物或其引物在制备人类非梗阻性无精子症诊断或监测试 剂中的应用。所述试剂是指能够测定这些精浆microRNA标志物在精浆中表达量的试 剂。

一种人类非梗阻性无精子症诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述精浆microRNA 标志物(hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*中的多种)的 引物。

所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述引物(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6， SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，SEQ ID No.9和SEQ ID No.10，以及SEQ ID No.11和SEQ  ID No.12)中的多对。

所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，SEQ ID  No.7和SEQ ID No.8，SEQ ID No.9和SEQ ID No.10，以及SEQ ID No.11和SEQ ID  No.12。

试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。

更进一步，本发明所述的无精子症为人类男性原发性且病因不明的非梗阻性无精 子症，即所选非梗阻性无精子症样本排除了感染、药物、内分泌、梗阻等导致精子生 成障碍的因素。

本发明详细描述如下：

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的精液样本，系统收集完整的人 群基础信息和临床资料，并采用了RT-PCR方法、Taqman miRNA Array、Real-time PCR (Taqman探针和染料法)方法的一种或几种进行检测。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

一、研究对象选择和分组依据

A组：健康生育男性对照组(n＝80，20人芯片筛选，20人一期验证，40人独立 人群验证)：

1.年龄在24至34岁间；

2.无生殖和内分泌系统疾病；

3.无其它全身性疾病；

4.性功能正常；

5.精液质量正常；

6.一年内有正常生育史。

B组：非梗阻性无精子症组(n＝80，20人芯片筛选，20人一期验证，40人独立 人群验证)：

1.年龄在24至34岁间；

2.男性不育一年以上；

3.除无精子外无其他生殖和内分泌系统疾病；

4.无其它全身性疾病；

5.性功能正常；

6.一次射精精液经离心无精子，排除梗阻性病因；

7.重复精液质量检测/睾丸穿刺活检，确诊为无精子症。

二、精浆精子分离及前处理

1.从-70℃冰箱取出冷冻精液后，将精液在37℃水浴使精液完全融解，15000转 离心10min，取上清500μl至一洁净1.5ml EP管中。

2.向EP管中加入500μl Trizol，12000转离心30min，立即取上清至一洁净1.5ml EP管中。

3.向EP管中加入500μl三氯甲烷，12000转离心15min，取上清至一洁净1.5ml EP管中。

4.重复步骤(2)、(3)两次，离心均为12000转15min。

5.-20℃保存处理后的样本。

三、Taqman miRNA array筛选

1.取经过前处理的精浆，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。

按下表所示配制反转录体系：

2.将PCR管反复颠倒混匀6次后做简短离心，冰上放置5分钟。

3.将PCR管放入PCR仪进行反转录，反应条件如下表所示：

反转录产物保存于4℃冰箱以用于下一步的预扩增。

4.逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：

预扩增的反应条件如下表所示：

降至4℃后，将预扩增产物保存于4℃冰箱以用于下一步的Real-time PCR反应。

5.将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH 8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离 心。预扩增产物可以直接用于下面的Real-time PCR。

预扩增产物进行Real-time PCR按下表所示配制反应体系：

考虑到吸液损失而放量12.5％。

6.检测并比较健康生育男性对照、无精子症人群精浆样本中miRNAs表达谱的 差异，筛选出有4倍差异以上的miRNAs。经生物信息学分析和动物实验结果， 选定其中12条成为候选并进行进一步验证，具体为：hsa-miR-141、 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-19b、hsa-miR-20a、hsa-miR-374a、hsa-miR-429、 hsa-miR-548c-3p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-141*、hsa-miR-7-1*、 hsa-miR-499-5p、hsa-miR-572。

四、Real-time PCR方法验证精浆miRNAs表达量

1.设计12条目标miRNAs的引物：运用Stem-loop PCR方法设计引物。

2.加入荧光染料进行Real-time PCR反应。检测并比较健康生育男性对照、无精 子症人群精浆样本中miRNAs表达量的差异(病例对照各20人)。

排除表达量达不到Real-time PCR检测水平的hsa-miR-548c-3p和hsa-miR-499-5p， 剩余10条中经验证有8条确认有显著差异，分别是：hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、 hsa-miR-19b、hsa-miR-374a、hsa-miR-429、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*、hsa-miR-572。

3.选择独立人群(对照和病例各40人)进行Real-time PCR检测，结果一致的有 4条miRNAs，具体为：hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*。

