基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒及其使用方法

摘要

基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒及其使用方法。由(1)反应液；(2)酶溶液；(3)引物溶液；(4)阳性对照液组成，其中引物溶液包括三对特异性引物即内引物、外引物和环引物；在反应中预先加入钙黄绿素锰络合物，锰与dNTP析出的焦磷酸跟离子结合，释放出钙黄绿素，可通过肉眼观察鉴定，阳性结果为黄绿色，阴性结果为浅黄色。本发明解决了现有技术中检测鸡传染性支气管炎病毒所需周期长、灵敏度低、现场应用困难等问题。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及基于环介导等温扩增技术检测鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒， 

背景技术

禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由冠状病毒科冠状病毒属的禽传染性支气管炎病毒(Avian InfectiousBronchitis Virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，其特征为病鸡出现呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等。该病呈世界广泛流行，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。 

目前，鸡传染性支气管炎病毒的检测方法包括传统的血凝和血凝抑制、ELISA、中和试验和RT-PCR方法。传统的检测方法耗时长、操作繁琐。PCR法具有特异性强、灵敏度高和速度快等优点，但因RT-PCR容易交叉污染、操作繁琐、需要的热循环设备价格昂贵等缺点而很难得到推广。而实时荧光定量PCR虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量仪器，因此不适于现场快速检测。而且实时定量PCR荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。 

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplication，LAMP)是Notomi等在2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温65℃左右，几十分钟，即可实 现核酸的高效扩增。4条引物对靶序列的6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性。LAMP不需要模板的热变性，长时间温度循环，在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的浪费。有无肉眼可见的焦磷酸镁的白色沉淀，成为判断核酸是否扩增的最简单的方法。增加环引物的LAMP方法，使反应时间缩短一半，可以在不到30min内完成，大大提高了检测的效率，环状引物与茎环结构结合的区域在F2和F1之间(或是B2和B1之间)，以F1到F2的方向或是B1到B2的方向结合。这样，茎环DNA或者与内引物杂交，或者与环状引物杂交来启动链置换DNA的合成，从而加快了反应速度。环介导等温扩增技术在病原核酸检测技术上具有很多优点，但是目前还未见有应用环介导等温扩增技术检测鸡传染性支管病毒的方法和检测试剂盒。 

发明内容

本发明的一个目的是解决现有技术中检测鸡传染性支气管炎病毒所需周期长、灵敏度低、现场应用困难等问题，提供一种基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplicatio of DNA，简称LAMP)的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒，适用于检测不同血清型的IB病毒，可广泛应用于兽医检测领域。 

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案： 

本发明由(1)反应液；(2)酶溶液；(3)引物溶液；(4)阳性对照液组成，以上四种液体分别置于容器中。 

优选的，所述引物溶液包括二对特异性引物即内引物、外引物，由浓度为10μM-20μM的内引物、浓度为2μM-4μM的外引物组成； 

引物序列如下： 

内引物1： 

GCTAGATGAACCAGAGGTCCTTCTTTTCCGTTGCTTGGGCTAC 

内引物2； 

GTCACCTCCCCCCACATACCTTTTCGACCTTGTGCGAGAACGTAG 

外引物1：GTTGCTGGTATCACTGCTTGT 

外引物2：CAGGGGTTGTTTGGCACTAC 

进一步优选的，所述引物溶液还包括浓度为5μM-10μM的环引物，序列如下： 

环引物1：CGCCCGTAGGACGCT 

环引物2：GGCTTTTGAGCCTAGCGTTG 

优选的，所述反应液由浓度为100mM-200mM的Tris-HCl(pH8.8)、浓度为50mM-75mM的KCl、浓度为50mM-75mM的(NH4)₂SO4、浓度为4M-5M的甜菜碱、浓度为6mM-8mM的dNTP、浓度为30mM-40mM的MgSO4、浓度为0.01mM-1mM的钙黄绿素锰络合物组成。 

优选的，所述酶溶液由浓度为4U/μL的Bst DNA聚合酶、1.3U/μL的AMV逆转录酶、10U/μL的RNA酶抑制剂组成。 

优选的，所述阳性对照液由阳性模板DNA经体外转录成RNA制备，浓度为10ng/μL-50ng/μL。 

鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤： 

[1]RNA模板的制备； 

[2]在反应管中加入5μL的反应液、2μL的酶溶液、2μL的引物溶液、RNA模板2μL-5μL，ddH2O定容至25μL，60℃温育30min-60min； 

[3]结果观察：阳性对照管发出黄绿色荧光，样品管与阳性对照同色为阳性，否则为阴性。 

其中，所述[1]步骤可按以下方式提取：A、取检测组织0.5g，在液氮中研磨3-5min呈粉末，将粉末置于1.5mL离心管中，加入1mLTrizol后，剧烈振荡，室温放置5-10min。 

