聚磷放线菌阎氏链霉菌

摘要

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有较强的聚磷能力的微生物菌株。本发明所述的聚磷放线菌阎氏链霉菌系链霉菌属，命名为聚磷放线菌阎氏链霉菌YIMA116（

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有较强的聚磷能力的微生物菌株。

背景技术

聚磷菌是从工程的角度在污水生物除磷研究中对微生物的一种界定，将厌氧/好氧交替运行导致厌氧释磷、好氧超量吸磷的一类异养型细菌称为聚磷菌。早期的研究者认为聚磷菌属于不动杆菌属，但是后期研究者认为属于莫拉氏菌属、假单胞菌属、气单胞菌属等。由于聚磷菌只是按照超量聚磷这个生物化学过程来界定的，所以要真正界定聚磷菌还应该从细菌的微生物特性入手进行研究。

聚磷菌也叫做摄磷菌，是指体内能贮存聚磷和聚β-羟基丁酸的一类细菌的总称。一般认为主要有不动杆菌、假单胞菌属等菌种。聚磷菌是传统活性污泥工艺中一类特殊的兼性细菌，在好氧或缺氧状态下能超量地将污水中的磷吸入体内，使体内的含磷量超过一般细菌体内的含磷量的数倍，生物除磷主要是利用聚磷菌的聚磷作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从禾本科植物茅草根际土壤中，分离得到的具有高效聚磷活性的土壤放线菌———聚磷放线菌阎氏链霉菌。

本发明所述的聚磷放线菌阎氏链霉菌系从禾本科植物茅草根际土壤中分离得到。现在国家知识产权局认可的保藏单位保藏，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，保藏单位地址：中国，武汉大学，邮政编码：430072。保藏日期为2011年6月1日，保藏编号为CCTCC NO：M2011188。

本发明所述的聚磷放线菌阎氏链霉菌系链霉菌属，命名为阎氏链霉菌YIM A116（Streptomyces yanii YIM A116），现保藏在国家知识产权局认可的保藏单位，保藏编号为CCTCC NO：M2011188。

本发明所述的YIM A116菌株经PCR技术，DNA测序仪分析，该菌株的16S rDNA序列由1411个碱基组成。用BLAST程序对YIM A116的16S rDNA序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，结果与已报道的阎氏链霉菌Streptomyces yanii NBRC 14669T(登录号AB006159)的16S rDNA序列同源性达到100％ ，鉴定其为阎氏链霉菌Streptomyces yanii。构建了YIM A116菌株的系统发育进化树。

YIM A116菌种描述：

好氧生长，革兰氏阳性，产生大量分枝的基内菌丝和气生菌丝。基内菌丝部分短分枝尖端长有单个孢子。气生菌丝长有较短的直形孢子链、弯曲状孢子链及多分枝的孢子丝，孢子呈椭圆形。在ISP2培养基上培养可生长出大量灰色的气生孢子和灰色至黑色的基内菌丝，无色素产生。

YIM A116固体培养特征：

ISP2培养基28℃培养24小时，长出少量白色至乳黄色小菌落，表面光滑，微微凸起，边缘整齐，菌落边缘培养基轻微凹陷；2天菌落直径增大，全部变为乳黄色，少量菌落开始产生白色气生菌丝；3天菌落大量生长，大片白色气生菌丝变为灰色，新生菌落产生较薄的白色气生菌丝，菌落直径从小于1mm至2mm不等，菌落凸起，边缘琼脂凹陷明显，基内菌丝为乳黄色；5天大部分菌落气生菌丝变为灰色，基内菌丝为灰黑色，少量单菌落气生菌丝为白色，菌落边缘有缺刻，基内菌丝为乳黄色；9天全部菌落都生成灰黑色的气生菌丝和基内菌丝，无色素产生。

YIM A116菌株的显微形态特征：

产生大量分枝的基内菌丝和气生菌丝。基内菌丝部分短分枝尖端长有单个孢子。气生菌丝长有较短的直形孢子链、弯曲状孢子链及多分枝的孢子丝，孢子呈椭圆形，0.8～1×1～1.5μm。

YIM A116菌株液体发酵培养特征：

    ①ISP2培养基，摇瓶培养5～7天。培养温度28℃。

 ②发酵培养特征：培养第1天，培养基略微变浑浊；培养第2天，培养基进一步变浑浊；培养第3天，发酵液菌丝体密集，发酵液呈棕黄色，有少量小菌丝球产生；培养第4天，长满棕黄色菌丝体，发酵液稍粘稠，培养第5～7天，菌丝体生长稳定，发酵液呈致密的棕黄色，可见少量棕黄色菌丝球产生。

