苦楝皮在制备抑制甲型H1N1流感病毒药物中的应用

摘要

苦楝皮在制备抑制甲型H1N1流感病毒药物中的应用，属于中药应用领域。本发明是通过以下技术方案实施的：首先制备苦楝皮溶液，取神经氨酸酶溶液和苦楝皮溶液在37℃培养箱中孵育30分钟，然后加入MUNANA的缓冲溶液，用Bio-Red FLx-800荧光酶标仪进行检测。本发明为苦楝皮发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域；本发明以苦楝皮生药材、苦楝皮提取物抑制甲型H1N1病毒，效果显著，为今后开发出一种新的抑制甲型H1N1流感病毒的药物奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于中药应用领域，具体涉及苦楝皮在制备抑制甲型H1N1流感病 毒药物中的应用。

背景技术

自从2009年3月18日墨西哥发现首例甲型H1N1流感病例，2009年4月27日美 国在一名加利福尼亚州患者身上获得并分离得到的病毒基因序列。研究表明： 这种病毒基因组由禽流感、猪流感和人流感病毒基因混合而成，是一种新型的 甲型H1N1流感病毒，它所引起的流感具有高度传染、传播迅速、易流行的特点

甲型流感病毒传染性高、传播迅速、易发生流行、变异速度快，而疫苗研 究和生产速度较慢，使得化学药物和流感病毒疫苗难以发挥其最佳治疗和预防 效果。中草药具有抑制流感病毒复制、阻止病毒致细胞病变、调节免疫、镇痛 抗炎等综合功效，在防治流感病毒方面具有独特的优势。

苦楝皮，来源于楝科植物川楝的干燥树皮及根皮，具有如下作用：

1、驱虫作用：川楝、苦楝的根皮或干皮中所含的苦楝素有驱蛔作。其酒 精提取物在体外对猪蛔，特别对其头部有麻痹作用。25％～50％苦楝皮药液 在体外对小鼠蛲虫也有麻痹作用。苦楝皮提取液尚有一定的抗血吸虫作用。

2、抗真菌作用：苦楝子乙醇浸液(1∶4)在试管内对黄色毛癣菌、同心 性毛癣菌、许兰毛癣菌、奥杜盎小芽胞癣菌、铁锈色小芽胞癣菌、羊毛状小芽 胞癣菌、红色皮肤癣菌、星形奴卡菌等常见的致病性真菌，有较明显的抑制作用。

3、对肌肉收缩的作用：实验表明，川楝素对骨骼肌由直接刺激引起的收 缩反应有增强作用。

4、研究表明，川楝素有抗肉毒杆菌毒素的作用.川楝素能显著延长肉毒 中毒标本对间接刺激收缩反应的麻痹时间，提示其能在神经肌肉接头处对抗肉 毒的阻遏作用。

迄今为止，尚未有关于苦楝皮在制备抑制甲型H1N1流感病毒药物中的应 用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供苦楝皮在制备抑制甲型H1N1流感病毒药物中的应 用。本发明是通过以下技术方案实施的：苦楝皮在制备抑制甲型H1N1流感病 毒药物中的应用。所述苦楝皮为生药材或苦楝皮提取物中的一种。所述的苦楝 皮提取物的制备方法为：将苦楝皮用蒸馏水浸泡过夜后，过滤，得第一次浸泡 过滤后所得液体和过滤后的苦楝皮，将过滤后的苦楝皮再加入蒸馏水浸泡过夜 后，以文火加热煮中药3-5小时，过滤，得熬煮过滤后的液体，将第一次浸泡过 滤后所得液体和熬煮过滤后所得液体混合，得到混合溶液，冻干混合溶液后得 到苦楝皮粉末，所述浸泡苦楝皮的溶液为甲醇或乙醇中的一种。

将所述冻干后的苦楝皮粉末溶解用蒸馏水溶解至浓度为10mg/mL，得苦楝 皮溶液。将神经氨酸酶溶解在MES缓冲液(PH 6.5)和CaCl₂中，得神经氨酸酶溶 液，取神经氨酸酶溶液和苦楝皮溶液在37℃培养箱中孵育30分钟，然后加入 MUNANA的缓冲溶液，立即用Bio-Red FLx-800荧光酶标仪进行检测，激发波 长360nm，发射波长450nm，测定时间为8min。

对0.001-0.1U的神经氨酸酶，对其具有抑制作用的苦楝皮溶液浓度为 31.25-250ug/mL。

本发明的原理：本发明的效果主要是通过对神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的 抑制能力来验证的。NA是甲型H1N1流感病毒最重要的蛋白之一，在病毒从感染 细胞中的释放的过程中，特别是病毒复制周期后期，NA起主要作用。由于它具 有酶功能，能水解细胞膜上各种糖蛋白受体末端的唾液酸，因此，NA能够清除 病毒颗粒表面糖蛋白末端的唾液酸，防止病毒的自我聚积，促使子代病毒释放。 另外，NA是一个重要的抗原，并且是病毒穿透呼吸道上皮黏液所必需的。NA 一旦发生突变，可导致甲型H1N1流感病毒对神经氨酸酶抑制剂产生抗性作用。