B、加入200μL氯仿，剧烈振荡，室温放置3-5min，12,000g离心15min。 

C、吸取上清，加入异丙醇500μL，混匀，室温放置10min。 

D、12,000g离心10min，去上清，可见沉淀，用75％乙醇洗涤，缓慢混匀后静置2min。 

E、7,500g离心5min，完全去除乙醇，在超净台内用风吹5min后加入8μLddH2O溶解，即为待检RNA，-20℃冰箱中保存备用。 

再者，所述[1]步骤可按以下方式提取：取咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于300μL生理盐水中10min，12,000g离心15min，取上清200μL，采用(1)中从组织样品中提取RNA的方法提取RNA。 

本发明建立了基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒，本试剂盒根据鸡传染性支气管炎病毒5′端非编码保守区的八个部位设计了一套内引物、一套外引物、一套环引物，环 引物的引入加快了反应速度，缩短检测反应时间。本发明采用环介导等温扩增技术，特异性强，比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用染料来观察，快速、准确性高、灵敏度好、现场应用方便。 

本发明的有益效果是(1)不需要特殊试剂与设备；(2)能检测多种血清型的IB病毒，根据鸡传染性支气管炎病毒5′端非编码保守区设计引物；(3)高特异性：应用8个区域，三对引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否；(4)快速、高效扩增：检测时间30min左右(5)鉴定简便：结果不必用凝胶电泳方法来观察，在反应中预先加入钙黄绿素锰络合物，锰与dNTP析出的焦磷酸跟离子结合，释放出钙黄绿素，可通过肉眼观察鉴定，阳性结果为黄绿色，阴性结果为浅黄色。 

下面提供具体实例进一步阐述本发明的技术方案和有益效果，但本发明的技术应用不限于实例。 

具体实施方式

实施例一 

一、按下列配方制作鸡传染性支气管炎病毒的环介导等温扩增检测试剂盒： 

(1)分别配制以下溶液：1M的Tris-HCl(pH 8.8)、1M的KCl、1M的(NH4)2SO4、100mM的dNTP、1M的MgSO4、1M的MnCl2溶液，按照一定比例混合，加入固体甜菜碱、钙黄绿素，使甜菜碱的终浓度 为4M-5M，钙黄绿素的终浓度为0.01mM-1mM，用ddH₂O定容配置成5×反应液。 

(2)将8U/μL的Bst DNA聚合酶、5U/μL的AMV逆转录酶、40U/μL的RNA酶抑制剂按照2∶1∶1的比例混合，配制成酶溶液。 

(3)按以下序列经DNA合成仪合成寡核苷酸脱氧核酸引物：引物有三对： 

内引物1： 

GCTAGATGAACCAGAGGTCCTTCTTTTCCGTTGCTTGGGCTAC 

内引物2： 

GTCACCTCCCCCCACATACCTTTTCGACCTTGTGCGAGAACGTAG 

外引物1：GTTGCTGGTATCACTGCTTGT 

外引物2：CAGGGGTTGTTTGGCACTAC 

环引物1：CGCCCGTAGGACGCT 

环引物2：GGCTTTTGAGCCTAGCGTTG 

上述引物溶于ddH2O中，配制成浓度为100μM的母液，再按比例混合稀释配制引物溶液。 

(4)将IB病毒5′端非编码保守区克隆在具有T7 RNA聚合酶启动子序列的载体上，对重组质粒进行线性化后，在体外采用T7 RNA聚合酶进行转录获得RNA模板，用DEPC水稀释至适当的浓度，配制成阳性对照液。 

(5)鸡传染性支气管炎病毒LAMP扩增试剂的配制方法如下：取 5μL的5×反应液、2μL的酶溶液、2μL的引物溶液、RNA模板2μL-5μL，ddH2O定容至25μL。 

二、样品RNA的制备 

(1)从组织样品中提取RNA 

A、取检测组织0.5g，在液氮中研磨3-5min呈粉末，将粉末置于1.5mL离心管中，加入1mLTrizol后，剧烈振荡，室温放置5-10min。 

B、加入200μL氯仿，剧烈振荡，室温放置3-5min，12,000g离心15min。 

C、吸取上清，加入异丙醇500μL，混匀，室温放置10min。 

D、12,000g离心10min，去上清，可见沉淀，用75％乙醇洗涤，缓慢混匀后静置2min。 

E、7,500g离心5min，完全去除乙醇，在超净台内用风吹5min后加入8μLddH2O溶解，即为待检RNA，-20℃冰箱中保存备用。 

(2)再者，RNA也可从家禽咽喉、泄殖腔棉拭子样品中提取：： 

取咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于300μL生理盐水中10min，12,000g离心15min，取上清200μL，采用(1)中从组织样品中提取RNA的方法提取RNA。 

