一种戊糖乳杆菌和该乳杆菌的发酵产物以及发酵产物的用途

摘要

本发明涉及一种戊糖乳杆菌菌株和该乳酸菌的发酵产物，本发明中的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)LPEM818，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为：CGMCC No.4583。本发明中的乳杆菌的发酵产物能够抑制食品中常见的致病菌大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌，尤其对能引起严重食物中毒的单增李斯特菌有很强的抑制作用。此外，该菌株的代谢物还可以抑制黄曲霉以及棉花和番茄枯萎病病原菌的生长。因此本戊糖乳杆菌及其发酵产物在食品保鲜、植物保护领域中有着积极的作用。

说明书

技术领域

本发明属于微生物资源利用领域，具体涉及一种戊糖乳杆菌和该乳 杆菌的发酵产物以及发酵产物的用途。

背景技术

现在市场上许多食品受到污染，其中生肉、水产品及散装速冻食品 受污染最为严重。一般食品采用低温冷藏或者化学药品进行防腐，然而 效果并不理想，有些防腐剂甚至含有微量毒素，长期过量摄入会对人体 健康造成一定的损害。同时某些致病菌如单核细胞增生李斯特氏菌广泛 存在于自然界中，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品中威 胁人类健康的主要病原菌之一。

在各类粮食作物和各类其他食品中经常有霉菌生长并产生毒素，如 在霉变的花生中发现的黄曲霉毒素。食品中的霉菌毒素会直接影响食品 安全。若带有黄曲霉毒素的玉米和饲料、饲喂畜禽后，体内残留的霉菌 毒素及其代谢物会造成食品污染，并通过食物链对人类健康产生极大的 潜在危害。因此，加强食品和饲料中霉菌及其代谢产物的控制，对于保 证食品和饲料质量安全、保护人与动物健康都具有十分重要的意义。

农作物病害给农民造成严重的损失，并且难以防治。多年来，以化 学防治为主的措施不但未能遏制土传病害上升的趋势，而且还抑制了土 壤中的有益微生物生长，导致病原菌产生抗药性，同时造成有害物质在 作物中的残留。

大量食品易被霉菌、细菌污染，所以研究开发能抑制多种微生物的 产品，在食品以及其他领域具有极大地应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种戊糖乳杆菌和该乳杆菌的发酵产物以及 发酵产物的用途。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种戊糖乳杆菌 (Lactobacillus pentosus)菌株LPEM818，已于2011年1月26日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编 号为：CGMCC No.4583。

将所述的戊糖乳杆菌LPEM818接种于在MRS培养基中，37℃厌氧培 养36h达到稳定期后期即可获得本发酵产物。

所述的MRS培养基的配制过程如下：

首先按照下述配方采用三级水配制培养液：(单位/L)

蛋白胨10g       牛肉膏10g    酵母粉5g      磷酸氢二钾2g

柠檬酸二铵2g    酸钠5g       葡萄糖20g     Tween-805ml

硫酸镁0.58g     硫酸锰0.25g

然后将按上述比例配制好的培养液调pH至7.0，115℃灭菌20min。

将在MRS培养基中37℃厌氧培养36h，至稳定期后期得到的发酵液 经离心去除菌体，然后通过旋转蒸发浓缩10～15倍。

本发明中的戊糖乳杆菌对黄曲霉、一些植物病原菌及食品致病菌具 有较强的抑制作用，可以用乳酸菌青贮发酵全株玉米和苜蓿，降低青贮 料的pH值，发挥乳酸菌代谢物保鲜及抗霉菌污染作用，延长青贮饲料 的保存期，提高青贮品质；同时将其应用于发酵乳制品和酸菜中以改善 风味，杀死或者抑制发酵食品中污染的微生物，进而延长食品的保质期 和货架期；还可以使牲畜消化道内增加大量的有益菌并形成菌群优势， 使其在动物体内发挥抗病原菌繁殖和霉菌毒素，有益于动物的成长，以 间接为人类提高健康的动物食品。

同时本戊糖乳杆菌的发酵液中包括大量琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸、 油酸、硬脂酸和亚油酸，由于本戊糖乳杆菌的代谢过程中会产生大量的 酸，使环境中的pH值降低，从而抑制了黄曲霉、各种病原菌及致病菌 的生长。

附图说明

图1为LPEM818菌株的发酵液浓缩液对黄曲霉的抑制作用示意图；

图2为LPEM818菌株的发酵液浓缩液对四联球菌的抑制作用示意 图；

图3为LPEM818菌株的发酵液浓缩液对绿脓杆菌的抑制作用示意 图；

图4为LPEM818菌株的发酵液浓缩液对霉菌孢子萌发的抑制作用示 意图；

图5为MRS培养基浓缩液对霉菌孢子影响萌发没有抑制作用的示意 图；

图6为LPEM818菌株的发酵液浓缩液对霉菌孢子萌发菌丝生长的抑 制作用示意图；

图7为用GC-MS法分析发酵液中有机酸的成分图；

图8为LPEM818菌株的系统发育树；

图9为LPEM818菌株的发酵液的浓缩液在黑木耳保藏中的抑制霉菌 生长的作用；

图10为对照的黑木耳中霉菌生长的示意图；

图11为LPEM818菌株的形态特征观察图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验菌株

检测菌：山西应县普通农家提供的小米富集一周后分离出的 LPEM818菌株。

指示菌：抑菌谱中所见的菌株见表一，均为实验室保藏菌株。

1.1.2试剂和培养基

甲醇(色谱级，上海凌峰化学试剂有限公司)、硫酸(上海振企化 学试剂有限公司)、氯化钠(Bio Basic Inc.)、硫酸钠(Bio Basic Inc.)、 二氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)、UNIQ-10柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒和SK2072即用型PCR扩增试剂盒(上海生物工程有限公司)。

MRS培养基及菌种鉴定培养基：

(1)MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，磷酸 氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，Tween-805mL，硫 酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，pH7.0，三级水定容至1L，115℃灭菌20min。

MRS固体培养基：配方同MRS液体培养基，加琼脂20g。

MRS选择培养基：配方同MRS液体培养基，加溴甲酚紫0.1g和琼脂 20g。

(2)素琼脂培养基：琼脂20g，加三级水定容至1L，121℃灭菌20 min。

指示菌生长培养基：

(1)PDA液体培养基(培养霉菌)：去皮土豆200g，切成小块煮沸 30min，用纱布过滤。加蔗糖20g，琼脂20g，加热溶化，三级水定容至 1L分装，121℃灭菌20min。

PDA固体培养基：配方同PDA液体培养基，每升加琼脂18g。

PDA半固体培养基(上层培养基)：配方同PDA液体培养基，每升加 琼脂8g。

(2)LB液体培养基(培养细菌)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠 10g，三级水定容至1L，pH7.0，121℃灭菌20min。

LB固体培养基：配方同LB液体培养基，每升加琼脂18g。

LB半固体培养基(上层培养基)：配方同LB液体培养基，每升加琼 脂8g。

1.1.3仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪GC-MS QP 2010 Plus(岛沣国际贸易有限公 司)。

PCR扩增仪(珠海黑马医学仪器有限责任公司)。

1.2方法

1.2.1LPEM818菌株的分离纯化

将取自山西应县普通农家的小米装于10ml试管中加适量无菌水密 封后在37℃条件下富集7天，取0.1ml富集液涂布于MRS选择培养基上， 37℃培养24h，挑取能使培养基由紫变黄的菌株即为产酸菌株，进一步 分离纯化。将上述产酸菌在液体MRS培养基中发酵24h，离心，收集上 清液，浓缩15倍。将浓缩液做抑菌实验，在156株产酸菌中有6株菌 的浓缩液对黑曲霉、黄曲霉有不同的抑制作用。

其中一株菌的抑菌能力较强，此菌株的菌落为乳白色，菌落凸起、 光滑、边缘整齐，将其命名为菌株LPEM818，对菌株LPEM818进一步分 离纯化并进行下一步实验。

1.2.2发酵浓缩液的制备

将LPEM818菌株接种到新鲜的MRS液体培养基中，37℃静置培养36h 后，4℃，10000r/min离心15min，取上清液。将上清液旋转蒸发浓缩 10～15倍。

1.2.3孢子悬液的制备

将黄曲霉接种在PDA斜面培养基上，28℃培养7d。在试管中加入一 定量的无菌水[含0.05％(V/V)的吐温80]，洗下斜面上的孢子，再通过 无菌纱布过滤以除去菌丝残体，即为孢子悬液。将孢子浓度调整为10⁷孢子/ml，待用。

