非梗阻性无精子症患者接受供精人工授精治疗的影响因素分析及精浆分子标记物研究

摘要

目的:回顾性分析非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia，NOA)患者的3880个供精人工授精(artificial insemination with donor sperm，AID)治疗周期，探讨可能影响AID临床妊娠率的相关因素，以期进一步提高AID助孕技术的成功率。对这些NOA患者的精浆miRNAs表达谱进行分析，筛选与NOA相关的精浆分子标记物，为NOA的诊断和治疗手段的选择提供思路。
　　方法:1.回顾性分析2010年1月至2016年12月因男方NOA于国家卫计委科研所计划生育生殖健康技术服务中心接受AID手术治疗的患者2030例，共3880个治疗周期。探讨AID临床妊娠率与女方年龄、不孕年限、不孕类型、治疗周期数、治疗方案、手术方式、精液参数等因素的关系。首先采用单因素Logistic回归计算各变量比值比(OR)和95％置信区间(95％CI)，再将单因素分析有统计学意义的相关变量纳入到多因素Logistic回归模型中，探讨可能影响AID妊娠结局的因素。2.针对有病理分型的部分接受AID治疗的NOA患者，按照睾丸病理组织类型分为唯支持细胞综合征(sertoli cell only syndrome，SCOS)组和生精阻滞(spermatogenesis arrest，SA)组，以1年内配偶怀孕并正常分娩的男性作为正常对照组，样本数分别为SCOS组7例，SA组6例和正常对照组3例。利用Illumina HiSeq X10高通量测序平台对各组精浆miRNAs的表达谱进行测序分析，获得不同睾丸病理组织类型NOA患者的精浆miRNAs表达谱，并对全部miRNAs的靶基因进行预测，对组间差异显著的miRNAs的靶基因进行功能注释和富集分析。3.使用qRT-PCR方法检测miR-34c-5p和miR-202-3p这两个与精子发生相关的睾丸特异性差异miRNAs在接受AID治疗的NOA患者精浆中的表达，SCOS组、SA组和正常对照组每组各10例样本。4.使用qRT-PCR方法对预测的富集在NOTCH信号通路上的差异miNRAs的靶基因Hes5在接受AID治疗的NOA患者精浆中的表达进行检测，SCOS组、SA组和正常对照组每组各5例样本。
　　结果:AID临床妊娠915人，累积临床妊娠率45.1％，周期临床妊娠率23.58％，流产96人(10.5％)，单胎妊娠781人(85.4％），多胎妊娠38人(4.1％)，截止2016年12月的分娩数为683个，其中活婴分娩数680个(99.56％)，出生缺陷4例(0.59％)。AID临床妊娠率影响因素分析:(1)年龄与妊娠率呈负相关;(2)继发不孕妇女妊娠的几率比原发不孕妇女高;(3)手术方式为1次宫颈管内人工授精(ICI)的妊娠率最低，其他三种手术方式妊娠率与1次ICI相比差异有统计学意义;(4)促排并不增加AID妊娠率但会增加多胎率;(5)AID治疗周期数、不孕年限、前向运动精子总数(processed total motile sperm count，PTMS)和精子浓度等精液参数与AID妊娠率没有统计学相关性;NOA患者精浆分子标记物研究:(1)不同睾丸病理组织类型NOA患者的精浆miRNAs表达差异研究:①所有样品共预测出3107个miRNAs，其中已知miRNAs1667个，新预测miRNAs1440个;②miRNAs差异表达分析结果显示与正常对照组相比，SCOS组有78种差异表达的miRNAs，其中4种miRNAs表达上调，74种miRNAs表达下调;SA组有35种差异表达的miRNAs，其中3种miRNAs表达上调，32种miRNAs表达下调;SCOS组精浆miRNAs表达谱与SA组相比，9种miRNAs表达上调，没有下调的差异miRNAs;③聚类分析结果显示不同组间精浆miRNAs表达谱可以明显区分;④全部miRNAs共预测到19669个靶基因，有19651个获得注释信息。对这些注释的靶基因行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，发现受差异miRNAs调控的靶基因参与的代谢通路中富集程度最高的是NOTCH信号通路。(2)精浆差异miRNAs的验证及NOA可能分子机制探讨:qRT-PCR结果显示miR-34c-5p和miR-202-3p这两个睾丸特异性差异miRNAs在NOA的两组精浆中的相对表达量均显著低于正常对照组，且SCOS组精浆中的表达量比SA组低，差异有统计学意义(P＜0.05);NOTCH信号通路上的差异miRNAs靶基因Hes5在SA组精浆中的相对表达量显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　结论:AID是一种安全、有效的助孕方式。女方年龄是影响AID临床妊娠率的最重要因素;不孕类型、手术方式也是AID临床妊娠率的重要影响因素;促排卵并不增加AID妊娠率，但会增加多胎妊娠的风险;IUI处理前、处理后前向运动精子总数和精子浓度与AID临床妊娠率无统计学意义;精液常规分析合格的供精者精液实际的临床累积妊娠率却有明显差异。不同睾丸病理组织类型NOA患者的精浆miRNAs表达谱不同;多个差异miRNAs的靶基因富集在NOTCH信号通路上，靶基因Hes5在NOA患者精浆中的表达明显升高;精浆miR-34c-5p和miR-202-3p的表达丰度在正常生育力男性和不同睾丸病理组织类型NOA患者中差异明显，可能成为评价NOA的潜在分子靶标。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 供精人工授精临床妊娠率影响因素分析

第一节 资料与方法

一、研究对象

二、研究方法

三、统计学分析

四、仪器和药物、试剂

一、患者基本情况

二、女方因素与妊娠情况

三、精液参数与妊娠情况

四、AID妊娠率影响因素的logistic回归分析

五、915个妊娠周期妊娠结局分析

第三节 讨论

一、女方年龄对AID临床妊娠率的影响

二、不孕年限对AID临床妊娠率的影响

三、不孕类型对AID临床妊娠率的影响

四、治疗周期数对AID临床妊娠率的影响

五、治疗方案对AID临床妊娠率的影响

六、手术方式对AID临床妊娠率的影响

七、妊娠结局分析

八、妊娠结局与精液参数的相关性

参考文献

研究小结

第二章 不同睾丸病理组织类型NOA患者的精浆miRNA表达谱研究

第一节 材料与方法

一、研究对象

二、研究方法

三、实验仪器与试剂

第二节 结果

第三节 讨论

参考文献

第三章 精浆差异miRNAs的验证及NOA分子机制探讨

一、研究对象

二、研究方法

三、仪器与试剂

第二节 结果

一、差异miRNA的qRT-PCR验证结果

二、差异miRNA靶基因在精浆中的表达

第三节 讨论

参考文献

研究小结

结论与展望

综述：人类受精相关精子功能蛋白质研究进展

附录

研究生期间发表论文情况

主要缩略词对照表

个人简历

致谢

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