本发明的有益效果：

1、本发明为苦楝皮发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

2、本发明以苦楝皮生药材、苦楝皮提取物抑制甲型H1N1病毒，效果显著， 苦楝皮对神经氨酸酶的半数抑制浓度(IC₅₀)为IC₅₀(μg/mL)＝184.3±13.1和IC₅₀(μg/mL)＝0.76±0.27，本发明提供了苦楝皮在作为抑制甲型H1N1流感病毒的药 物中活性成分的应用，为今后开发出一种新的抑制甲型H1N1流感病毒的药物 奠定基础。

附图说明

图1为细胞相对活力与苦楝皮溶液浓度的关系；

图2为苦楝皮溶液浓度与病毒产量的MTT检测图。

具体实施方式

以下通过实例形式的具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

称取10g粉碎的苦楝皮，100ml蒸馏水浸泡过夜，过滤，得第一次浸泡过 滤后所得液体和过滤后的苦楝皮，在过滤后的苦楝皮中再加入100ml蒸馏水， 浸泡过夜后，以文火加热煮中药4小时，过滤，得熬煮过滤后的液体，将第一 次浸泡过滤后所得液体和熬煮过滤后所得液体混合，得到混合溶液，冻干混合 溶液后得到苦楝皮粉末。将苦楝皮粉末用蒸馏水溶解至浓度为10mg/mL，得苦 楝皮溶液。

实施例2

将神经氨酸酶(A/California/7/2009(H1N1)NYMC X-179A c流感病毒株，经 鸡胚传代，收尿囊液，-70℃保存备用)溶解在32.5mmol/L的MES缓冲液(PH 6.5) 和4mmol/L CaCl₂中，得神经氨酸酶溶液，取49μL神经氨酸酶溶液和1μl苦楝 皮溶液在37℃培养箱中孵育30分钟，然后加入终浓度为20μmol/L的MUNANA 的缓冲溶液50μl，立即用Bio-Red FLx-800荧光酶标仪进行检测，激发波长360nm， 发射波长450nm，测定时间为8min。检测结果为，苦楝皮对神经氨酸酶的半数 抑制浓度(IC₅₀)为IC₅₀(μg/mL)＝184.3±13.1。

实施例3

将神经氨酸酶(Clostridium perfringens(C.welchii)，N2876，购于Sigma) 溶解在32.5mmol/L的MES缓冲液(PH 6.5)和4mmol/L CaCl₂中，得神经氨酸酶溶 液，取49μl神经氨酸酶溶液和1μl苦楝皮溶液在37℃培养箱中孵育30分钟，然后 加入终浓度为20μmol/L的MUNANA的缓冲溶液50μl，立即用Bio-Red FLx-800 荧光酶标仪进行检测，激发波长360nm，发射波长450nm，测定时间为8min。抑制 程度的强弱可以从加或不加苦楝皮的初始反应速率来决定检测结果为，苦楝皮对 神经氨酸酶的半数抑制浓度(IC₅₀)为IC₅₀(μg/mL)＝0.76±0.27。

实施例4

结合图1图2说明本实施例。

为了检测苦楝皮在细胞水平的抗流感作用，我们将由实施例1得到的苦楝皮 溶液按梯度稀释成不同的浓度，分别为31.25ug/ML、62.5ug/ML、125ug/ML和 250ug/ML，将上述苦楝皮溶液分别与100TCID50的病毒等体积孵育2小时，总体 积为200μL，并且稀释液都用维持液(即无血清，含10ug/ml胰酶的DMEM)， 然后将上述一系列苦楝皮溶液与100TCID50的病毒的混合物接种到已经长成单 层的MDCK细胞培养板上，2小时后，换不含FBS的维持液，24小时后换含2％FBS 的维持液，连续观察2-3天，用MTT法检测细胞病变效果。同时设只加维持液、 只加同稀释度的病毒液或者只加不同浓度药物稀释液作为对照组，于37℃、 5％CO₂培养，对中药苦楝皮进行抗病毒活性研究。

结果如图1所示，在没有加入H1N1病毒时，细胞活力随着苦楝皮浓度的增 加呈现降低趋势，说明苦楝皮提取物具有细胞毒性；在同时加入苦楝皮提取物 和H1N1病毒时，随着苦楝皮提取物浓度的增加，细胞活力也随着增加。说明苦 楝皮可以抑制流感病毒，保护MDCK细胞免受病毒破坏，而且保护效应随着苦 楝皮提取物浓度的增加而增加即呈现浓度依赖性。

图2为苦楝皮溶液浓度与病毒产量的MTT检测图，由图可见，随药物浓度的 提高，病毒产量逐渐下降，这同时辅证了苦楝皮有较好抗流感病毒作用。

实施例5

为了进一步说明苦楝皮具有抗流感病毒的活性，我们做了动物实验。将六 星期大的雌性BALB/c小鼠(由长春生物制品研究所提供)用50μl 0.2％戊巴比妥 钠麻醉，滴鼻吸入50μl A/FM/1/47(H1N1)流感病毒(由白求恩医科大学分子生 物实验室提供)。将小鼠分成五组，每组十只，一、二、三组每十五天分别喂 饲40，80和160mg/kg的苦楝皮提取物，第一次喂饲在小鼠被流感病毒感染之前 两天实施。每十五天观察一下小鼠的死亡率。结果如表3所示，从中可以看出喂 饲苦楝皮提取物的三组小鼠的死亡之书只数明显小于病毒组，生存天数也明显 长于病毒组，说明苦楝皮可以增加被流感病毒感染的小鼠的存活率。

表3