1.2.4抑霉菌试验

牛沣杯双层平板法：取孢子悬液100μl与7ml经融化后保持在50℃ 左右的PDA半固体培养基相混合，并立刻倒在含有2％琼脂的素琼脂培养 基上，凝固后放上牛沣杯。将200μl的LPEM818上清浓缩液注入牛沣杯， 28℃培养约35h后观察是否出现抑菌圈，同时设浓缩倍数相同的MRS浓 缩液作对照。试验结果如图1所示。

图1中的牛沣杯孔1，3为对照，孔2，4为LPEM818菌株发酵浓缩液。

试管法：将100μl孢子悬液和1ml浓缩液同时加入到5ml的液体 PDA培养基中。在28℃，130r/min振荡培养，在显微镜下观察孢子萌发 状况。同时设未加浓缩液的液体PDA培养基作对照。

1.2.5抑菌谱的测定

1.2.5.1指示菌的培养，细菌指示菌的培养采用LB培养基，37℃培 养至对数中期，霉菌指示菌的培养方法同黄曲霉孢子的培养方法。

1.2.5.抑菌作用的测定，同上采用牛沣杯双层平板法。

1.2.6气相色谱-质谱分析发酵液成分

1.2.6.1样品的处理

将发酵上清液5ml加到150ml具有磨口塞的锥形瓶中，再加入50mL 10％(V/V)的硫酸甲醇溶液，密闭，将锥形瓶置于60℃的水浴分别恒温 酯化2h。将酯化液用滤纸过滤到分液漏斗中，分别用15ml二氯甲烷萃 取3次，合并萃取液。萃取液用20ml饱和NaCl溶液洗涤3次，再用无 水硫酸钠脱水，最后滤出无水硫酸钠，至萃取液澄清透明。取1.0μl 萃取液进行GC-MS分析。

1.2.6.1GC-MS分析条件

色谱条件色谱柱：DB-5石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)； 升温程序：初始温度60℃，以8℃/min升至190℃，保持2min；每分钟 2℃升至210℃保持5min；载气(He)流速1.0ml/min，进样量1.0μl； 不分流进样。

质谱条件电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度 275℃；离子源温度250℃；质量扫描范围10-400amu；发射电流100mA， 检测电压1.1KV。

1.2.7LPEM818菌株的鉴定

1.2.7.1生理生化学特性分析

按照《伯杰细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》中的方法和 标准对LPEM818菌株进行生理生化特性分析，结果见表一。

表一LPEM818菌株的生理生化特性

  项目   结果   柠檬酸盐利用   -   淀粉水解   -   D-葡萄糖   +   吲哚   -   α-乳糖   +   V-P测定   -   棉籽糖   +   甲基红(M.R)   +   蔗糖   +   明胶液化   -   D-木糖   +   脲酶   -   D-甘露糖   +   卵磷脂酶   +   L-鼠李糖   +   牛奶分解   酸凝   D-半乳糖   +   硫化氢   ±   D-纤维糖   +   硝酸盐还原   -   L-阿拉伯糖   ±   接触酶(过氧化氢酶)   -   赤藓醇   -   脂酶(Tween 80)   +   甘露醇   +   运动性   -   肌醇   +

注：+为阳性反应；-为阴性反应；±为极弱反应

1.2.7.216S rRNA基因序列分析

用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取产酸菌DNA。然后 以总DNA为模板，以27f 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1509r 5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′为上、下游引物扩增16S rRNA基因。

采用上海生工SK2072即用型PCR扩增试剂盒进行PCR反应，反应参数 如下：

94℃  预变性        5min；

72℃  延伸       10min；

取PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增DNA片段的大小，测序。

1.2.7.3同源性比较

得到的PCR序列在GeneBank中利用BLAST程序搜索相似序列，经 ClustalX序列比对后，用MEGA4.1进行系统发育树的构建，自展值 (bootstrap)为1000。

以部分16S rRNA序列为基础的LPEM818菌株的系统发育树如图8 所示。

1.2.8对热稳定性

将LPEM818菌株发酵浓缩液在100℃处理1h，以未处理的样品为对 照，测定其抑菌活性。

1.2.在黑木耳中的抗霉菌的生长作用

本发明中的戊糖乳杆菌LPEM818发酵产物的浓缩液在黑木耳中对添 加的黄曲霉孢子有抑制作用，将2g干黑木耳浸泡于22ml浓缩液和含 1×10⁵个/ml黄曲霉孢子溶液中，此处所述的浓缩液也即戊糖乳杆菌 LPEM818发酵产物的上清液旋转蒸发浓缩10～15倍后得到的浓缩液。使 溶液均匀分布于黑木耳表面，对照1为MRS培养基浓缩液和含1×10⁵个 /ml黄曲霉孢子的溶液，对照2为无菌水和含1×10⁵个/ml黄曲霉孢子 的溶液。将各样品部分置28℃培养，部分置于保鲜袋中室温放置，观察 霉菌生长情况。