因此，最终确认为存在差异表达的健康生育男性对照和无精子症障碍患者精浆 miRNAs包括hsa-miR-141(SEQ ID No.1)、hsa-miR-193a-5p(SEQ ID No.2)、 hsa-miR-590-5p(SEQ ID No.3)、hsa-miR-7-1*(SEQ ID No.4)，具体引物见表1。 其中，SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4在无精子症患者中的拷贝数都显著 高于健康对照组，而SEQ ID No.2在无精子症患者中的拷贝数都显著低于健康对照组， 并且这些miRNAs在精浆中表达具有稳定性。采用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID  No.3、SEQ ID No.4这4个构成的组合可以将对照组、无精子组区分开。虽然这4条单 独也可以分开两组人群，但如果只用1条，可能会有重合，而如果同时使用4条，即 使1条差异不大，但另外3条表达差异都很大，就可以将其带入评分高的组，即可诊 断为非梗阻性无精子症。

四、诊断试剂盒制备方法

根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于精子生成障碍动态监测 的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者精浆中稳定存在且可检测的成熟 hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*的引物和工具。诊断试 剂盒包括一批精浆miRNAs引物，还可以包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液 等试剂。

本发明的有益效果：

本发明人通过分离和比较正常生育健康男性(精液质量正常)和非梗阻性无精子 症男性精浆中的miRNAs，发现了精浆中存在可用于评估是否患有非梗阻性无精子症 的特异性和敏感性(实施例7的ROC曲线提示具有较好的灵敏度，实施例8对其实际 效果进行了验证，即无精子症的均被正确检测识别)的miRNA组合，在非梗阻性无 精子症组中这一组microRNA的表达量均显著区别于正常对照组，因而提出了非梗阻 性无精子症的精浆microRNA标志物组合，以及该精浆microRNA标志物或其引物在 制备非梗阻性无精子症诊断或监测试剂中的应用，研制出可便于临床应用的非梗阻性 无精子症诊断、监测试剂盒。

本发明采用精浆miRNA作为非梗阻性无精子症评价的标志物的优越性在于：

(1)精浆miRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微 创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA 生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为男性生殖疾病的 防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)本发明提供的精浆miRNA标志物可用于无精子症评估和动态监测，可避免侵 入性诊断(只需少量精浆，无需穿刺)，可反复检测，且易于动态监测，为临床医生快 速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支 持，延缓和阻止疾病进展，并实时观测治疗效果。

(3)本发明采用符合非梗阻性无精子症和正常健康对照的样本进行验证，证明这 几种标志物表达量存在显著性差异并具有稳定性，以说明该标志物具有特异性，可作 为标志物使用。

(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选数百种精 浆miRNAs，应用Real-time PCR等方法在进行二次验证和独立人群验证，采用分层评 分系统对诊断结果进行标化，并在另一组独立人群中对精浆miRNA标志物和诊断试剂 盒进行盲法评价，保证了该精浆miRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。

附图说明

图1光镜下精子计数图(CASA分析，Group A：健康生育男性对照组、Group B： 非梗阻性无精子症组)。

图2显示以hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*这四个 miRNAs作为标志物时对Group A：健康生育男性对照组和Group B：非梗阻性无精子 症组进行区分的结果。

图3个体精浆hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*这四 条miRNAs表达水平波动性分析。

图4正常对照组和非梗阻性无精子组之间的ROC曲线。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1 研究对象选择和分组依据

本发明人于2006年9月到2008年9月间从南京医科大学第一附属医院和南京医 科大学附属南京市妇幼保健院搜集符合要求的成年男性的精液样品，通过对样品资料 的整理，从中选择了符合要求的80例健康生育男性对照(平均年龄：29.32±3.13)、 80例非梗阻性无精子症患者(平均年龄：28.76±4.07)作为Real-time PCR检测miRNA 表达的实验对象(图1)。具体的样品归类标准如下：

