酰化黄酮苷化合物及其在制备补体抑制剂药物中的应用

摘要

本发明公开了酰化黄酮苷化合物I及其在制备补体抑制剂药物中的应用。本发明从鼠曲草中提取分离得到酰化黄酮苷，经体外实验证实在对补体系统的经典途径激活所引发的细胞溶血有抑制，说明具有抗补体作用，各单体化合物的活性均要强于鼠曲草总提物的活性，是一类很好的补体抑制剂，且有效浓度低，可作为活性成分，制备新型抗补体药物，用于补体非正常激活引起的各种疾病，其毒性低，用药安全，原料来源丰富，有较大的临床应用价值。式I的结构：

说明书

技术领域

本发明涉及补体抑制剂药物，具体涉及酰化黄酮苷化合物及其在制备抗补体 药物中的应用。

背景技术

补体系统是人体重要的免疫防御系统之一。在正常的生理条件下，补体的功 能主要是攻击外来病原和清除免疫复合物，并维持机体平衡。然而补体系统的非 正常激活会引起人体免疫系统的过度反应，导致人体自身正常组织的损伤和炎症 反应，是自身免疫性炎症反应的重要介质。越来越多的证据表明，炎症疾病的发 生、发展同补体的激活有关。因此，如何干扰和抑制补体活化产生的损伤，成为 药理学研究的焦点之一。

目前已证明，类风湿性关节炎、脑卒中、肾炎、系统性红斑狼疮、老年性痴 呆、缺血性再灌注、急性心肌梗死、急性呼吸窘迫综合症等多种疾病均与补体的 过度激活相关。多种补体抑制剂正在研究中，在美国已有补体受体(CR)和抗C5a 的单克隆抗体应用于临床，取得较好的疗效。但这些系统性补体抑制剂虽然改善 了炎症反应，由于补体系统在机体内具有重要的防御作用，同时产生全身性补体 抑制，因此，长期应用会降低机体的防御能力，产生多种并发症，也造成感染等 潜在的副作用。为了充分发挥补体抑制剂的疗效，降低不良反应，人们正在积极 探索天然产物中高效低毒的新型补体抑制剂。

近年来天然产物中抗补体活性成分的研究进展，不难看出从天然产物中分出 了多种结构类型的抗补体活性成分，主要有黄酮、多糖和萜类化合物，其中酰化 黄酮苷对补体系统具有显著的抑制作用，并且在天然植物中分布广泛，在菊科植 物贝加尔鼠曲草(Gnaphalium uliginosum)(Phytochemistry Letters，2010，3：45-47)、 蓼科植物酸模叶蓼(Persicaria lapathifolia)(Chem.Pharm.Bull.1999， 47(10)：1484-1486)、木兰科植物望春花(Magnolia fargesii)(Biol.Pharm.Bull.1998， 21(10)：1077-1078)、豆科植物驴食草(Onobrychis viciifolia)(Phytochemistry，2011， 72：423-429)和肯特基香槐(Cladrastis kentukea)(Phytochemistry，2011，72：372-384) 以及松科植物大果青杆(Picea neoveitchii)(Phytochemistry，2011，72：490-494)等植 物中均有分布。这类化合物具有抗真菌、细胞毒等药理作用，但至今未见黄酮苷 元-4′-糖-芳环结构或黄酮苷元-7-糖-芳环结构的酰化黄酮苷抗补体及其制备补体 抑制性药物的报道。

本发明人曾研究报道了鼠曲草提取物用于制药(中国专利申请号： 201110059384.0)，现进一步研究发现从鼠曲草中分离得到的单体新化合物酰化 黄酮苷有显著的抗补体活性，而且各单体化合物的活性均要强于鼠曲草总提物的 活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计新的酰化黄酮 苷制备补体抑制性药物。

本发明提供了一种酰化黄酮苷化合物在制备抗补体药物中的应用。

所述酰化黄酮苷化合物具有式I的化学结构：

式I

其中R₁，R₂可相同或不同，可分别为H、OH或OCH₃；

R₃，R₄不同，可分别为H或为下列基团：

本发明所优选的酰化黄酮苷化合物包括下列化合物：

芹菜素-4′-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖苷1；

木犀草素-4′-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖苷2；

槲皮素-4′-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖苷3；

芹菜素-7-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖4。

其中化合物1，2，3为从鼠曲草中分离得到的新化合物。

上述化合物通过HR-ESI-MS、IR、¹H-NMR(DMSO-d₆，600MHz)、¹³C-NMR (DMSO-d₆，150MHz)等检测，确证了他们的结构。

本发明所述的酰化黄酮苷化合物，经过体外试验，证实能抑制补体经典途径 激活引起的细胞溶血，有显著的抗补体活性，各单体化合物的活性均要强于鼠曲 草总提物的活性，因而，可用于制备抗补体药物。

本发明的上述化合物从鼠曲草中分离得到，通过下述方法制备：

鼠曲草全草25kg粉碎，80％乙醇热回流提取3次，得浸膏后分步萃取，得 到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水液四个部分。乙酸乙酯部位经硅胶(100～200 目)柱色谱，以二氯甲烷∶甲醇(70∶1，50∶1，30∶1，20∶1，10∶1，5∶1，3∶1，1∶1)梯度洗脱， 收集二氯甲烷∶甲醇(10∶1)洗脱流份进行反复硅胶柱色谱、反相柱色谱纯化，分离 得到化合物1、2、3、4。

本发明使用的鼠曲草通过市售得到。

本发明所述的药物是由式I化合物作为活性成分与药用载体组成的药物组 合物。

本发明所述的药物是由芹菜素-4′-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖苷1作为活 性成分与药用载体组成的药物组合物。

本发明所述的药物是由木犀草素-4′-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖苷2作为 活性成分与药用载体组成的药物组合物。

本发明所述的药物是由槲皮素-4′-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖苷3作为活 性成分与药用载体组成的药物组合物。

本发明所述的药物是由芹菜素-7-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖4作为活性 成分与药用载体组成的药物组合物。

本发明的药物组合物具有显著的抗补体活性，可用于补体非正常激活引起的 各种疾病。

本发明所述的酰化黄酮苷，有显著的抗补体活性，各单体化合物的活性均要 强于鼠曲草总提物的活性，是一类很好的补体抑制剂，可用于补体非正常激活引 起的各种疾病，且有效浓度低，毒性低，用药安全，原料来源丰富，有较大的临 床应用价值。

具体实施方式

下面用非限定性实施例对本发明进一步说明。

实施例1 制备酰化黄酮苷化合物

鼠曲草干燥全草(购于中国安徽亳州药材市场)25kg粉碎，80％乙醇热回 流提取三次(200L×3)，合并提取液回收乙醇，60℃减压浓缩至干，得鼠曲草 总提物浸膏2.9kg，取总提物2.5kg用水(15L)混悬，依次用等体积的石油醚、 乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液浓缩60℃减压至干，即得乙 酸乙酯萃取物450g。取乙酸乙酯萃取物400g经硅胶柱(4kg，100～200目，10cm ×100cm)色谱以二氯甲烷∶甲醇(70∶1，50∶1，30∶1，20∶1，10∶1，5∶1，3∶1，1∶1)梯度洗 脱，每个梯度洗脱20L，收集二氯甲烷∶甲醇(10∶1)洗脱流份20L，60℃减压浓缩 至干，得80g浸膏，再经硅胶柱(1kg，200～300目，10cm×60cm)层析，以二氯甲 烷∶甲醇(30∶1，20∶1，15∶1，10∶1，5∶1，3∶1，1∶1，0∶1)洗脱，每个梯度洗脱10L，得到8 个流份(Fr₁-Fr₈)。流份Fr₇(23.3g)经反相硅胶柱(125g，5cm×20cm)甲醇/水(1∶4， 1∶2，1∶1，3∶2，4∶1，纯甲醇)梯度洗脱，每个梯度洗脱2L，得I-VI6个流份， 其中流份III(4.5g)再经反相硅胶柱(100g，5cm×15cm)甲醇/水(2∶3)反复纯化2次， 每次纯化洗脱溶剂量为1.5L，60℃减压回收溶剂，得化合物1(118.1mg)，流份 IV(6.4g)经硅胶柱(70g，5cm×20cm)二氯甲烷∶甲醇(10∶1)反复纯化3次，每次纯化 洗脱溶剂量为1.5L，60℃减压减压回收溶剂，得化合物2(315.6mg)，流份V(5.7g) 和流份VI(1.6g)分别经反相硅胶柱(100g，5cm×15cm)甲醇/水(2∶3)反复纯化3次， 每次纯化洗脱溶剂量为1.5L，60℃减压回收溶剂，得化合物3(245.3mg)和4(29.4 mg)。

得到的化合物1、2、3、4的检测结果如下：

芹菜素-4′-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖苷化合物1，C₃₀H₂₆O₁₃，黄色粉末。 HR-ESI-MS(m/z 594.1450[M+H]⁺).IR：3356，1701，1654，1606，1506。¹H-NMR (DMSO-d₆，600MHz)δppm：6.77(1H，s，H-3)，6.20(1H，d，J＝1.8Hz，H-6)，6.46(1H，d， J＝1.8Hz，H-8)，7.98(2H，d，J＝8.4Hz，H-2′，H-6′)，7.20(2H，d，J＝8.4Hz，H-3′，H-5′)， 5.16(1H，d，J＝7.2Hz，H-1″)，7.03(1H，d，J＝1.8Hz，H-2″′)，6.73(1H，d，J＝8.4Hz， H-5″′)，6.99(1H，dd，J＝8.4，1.8Hz，H-6″′)，7.46(1H，d，J＝15.6Hz，H-7″′)，6.27(1H，d， J＝15.6Hz H-8″′).¹³C-NMR(DMSO-d₆，150MHz)δppm：162.9(C-2)，103.7(C-3)， 181.6(C-4)，161.3(C-5)，98.8(C-6)，164.2(C-7)，93.9(C-8)，157.2(C-9)，103.7(C-10)， 124.0(C-1′)，128.0(C-2′)，116.5(C-3′)，159.9(C-4′)，116.5(C-5′)，128.0(C-6′)， 99.6(C-1″)，73.0(C-2″)，73.7(C-3″)，69.7(C-4″)，76.2(C-5″)，63.1(C-6″)，125.3(C-1″′)， 114.8(C-2″′)，145.5(C-3″′)，148.4(C-4″′)，115.7(C-5″′)，121.1(C-6″′)，145.3(C-7″′)， 113.6(C-8″′)，166.3(C-9″′)。

木犀草素-4′-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖苷化合物2，C₃₀H₂₆O₁₄，黄色粉 末。HR-ESI-MS(m/z 611.1382[M+H]⁺).IR：3394，1657，1625，1509。¹H-NMR (DMSO-d₆，600MHz)δppm：6.69(1H，s，H-3)，6.20(1H，d，J＝2.4Hz，H-6)，6.44(1H， d，J＝1.8Hz，H-8)，7.49(1H，d，J＝2.4Hz，H-2′)，7.22(1H，d，J＝8.4Hz，H-5′)，7.42(1H， dd，J＝8.4，2.4Hz，H-6′)，4.99(1H，d，J＝7.2Hz，H-1″)，7.05(1H，d，J＝1.8Hz，H-2″′)， 6.75(1H，d，J＝8.4Hz，H-5″′)，7.02(1H，dd，J＝8.4，1.8Hz，H-6″′)，7.50(1H，d，J＝15.6 Hz，H-7″′)，6.29(1H，d，J＝15.6Hz H-8″′)。¹³C-NMR(DMSO-d₆，150MHz)δppm： 163.0(C-2)，103.7(C-3)，181.6(C-4)，161.7(C-5)，98.9(C-6)，164.2(C-7)，93.9(C-8)， 157.3(C-9)，103.9(C-10)，124.8(C-1′)，113.6(C-2′)，146.9(C-3′)，148.2(C-4′)， 115.8(C-5′)，118.3(C-6′)，100.8(C-1″)，73.1(C-2″)，75.7(C-3″)，69.8(C-4″)，73.9(C-5″)， 63.1(C-6″)，125.4(C-1″′)，114.9(C-2″′)，145.5(C-3″′)，148.4(C-4″′)，115.8(C-5″′)， 121.2(C-6″′)，145.3(C-7″′)，113.7(C-8″′)，166.3(C-9″′)。