茅草土壤放线菌YIM A116菌株采用液态发酵，其发酵流程：

菌种→试管斜面→种子培养→发酵培养→培养液离心→上清液→可溶性磷测定。

发酵条件参数如下：

    （1）发酵方式：液态发酵。

    （2）菌种斜面：试管斜面菌种培养采用ISP2培养基。

（3）种子培养：种子培养为ISP2液体培养基。

     ISP2液体培养基制备：秤取麦芽提取物（Malt extract）10g，酵母提取物（Yeast extract）4g，无水葡萄糖（Glucose）4g，溶于1L水，调节至pH 7.2±0.2，121℃高压灭菌30min。

上述ISP2培养基中加入琼脂15g，即为固体ISP2培养基。

改良的ISP2培养基制备：秤取麦芽提取物（Malt extract）10g，酵母提取物（Yeast extract）4g，无水葡萄糖（Glucose）7g，KH₂PO₄  0.5712g溶于1L水，调节至pH 7.2±0.2，121℃高压灭菌30min。

    （4）发酵培养：改良的ISP2培养基。

（5）培养时间：试管斜面菌种活化培养5天，种子摇床培养时间3～4天，发酵培养时间5～7天。

    （6）培养温度：试管斜面菌种培养温度28℃±1℃，种子摇床培养温度28℃±1℃，发酵培养温度为28℃±1℃。

（7）可溶性磷的测定：发酵完毕，收集发酵液，经离心，得到上清液。根据可溶性磷的测定方法，采用改良的钼锑抗比色法（GB 7852-87）来测定培养上清液中可溶性磷的含量。

本发明的好氧条件下，改良的ISP2（International Streptomyces Project Medium 2）液体培养基中培养7天后，培养基上清液可溶性磷浓度由208mg/ L下降为15.8mg /L ，磷去除率达到92.4％。YIM A116菌株具有较强的聚磷能力。本发明以ISP2为原料，采用纯培养方式，通过茅草根际土壤放线菌YIM A116液态发酵，根据可溶性磷的测定方法，采用钼锑抗比色法来测定培养上清液中可溶性磷的含量。YIM A116具有高效聚磷能力，是一类治理磷污染环境的重要微生物。

以往所报道的聚磷菌株多为污水处理系统的活性污泥中分离得到，在培养基磷浓度为10mg/L或更低的浓度下，聚磷率大多在50%-93%不等，菌株多为细菌，聚磷工艺多为好氧/厌氧交替进行的序批式反应（SBR工艺）。

本发明所涉及的YIM A116菌株分离自富磷山地草本植物茅草根际土壤，是一株具有高效聚磷活性的放线菌，其聚磷特点为：

1、聚磷量远大于以往报道的菌株，可以在100mL优化聚磷培养基（208mg/L磷浓度）中大量聚磷，使磷浓度降至15.8mg/L，聚磷率达到92.4%，净聚磷量达到19.22mg；

2、在单纯的好氧条件下即可大量聚磷，无需复杂繁琐的好氧/厌氧序批式工艺；

3、具有良好的聚磷长效性，在高磷培养基中连续培养28天，不会向培养基中重新放出磷，能长效保持高聚磷率。

附图说明

图1为本发明所述的YIM A116茅草根际土壤放线菌在ISP2培养基上培养特征（正面）。

图2为本发明所述的YIM A116茅草根际土壤放线菌在ISP2培养基上培养特征（反面）。

图3为本发明所述的YIM A116 茅草根际土壤放线菌菌丝体（光学显微镜1000X）。

图4为本发明所述的YIM A116 茅草根际土壤放线菌孢子丝（光学显微镜1000X）。

图5为本发明所述的YIM A116茅草根际土壤放线菌菌丝体（扫描电镜9113X，6800X）。

图6为本发明所述的YIM A116茅草根际土壤放线菌孢子丝（扫描电镜9113X，6800X）。

图7为本发明所述的YIM A116可溶性磷标准曲线图。

图8 为本发明所述的YIM A116菌株的系统发育进化树。

具体实施方式

   实施例：

取编号YIM A116菌种，在无菌条件下（无菌室或超净工作台），用灭菌竹签挑取少许菌种，转接于已灭菌的固体ISP2培养基试管（15×150mm）中，置培养箱内28℃活化培养5天。