A组：健康生育男性对照组(n＝80，20人芯片筛选，20人一期验证，40人独立 人群验证)：

1.年龄在24至34岁间；

2.无生殖和内分泌系统疾病；

3.无其它全身性疾病；

4.性功能正常；

5.精液质量正常；

6.一年内有正常生育史。

B组：无精子症组(n＝80，20人芯片筛选，20人一期验证，40人独立人群验证)：

1.年龄在24至34岁间；

2.男性不育一年以上；

3.除无精子外无其他生殖和内分泌系统疾病；

4.无其它全身性疾病；

5.性功能正常；

6.一次射精精液经离心无精子，排除梗阻性病因；

7.重复精液质量检测/睾丸穿刺活检，确诊为无精子症。

实施例2 研究对象精液采集和精液质量常规分析

在至少禁欲2天后，研究对象被要求在房间内通过手淫将精液收集到一个无菌宽口 的塑料容器中。精样在37℃温育液化约30分钟后，我们按照WHO人类精液分析实验室 手册(World Health Organization，1999)进行了精液常规分析，包括精液容积、精子浓 度、一次射精总数、精子活动力、精子运动性和前向性参数等，主要使用μ-cell板和计 算机辅助精液分析系统(CASA，WLJY 9000，Weili New Century Science & Tech Dev.)。 活动精子率为WHO标准的“A”级精子(37℃下快速前进，速率≥25μm/sec)加上“B” 级精子(缓慢前进，速率在5μm/sec和25μm/sec之间)，而排除“C”级精子(不前进， 速率＜5μm/sec)和“D”级精子(不运动)。9项CASA参数包括：鞭打频率(BCF，Hz)， 精子头侧摆幅度(ALH，μm)，曲线速度(VCL，μm/s)，平均路径速度(VAP，μm/s)，直 线速度(VSL，μm/s)，直线性(LIN，VSL/VCL×100，％)，前向性(STR，VSL/VAP×100，％)， 角标准差(MAD，°)和摆动性(WOB，VAP/VCL，°)。在整个研究过程中均实施严格的 质控。每个样本连续检测两次。所有观察计数均在不清楚样本背景的情况下自动完成以 避免偏倚。WHO的精液参数参考值包括精液容积(2ml)、精子密度(20×10⁶/ml)、一 次射精总数(40×10⁶)和精子活动力(50％motile sperm(活动精子))。显微镜检未 见精子的标本，经3000g离心15min，仍无精子者为无精子症。将精子密度低于 20×10⁶/ml，但非无精子症的男性诊断为少精子症。根据精子密度参考值，将重复精液质 量检测进行确诊，对无精子症者也可采用睾丸穿刺活检加以确诊。

实施例3 Taqman miRNA array筛选

制备cDNA样品：a)取500μl精浆；b)加等体积的Trizol，振荡混匀，4℃， 15000转离心30分钟，取上清；c)加与上清等体积的三氯甲烷震荡混匀，4℃，12000 转离心30分钟，取上清；d)重复步骤b)、c)两次，离心均为12000转20min。取上 清作为RNA样品；e)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包 括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5ul RNA酶抑制剂 (Takara公司)、1ul AMV(Takara公司)以及1.5μl loop环的反转录引物(URP，见 表1)。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；

逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增：

预扩增的反应条件如下表所示：

将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH 8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预 扩增产物可以直接用于下面的实时荧光定量PCR(qPCR)。

预扩增产物进行qPCR按下表所示配制反应体系：

考虑到吸液损失而放量12.5％。

检测并比较健康生育男性对照、无精子症人群精浆样本中miRNAs表达谱的差异， 筛选出有4倍差异以上的miRNAs。经生物信息学分析和动物实验结果，选定其中12 条成为候选并进行进一步验证，具体为：hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-19b、 hsa-miR-20a、hsa-miR-374a、hsa-miR-429、hsa-miR-548c-3p、hsa-miR-590-5p、 hsa-miR-141*、hsa-miR-7-1*、hsa-miR-499-5p、hsa-miR-572。

实施例4 Real-time PCR方法测量精浆miRNA表达量

设计引物(表1)对80例健康生育男性对照、80例非梗阻性无精子症患者的精 浆进行miRNAs的定量Real-time PCR检测。

(1)制备cDNA样品：a)取500μl精浆；b)加等体积的水饱和酚，振荡混匀， 4℃，15000转离心30分钟，取上清；c)加与上清等体积的氯仿震荡混匀，4℃， 12000转离心30分钟，取上清；d)重复步骤b)、c)两次，离心均为12000转20min。 取上清作为RNA样品；e)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体 系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液(Takara公司)、 0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl loop环的反 转录引物(URP，见表1)。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵 育5分钟；

(2)Real-time PCR：染料法：取1μl cDNA，将cDNA倍比稀释，加入0.3μl Taq 酶(Takara公司)，1μl 20×Eva Green，0.25μl 10μM单一miRNA正向引物，0.25μl 10μM 对应反向引物，1.2μl 25mM MgCl₂，1.6μl 2.5mM三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液(Takara 公司)，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水，20μl体系进行荧光定量PCR。10μl TaqMan 通用PCR混合液，6.6μl H₂O，20μl体系进行q-PCR。仪器使用的都是ABI Prism 7300 荧光定量PCR仪，PCR的反应条件都是：95℃5分钟进行1个循环→95℃、15秒， 60℃、1分钟进行40个循环。检测并比较健康生育男性对照、少精子症、无精子症人 群精浆样本中miRNA表达量的变化，各组样品精浆miRNA的表达量比值可用方程 2-ΔG表示，其中ΔG＝C_T group1-C_T group2。为保证各次实验间的可比性，我们在每板上 都设置了U6(内参)，以其表达量作为内参调整计算表达量。

从结果分析得出，hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1* 这四条miRNA在各组间均有显著差别(图2)。

表1 miRNAs的引物序列

  引物名称   对应miRNA引物序列   has-miR-141-F   ACACTCCAGCTGGGTAACACTGTCTGGTAA   has-miR-141-R   CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCATCTTT   has-miR-193a-5P-F   ACACTCCAGCTGGGTGGGTCTTTGCGGGCG   has-miR-193a-5P-R   CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATCTCG   has-miR-590-5P-F   ACACTCCAGCTGGGGAGCTTATTCATAAAA   has-miR-590-5P-R   CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTGCACTT   has-miR-7-1*-F   ACACTCCAGCTGGGCAACAAATCACAGTCT   has-miR-7-1*-R   CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTATGGCAG   U6-F   CTCGCTTCGGCAGCACA   U6-R   AACGCTTCACGAATTTGCGT   URP   TGGTGTCGTGGAGTCG

实施例5 个体精浆miRNA表达量的稳定性分析

采用实施例3的方法对六名成年男性的精浆miRNA水平的稳定性进行评价。和 实施例2同样的采集方法采集研究对象连续三次射出的精液(间隔时间为2周，间隔 期内无疾病发生并保持禁欲)。结果显示，精浆中hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、 hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*这四个miRNA表达水平较稳定(图3)。这些都提示了 个体精浆miRNA的表达量较为稳定，具备作为诊断/监测标志物的特性。

实施例6 miRNA精浆特异性表达分析

采用Real-time PCR方法观察hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、 hsa-miR-7-1*这四个可以作为标志物的miRNAs是否在精浆中特异表达，结果显示 hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*均为在精浆和睾丸中 特异表达，而在外周血中无表达。这四条miRNA具有精浆表达特异性。

实施例7 miRNA组合对非梗阻性无精子症的判断

根据上述Real-time PCR方法，本发明人通过对病例和对照组精浆样品的miRNAs 表达水平的分析，以正常对照组miRNAs表达量的四分位数为阈值，对hsa-miR-141、 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*进行评分，进一步求得总得分，以此 绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这四个miRNAs低表达或高表 达对精子生成状态的评估能力。ROC分析结果显示，hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、 hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*以79.83％的AUC(ROC曲线下面积)将正常对照组和 非梗阻性无精子组分开(图4)。

在上述一系列研究结果的基础上，本发明人证明了采用hsa-miR-141、 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*能够很好地将健康生育男性对照和非 梗阻性无精子症人群分开。

实施例8 miRNA分层评分和独立人群盲法验证

当对hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*这四个标志 物的表达水平进行分层评分时(四分位数分层后累加)，能够对精子生成障碍的程度进 行评估，表述为精子生成障碍程度，积分越高，发生精子生成障碍的风险越高。

表3 四个miRNAs四分位数得分并求和

注：每个miRNA按表达量的四分位数分为四个等级0、1、2、3，最低的0分， 最高的3分，4条miRNA综合可以得分为0～12分，而无精组绝大多数得分很高(表 达量都高，hsa-miR-193a-5p的积分按反向计算)，而正常对照组绝大多数得分很低。 举例来说，如有一个样本评分为12分(最高的分值组)，其精子密度正常的可能性仅 为4.76％，而为非梗阻性无精子症的可能性为95.24％；如有一个样本评分为0分(最 低的分值组)，则其不可能为非梗阻性无精子症，而应为正常精子生成。