2结果与分析

2.1LPEM818菌株的分离纯化

自小米富集液中筛选到LPEM818菌株，镜检为革兰氏阳性。其菌落 为乳白色，菌落凸起、光滑、边缘整齐。

2.2产抑菌物质菌株的筛选

2.2.1牛沣杯双层平板法

产酸菌经浓缩处理的发酵上清液对黄曲霉进行抑菌活力的测定，结 果表明对黄曲霉有明显的抑制作用(如图1)。

2.2.2试管法

在PDA液体培养基中接入黄曲霉孢子28℃，130r/min振荡培养10h， 显微镜下观察到加入LPEM818菌株浓缩液试管中的孢子没有萌发(图4)， 而未加浓缩液试管中的孢子已萌发(图5)。在试管中培养两天后，加有 浓缩液的PDA液体培养基中没有菌丝生长，而在没有添加浓缩液的PDA 液体培养基中长满菌丝，液体培养基表面浮有孢子，如图6所示。上述 试验结果说明菌株LPEM818发酵液浓缩液对黄曲霉孢子萌发有明显抑制 作用。

2.3抑菌谱

以实验室保存的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、植物病原菌等作为 指示菌，检测LPEM818菌株的抑菌效果，检测结果见表二。

表二LPEM818菌株的抑菌谱

2.4气相色谱-质谱分析发酵液成分

采用10％硫酸甲醇为衍生化试剂，利用毛细管气相色谱对发酵液中 的有机酸进行了定性分析。

测定结果如图7所示，图7中的1为琥珀酸，2为柠檬酸，3为棕 榈酸，4为油酸，5为硬脂酸，6为亚油酸。

因此发酵液中有机酸的主要成分即为琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸、油 酸、硬脂酸和亚油酸。

2.5LPEM818菌株的鉴定

根据细胞为杆状，菌落凸起、光滑、边缘整齐，不还原硝酸盐，不 液化明胶，接触酶为阴性。依据《伯杰氏细菌分类手册》、《常见细菌系 统鉴定手册》可以将LPEM818菌株确定为乳杆菌属，与16SrDNA分析结 果一致。同时根据16SrDNA同源性分析构建的进化树发现LPEM818菌株 的同源性与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和戊糖乳杆菌 (Lactobacillus pentosus)最相近(图8)，D-葡萄糖、α-乳糖、棉籽 糖、蔗糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-纤维糖、L-阿拉伯糖实验 结果与植物乳杆菌和戊糖乳杆菌都一致，但戊糖乳杆菌可以分解L-鼠李 糖，植物乳杆菌不可以分解L-鼠李糖。所以将LPEM818菌株确定为戊糖 乳杆菌(Lactobacillus pentosus)。

该菌株16SrDNA序列如下：

GTGAAGGTGACGCTGGCGGCGTGCCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTG ATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGG AAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTT GGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTCTGGATGGTCCCGCGGC GTATTAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAG GGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG AATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCG GCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACG GTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGC AAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTG AAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGG ACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGA AGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCT TCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAAC TCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACG CGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCG GGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGA GACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGA CCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGC TAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGG AATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACAC CGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACC AGCCGCCTAACGGTGGACCCAT

2.7对热稳定性

将LPEM818菌株发酵浓缩液在100℃处理1h，以未处理的样品为对 照，测定其抑菌活性。结果表明：高温处理后发酵液的活性和为加热的 发酵液基本相同。

2.8在黑木耳保藏中对霉菌的抑制作用

在用发酵浓缩液和含黄曲霉孢子的溶液浸泡市售黑木耳后，28℃培 养3d后，实验组黑木耳上没有发现霉菌生长，说明浓缩液可明显抑制黄 曲霉孢子的萌发(图9)，而对照组黑木耳上有明显的霉菌菌丝生长，参 见图10右上方的白色物。