槲皮素-4′-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖苷化合物3，C₃₀H₂₆O₁₅，黄色粉末。 HR-ESI-MS  (m/z 627.1350[M+H]⁺).IR：3405，1686，1599，1506。¹H-NMR (DMSO-d₆，600MHz)δppm：6.20(1H，d，J＝2.4Hz，H-6)，6.39(1H，d，J＝1.8Hz，H-8)， 7.71(1H，d，J＝1.8Hz，H-2′)，7.23(1H，d，J＝9.0Hz，H-5′)，7.59(1H，dd，J＝9.0，2.4Hz， H-6′)，4.96(1H，d，J＝7.2Hz，H-1″)，6.73(1H，d，J＝8.4Hz，H-5″′)，7.00(1H，dd，J＝8.4， 1.8Hz，H-6″′)，7.49(1H，d，J＝15.6Hz，H-7″′)，6.29(1H，d，J＝15.6Hz H-8″′)。 ¹³C-NMR(DMSO-d₆，150MHz)δppm：145.8(C-2)，136.4(C-3)，176.0(C-4)， 160.7(C-5)，98.2(C-6)，164.0(C-7)，93.5(C-8)，156.2(C-9)，103.1(C-10)，125.2(C-1′)， 115.3(C-2′)，146.3(C-3′)，146.5(C-4′)，115.6(C-5′)，119.4(C-6′)，101.1(C-1″)， 73.2(C-2″)，75.7(C-3″)，69.8(C-4″)，73.9(C-5″)，63.2(C-6″)，125.4(C-1″′)，114.9(C-2″′)， 145.5(C-3″′)，148.4(C-4″′)，115.8(C-5″′)，121.2(C-6″′)，145.3(C-7″′)，113.7(C-8″′)， 166.4(C-9″′)。

芹菜素-7-O-β-D-(6″-E-咖啡酰基)-葡萄糖苷化合物4，C₃₀H₂₆O₁₃，黄色粉末。 ¹H-NMR(DMSO-d₆，600MHz)δppm：6.80(1H，s，H-3)，6.49(1H，d，J＝1.8Hz，H-6)， 6.80(1H，d，J＝1.8Hz，H-8)，7.92(2H，d，J＝8.4Hz，H-2′，H-6′)，6.91(2H，d，J＝8.4Hz， H-3′，H-5′)，5.16(1H，d，J＝7.2Hz，H-1″)，6.96(1H，d，J＝1.2Hz，H-2″′)，6.65(1H，d， J＝8.4Hz，H-5″′)，6.84(1H，dd，J＝8.4，1.8Hz，H-6″′)，7.43(1H，d，J＝15.6Hz，H-7″′)， 6.23(1H，d，J＝15.6Hz H-8″′)。¹³C-NMR(DMSO-d₆，150MHz)δppm：164.2(C-2)， 103.0(C-3)，181.8(C-4)，161.1(C-5)，99.3(C-6)，162.6(C-7)，94.7(C-8)，156.8(C-9)， 105.3(C-10)，120.8(C-1′)，128.4(C-2′)，115.9(C-3′)，161.2(C-4′)，115.9(C-5′)， 128.4(C-6′)，99.5(C-1″)，72.9(C-2″)，76.2(C-3″)，69.8(C-4″)，73.8(C-5″)，63.2(C-6″)， 125.3(C-1″′)，114.9(C-2″′)，145.4(C-3″′，148.2(C-4″′)，115.6(C-5″′)，120.9(C-6″′)， 145.2(C-7″′)，113.5(C-8″′)，166.3(C-9″′)(Phytochemistry，1995，47：865-874)。