三、鸡传染性支气管炎病毒的环介导等温扩增： 

在装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL待检RNA模版，于65℃温育30min，80℃灭活10min中止反应。 

四、结果观察： 

阳性对照管发出黄绿色荧光，样品管与阳性对照同色为阳性，否 则为阴性。 

实施例二 

一、按下列配方制作鸡传染性支气管炎病毒的环介导等温扩增检测试剂盒： 

(1)分别配制以下溶液：1M的Tris-HCl(pH 8.8)、1M的KCl、1M的(NH4)2SO4、100mM的dNTP、1M的MgSO4、1M的MnCl2溶液，按照一定比例混合，加入固体甜菜碱、钙黄绿素，使甜菜碱的终浓度为4M-5M，钙黄绿素的终浓度为0.01mM-1mM，用ddH2O定容配置成5×反应液。 

(2)将8U/μL的Bst DNA聚合酶、5U/μL的AMV逆转录酶、40U/μL的RNA酶抑制剂按照2∶1∶1的比例混合，配制成酶溶液。 

(3)按以下序列经DNA合成仪合成寡核苷酸脱氧核酸引物：引物有二对： 

内引物1： 

GCTAGATGAACCAGAGGTCCTTCTTTTCCGTTGCTTGGGCTAC 

内引物2： 

GTCACCTCCCCCCACATACCTTTTCGACCTTGTGCGAGAACGTAG 

外引物1：GTTGCTGGTATCACTGCTTGT 

外引物2：CAGGGGTTGTTTGGCACTAC 

上述引物溶于ddH2O中，配制成浓度为100μM的母液，再按比例混合稀释配制引物溶液。 

(4)将IB病毒5′端非编码保守区克隆在具有T7RNA聚合酶启动子序列的载体上，对重组质粒进行线性化后，在体外采用T7RNA聚合酶进行转录获得RNA模板，用DEPC水稀释至适当的浓度，配制成阳性对照液。 

(5)鸡传染性支气管炎病毒LAMP扩增试剂的配制方法如下：取5μL的5×反应液、2μL的酶溶液、2μL的引物溶液、RNA模板2μL-5μL，ddH2O定容至25μL。 

二、样品RNA的制备 

(1)从组织样品中提取RNA 

A、取检测组织0.5g，在液氮中研磨3-5min呈粉末，将粉末置于1.5mL离心管中，加入1mLTrizol后，剧烈振荡，室温放置5-10min。 

B、加入200μL氯仿，剧烈振荡，室温放置3-5min，12,000g离心15min。 

C、吸取上清，加入异丙醇500μL，混匀，室温放置10min。 

D、12,000g离心10min，去上清，可见沉淀，用75％乙醇洗涤，缓慢混匀后静置2min。 

E、7,500g离心5min，完全去除乙醇，在超净台内用风吹5min后加入8μLddH2O溶解，即为待检RNA，-20℃冰箱中保存备用。 

(2)再者，RNA也可从家禽咽喉、泄殖腔棉拭子样品中提取： 

取咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于300μL生理盐水中10min，12,000g离心15min，取上清200μL，采用(1)中从组织样品中提取RNA的方法提取RNA。 

三、鸡传染性支气管炎病毒的环介导等温扩增： 

在装有23μL的LAMP反应液的反应管中加入2μL待检RNA模版，于65℃温育30min，80℃灭活10min中止反应。 

四、结果观察： 

阳性对照管发出黄绿色荧光，样品管与阳性对照同色为阳性，否则为阴性。 

                        序列表 

<110>江苏省家禽科学研究所 

<120>基于环介导等温扩增技术的鸡传染性支气管炎病毒快速检测试剂盒及其使用方法 

<160>6 

<170>PatentIn version 3.2 

<210>1 

<211>43 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>1 

内引物FIP：GCTAGATGAACCAGAGGTCCTTCTTTTCCGTTGCTTGGGCTAC 

<210>2 

<211>45 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>2 

内引物BIP：GTCACCTCCCCCCACATACCTTTTCGACCTTGTGCGAGAACGTAG 

<210>3 

<211>21 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>3 

外引物F3：GTTGCTGGTATCACTGCTTGT 

<210>4 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>4 

外引物B3：CAGGGGTTGTTTGGCACTAC 

<210>5 

<211>15 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>5 

环引物LF：CGCCCGTAGGACGCT 

<210>6 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>6 

环引物LB：GGCTTTTGAGCCTAGCGTTG