针对得出的评估分值(即根据具体得分判断其分组，得高分的归入无精子组， 得低分的归入对照组；比较而言，≥9算高分，≤3算低分)，对另一组独立采集的人 群进行盲法首诊，即采用双盲试验，对独立人群(另一医院采集的40例成年男性)同 时进行精液质量常规分析和精浆样品的miRNA检测，对精子生成情况进行分析对比， 结果显示通过4个miRNA检测评分，可以将不同精子生成状态的人群很好的区分开 (40例随机选择样本中有11例评分较高(≥9分)，其中达到12分(最高分)的有 5例，这5例经穿刺诊断均为非梗阻性无精子症，另外6例评分较高的精子密度均低 于20×10⁶/ml，其余评分较低的精子密度均高于20×10⁶/ml)，提示这几种miRNA可作 为评估精子生成障碍风险的标志物。

实施例9 用于非梗阻性无精子症诊断和监测的miRNA诊断试剂盒的制作

该miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于RT-PCR、Real-time PCR技术。

首先通过测序的方法和Real-time PCR方法确定正常人和精子生成障碍患者精浆 中有一个以上拷贝的miRNA。然后通过定量PCR等技术筛选与精子生成状态相关的 一类精浆miRNA，作为预测是否发生精子生成障碍以及诊断病变程度的指标。最后 筛选出对应的精浆miRNA的数量控制在几条，这是在预实验的基础上做出的最优化 的精简。此试剂盒包括一批精浆miRNA引物(表1)，其中miRNA的引物包括 hsa-miR-141、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-7-1*、U6的正反向引物。 还可以有相关PCR技术常用的试剂，如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl₂、三磷酸碱基 脱氧核苷酸混合液、染料等试剂，这些试剂也可采用相应的市售产品。此试剂盒的价 值在于只需要一次射出精液中极少量的精浆，即可检测精浆miRNA标志物的变化趋 势，再通过该变化趋势预测精子生成障碍发生的可能性或诊断非梗阻性无精子症，并 易于进行动态监测和观察治疗效果。

具体试剂盒组成如下：

引物也可以是以下四对引物中的二对、三对或四对：SEQ ID NO.5和SEQ ID  NO.6，SEQ ID NO.7和SE Q ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10以及SEQ ID  NO.11和SEQ ID NO.12，各10μM 0.25μl。

试剂盒中还可以含有0.3μl Taq酶，1μl 20×Eva Green，1.2μl 25mM MgCl₂，1.6μl 2.5mM dNTP混合液，2μl 10×PCR缓冲液，12.4μl纯水。

试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对(表1)。

或者试剂盒中除正向引物外还含有1μl 10μM对应反向引物，10μl TaqMan通用 PCR混合液，6.6μl H₂O。

试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于microRNA含量检测 的相应试剂。

参考文献：

●World Health Organization.WHO Laboratory Manual for the Examination of Human  Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction.4th edn.Cambridge University Press， Cambridge，UK，1999.

●Characterization of microRNAs in serum：a novel class of biomarkers for diagnosis of  cancer and other diseases.Chen X，Ba Y，Ma L，Cai X，Yin Y，Wang K，Guo J，Zhang Y， Chen J，Guo X，Li Q，Li X，Wang W，Zhang Y，Wang J，Jiang X，Xiang Y，Xu C，Zheng  P，Zhang J，Li R，Zhang H，Shang X，Gong T，Ning G，Wang J，Zen K，Zhang J，Zhang CY.Cell Res.2008Oct；18(10)：997-1006.

●Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.Mitchell PS， Parkin RK，Kroh EM，Fritz BR，Wyman SK，Pogosova-Agadj anyan EL，Peterson A， Noteboom J，O′Briant KC，Allen A，Lin DW，Urban N，Drescher CW，Knudsen B S， Stirewalt DL，Gentleman R，Vessella RL，Nelson PS，Martin DB，Tewari M.Proc Natl  Acad Sci U S A.2008Jul 29；105(30)：10513-8.

●MicroRNA biogenesis is required for mouse primordial germ cell development and  spermatogenesis.Hayashi K，Chuva de Sousa Lopes SM，Kaneda M，Tang F，Hajkova P， Lao K，O′Carroll D，Das PP，Tarakhovsky A，Miska EA，Surani MA.PLoS ONE.2008 Mar 5；3(3)：e1738.

●A microarray for microRNA profiling in mouse testis tissues.Yan N，Lu Y，Sun H，Tao D，Zhang S，Liu W，Ma Y.Reproduction.2007Jul；134(1)：73-9.

●Altered microRNA expression in patients with non-obstructive azoospermia.Lian J， Zhang X，Tian H，Liang N，Wang Y，Liang C，Li X，Sun F.Reprod Biol Endocrinol. 2009 Feb 11；7(1)：13.