实施例2 经典途径补体抑制试验

1 仪器与试剂

低温高速离心机(Jouan MR22i)、酶标仪(Thermo Labsystems，Well scan MK3)、绵羊红细胞、抗绵羊红细胞抗体(sigma公司)、人血清、巴比妥-巴比妥 钠缓冲盐(BBS²⁺，pH＝7.4，含0.5mM Mg²⁺和0.15mM Ca²⁺)、三蒸水、肝素钠、 恒温水浴锅。

2 试验药物

实施例1制备的鼠曲草总提取物和从中分离得到的酰化黄酮苷类化合物

3 实验方法

取人血清，以VBS²⁺缓冲液(巴比妥缓冲液，pH＝7.4，含0.5mM Mg²⁺和0.15 mM Ca²⁺)稀释为1∶10，作为经典途径的“补体”来源。将抗羊红细胞的抗体以 VBS²⁺缓冲液稀释为1∶1000作为溶血素；将绵羊红细胞用VBS²⁺缓冲液配置成 2％绵羊红细胞。分别精密称量实施例1制备的酰化黄酮苷化合物1～4样品2mg， 加入VBS²⁺缓冲液1ml溶解(加入1％的二甲亚砜助溶)，配成2mg/ml的样品溶液， 然后用VBS²⁺缓冲液对倍稀释成1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、 0.0625mg/ml、0.03125mg/ml、0.015625mg/ml、0.0078125mg/ml 8个不同浓度。 不同浓度的样品溶液0.2ml与1∶10的“补体”0.2ml在37℃预孵育10min后， 依次加入0.1ml抗羊红细胞抗体(1∶1000)和0.1ml 2％绵羊红细胞，在37℃水浴 孵育30min后放入低温高速离心机，在5000rpm，4℃条件下离心10min。分别 取每管上清0.2ml于酶标板上，在酶标仪(Thermo Labsystems，Well scan MK3) 405nm下测定吸光度。实验同时设置样品对照组(0.2ml相应浓度的样品溶液加 0.4ml VBS²⁺缓冲液)、补体对照组(以0.2ml VBS²⁺缓冲液代替样品溶液)和全溶 血组(0.1ml 2％绵羊红细胞溶于0.5ml三次蒸馏的水中)。将各浓度的样品组吸 光度值扣除相应样品对照组吸光度值后计算溶血抑制率。以样品浓度的对数作为 X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，得到的拟合直线计算半数抑制浓度IC₅₀值。

4 实验结果

以肝素钠作为阳性对照药，结果显示以上实施例制备的酰化黄酮苷1～4可抑 制补体经典途径激活所导致的细胞溶血，具有显著的抗补体活性。结果见表1

表1 化合物1-4对补体系统经典途径的抑制作用

5 实验小结

酰化黄酮苷1～4具有相同的构型：黄酮苷元-糖-芳环侧链，可抑制补体经典 途径激活所导致的细胞溶血，具有显著的抗补体活性，各单体化合物的活性均要 强于鼠曲草总提物的活性，可见这类化合物是一类很好的补体抑制剂，可用于补 体非正常激活引起的各种疾病，且有效浓度低，毒性低，用药安全，来源广泛， 并且化合物1～3为新化合物；酰化黄酮苷作为药用植物的一部分可以直接被机体 消化吸收，从天然产物中开发的补体抑制剂还有成本低的优点，预示着这类化合 物具有良好的应用前景。