取出活化5天的菌种，在无菌条件下，以同样方式接入活化好的菌种到已灭菌的种子ISP2液体培养基中，在28℃下摇床培养3～4天，即为YIM A116菌株发酵种子。

发酵采用250ml玻璃三角瓶，装入改良的ISP2液体培养基100ml，121℃灭菌30min后，取出冷却后放置28℃培养箱过夜，无杂菌污染即可确认灭菌彻底，可用于后续发酵培养。在无菌条件下，取YIM A116种子，接种于装有100ml改良ISP2液体培养基的250ml玻璃三角瓶中，接种量为5～10%（v/w），置28℃通气培养5～7天。在发酵期间，注意发酵室温度变化，检查有无染菌现象。

发酵完毕，收集发酵上清液。把发酵液加入到5ml 离心管中，12000rpm，离心3min，把上清液转移到干净的离心管中，测定上清液中可溶性磷含量。

可溶性磷的测定：根据可溶性磷的测定方法，采用钼锑抗比色法来测定培养上清液中可溶性磷的含量。

试剂的配制：

钼锑贮存液:153ml 浓硫酸(分析纯，密度1.84 g/ml ) ，缓慢地倒入约400ml 超纯水中，搅拌，冷却，另取10g钼酸铵（(NH ₄ )₆ Mo₇0₂₄.4H₂0，分析纯)，溶解于约60℃的300m1 水中，冷却。然后将硫酸溶液缓缓倒人钼酸铵溶液中，再加入100ml 0.5% 酒石酸锑钾(KSbOC₄H₄0₆·H₂0,分析纯)溶液，最后用超纯水稀释至1L，避光贮存。此贮存液含[1%钼酸铵、2.75mol/L硫酸]。

钼锑抗显色剂:1.50g抗坏血酸(C₆H₈0₆，左旋，旋光度+21°～+22°，分析纯)溶于100ml钼锑贮存液中。此液须随配随用。

5mg/L磷(P)标准溶液:0.4394g在50℃烘干的磷酸二氢钾(KH₂PO₄，分析纯)，加100ml水，加5m1浓硫酸(防腐)，用超纯水定容到1L，浓度为100mg/L磷(P)，此溶液可以长期保存。吸取上述溶液10ml于200m1容量瓶中，加水至标度，浓度为5mg/L磷(P)标准溶液，此溶液不宜久存。

测定方法：

1. 把发酵液加入到5ml 离心管中，12000rpm，离心3min，把上清液转移到干净的离心管中。

2.先把发酵液中的磷浓度稀释到25～50mg/L。

3.吸取0.5～1ml待测液于50ml 容量瓶中，加水至15～20ml ，用吸管加5m1钼锑抗显色剂，用水定容到标度，摇匀。30min后，在分光光度计上用2cm光径比色皿(如含磷量较高，应用1cm的比色皿)、700nm波长比色，以空白试验溶液为参比液，调吸收值到零，然后测定待测显色液的吸收值（OD值）。在标准线上查出显色液的磷mg/L数，颜色在8h内可保持稳定。

4.标准曲线的绘制:分别吸取5mg/L磷(P)标准溶液，0、1、2、3、4、5、6ml 于50ml容量瓶中，加水至15～20ml ，用吸管加5m1钼锑抗显色剂，用水定容到标度，摇匀。得到0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/L磷(P)标准系列显色液。30min后，在分光光度计上用2cm光径比色皿、700nm波长比色，得到0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/L磷(P)标准系列显色液。用0mg/L磷标准系列显色液作参比，调吸收值到零，由低浓度到高浓度测标准系列显色液的吸收值。在方格纸上以OD值作纵坐标，磷mg/L数为横坐标绘制标准曲线（见图7）。

计算公式：

P mg/L＝显色液磷mg/L数×分取倍数

显色液磷mg/L含量：从标准曲线查得显色液的磷mg/L含量

显色液体积：50ml

    

YIM A116菌株聚磷率测定结果：

发酵液OD值/700nm稀释后磷浓度（mg/L）稀释倍数磷浓度（mg/L）ISP2+P未培养液0.2270.5198400207.9A116培养7天后0.0720.158010015.8

根据上述公式可以算出未培养液中磷和培养后磷的浓度，计算YIM A116菌株的聚磷率：

本发明是采用茅草根际土壤放线菌作为发酵菌株，来测定菌株的聚磷效果。它是以改良的ISP2液体培养基为原料，通过液态发酵方式，采用组合化学手段，测定可溶性磷。该菌株是重要的土壤固磷应用微生物。

本发明所述的菌株YIM A116的16S rDNA由1411个碱基组成：

ACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGACGGGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTTGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGACGAT。