一种钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定方法

摘要

本发明涉及一种钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定方法。采用的技术方案是：包括如下步骤：1）获得钝齿棒杆菌噬菌体分离株；2）提取钝齿棒杆菌噬菌体DNA；3）钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定：分别用引物P1和引物P2对提取的钝齿棒杆菌噬菌体DNA进行PCR扩增；取PCR反应液在琼脂糖凝胶中进行电泳；所述的引物P1的碱基序列为：GTTTCGCTCC；所述的引物P2的碱基序列为：TCGCTGCGA。本发明简便，快速，分辨率高，可以鉴定钝齿棒杆菌的不同噬菌体分离株。

说明书

技术领域

本发明涉及一种噬菌体分型鉴定方法，特别涉及钝齿棒杆菌噬菌体的分型鉴定方法。

背景技术

目前，对噬菌体的分类依据主要有：①噬菌体形态；②噬菌体生理生化和物理性质；③ 噬菌体基因组组成；④ 噬菌体蛋白；⑤噬菌体脂类含量和特性；⑥ 噬菌体碳水化合物含量和特性。这些依据适于对种以上的噬菌体的分类鉴定，而对同种不同噬菌体分离株却不能加以分类鉴定。

钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）噬菌体是感染氨基酸发酵生产菌——钝齿棒杆菌的噬菌体。在氨基酸发酵生产的环境中钝齿棒杆菌噬菌体的种类繁多，致使噬菌体污染问题一直严重威胁着氨基酸的发酵生产。为了防治氨基酸发酵生产中的噬菌体污染问题，发酵生产过程中，需要经常对感染钝齿棒杆菌的噬菌体进行检测，以尽早发现噬菌体污染，及时采取有效补救措施。为了从根本上杜绝生产中的噬菌体污染，必须研究建立防治钝齿棒杆菌噬菌体污染的有效方法。这些工作均需要一种对不同种类钝齿棒杆菌噬菌体进行分型鉴定的方法。

现在，对不同的钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定的方法，一直采用传统的血清分型方法。血清分型方法是对微生物分类鉴定的传统方法之一，虽然此方法对噬菌体的抗原表位具有较好的特异性，但由于氨基酸生产环境中钝齿棒杆菌噬菌体种类繁多，变异较快，所以，一次制备的抗血清不能满足对不同钝齿棒杆菌噬菌体的分型鉴定的要求。另外，此方法也存在操作时间长，成本高等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便，快速，分辨率高的分型鉴定钝齿棒杆菌噬菌体的方法。本发明可以鉴定钝齿棒杆菌的不同噬菌体分离株。

本发明采用的技术方案是：一种钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定方法，包括如下步骤：

1）获得钝齿棒杆菌噬菌体分离株；

2）提取钝齿棒杆菌噬菌体DNA； 

3）钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定：分别用引物P1和引物P2对提取的钝齿棒杆菌噬菌体DNA进行PCR扩增，

PCR反应体系：Taq酶12.5ul、10uM引物1.25ul、DNA模板1ul和纯水10.25ul；

PCR反应条件：

预变性：94℃ 2 min；

变性：94℃ 1 min，退火：36℃ 1 min，延伸72℃ 2 min ，40次循环；

72℃ 延伸10 min终止反应，产物4℃保存；

取PCR反应液在琼脂糖凝胶中进行电泳；

所述的引物P1的碱基序列为：GTTTCGCTCC；

所述的引物P2的碱基序列为：TCGCTGCGA。

上述的一种钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定方法，其中所述的获得钝齿棒杆菌噬菌体分离株，可以采用现有技术中已有的任何方法，只要从样液中分离获得钝齿棒杆菌噬菌体分离株即可，而不具体限定其获得的方法。

钝齿棒杆菌噬菌体分离株的获得还可以采用如下步骤：（1）样品的处理：将水样样品，经由8层纱布过滤后，4000 rpm离心20 min，去除比较大的杂质颗粒，再用无菌的0.22 um 过滤器过滤，收集过滤液，置于4 ℃冰箱保存；(2) 噬菌体的富集：取过滤液80 ml与5倍浓度的LB培养基20 ml混合，加入终浓度为0.1 mmol/L的CaCl₂溶液，以1%接种量向其接入对数末期（约12 h）的钝齿棒杆菌悬液，30 ℃，恒温静置培养24 h；(3)噬菌体的扩增：将富集的培养液在12000 rpm条件下，离心20 min，再经0.22 um滤膜过滤，收集滤液。将此滤液以1%接种量接入新鲜无菌LB液体培养基中，再向其接入1%的对数末期的钝齿棒杆菌悬液，30 ℃，180 rpm恒温振荡培养6 h；(4) 噬菌体的平板分离：将上述扩增后的噬菌体液进行稀释，将 0.1 ml噬菌体稀释液和0.3 ml对数末期的钝齿棒杆菌悬液混合，制成双层平板。30 ℃，恒温培养12 h；(5) 噬菌体纯化：挑取双层平板上的不同噬菌斑，反复扩增3次，获得纯化的噬菌体分离株。

上述的钝齿棒杆菌噬菌体分离株的获得，其中钝齿棒杆菌是钝齿棒杆菌CGMCC 1.542。

本发明采用人工合成的随机寡核苷酸片断作为引物（即随机引物），以基因组总DNA 作为模板，对钝齿棒杆菌噬菌体DNA进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分离，检测扩增产物DNA 片段的多态性图谱，通过分析PCR产物图谱，区分不同钝齿棒杆菌噬菌体株的遗传差异性，以此对不同钝齿棒杆菌噬菌体分离株进行分型鉴定。

随机引物的筛选：随机引物有10种，即：P1：GTTTCGCTCC，P2：TCGCTGCGA，P3：GGGAACCGTC，P4：TCCAACGGCT，P5：TCACCAGCCA ，P6：GGACGTTGAG ，P7：CACCACTAGG ，P8：CTCTGGAGAC ，P9：CATCCCCCTG ，P10：CCGAAGGGTG。上述引物由上海生物工程公司合成。具体筛选方法如下：

1）获得钝齿棒杆菌噬菌体：用标准的钝齿棒杆菌噬菌体ФG1 IVCAS 3.0076进行引物的筛选。

2）提取钝齿棒杆菌噬菌体DNA：将纯化的噬菌体液经8000 rpm离心10 min，用0.22 um滤膜过滤，分别加入终浓度为1ug/mL的DNase I和RNase A，37℃温育30 min。取700 ul消化后的噬菌体液，加入70 ul浓度为10%的SDS，4.2 ul浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，65℃温育30 min，再加入等体积酚/氯仿（酚：氯仿：异丙醇=25：24：1），12000 rpm离心7 min，取上层水相，加入1倍体积的3 mol/L乙酸钠，2倍体积的无水乙醇，冰上放置20 min，接着12000 rpm离心10 min，加入1ml 浓度为80%乙醇，12000 rpm离心10 min，沉淀物于室温下风干，将沉淀溶解于20 ul的TE  (10 mM Tris-HCI，1mM EDTA；pH 8.0) 缓冲液中。

3）钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定：将提取的噬菌体DNA分别经引物P1～P10进行PCR扩增；

PCR 的反应体系：Taq酶12.5 ul，引物（10 uM）1.25 ul，DNA模板1 ul，纯水10.25 ul，反应总体积25 ul；

PCR反应条件：

预变性：94℃ 2 min；

变性：94℃ 1 min，退火：36℃ 1 min，延伸72℃ 2 min ，40次循环；

72℃ 延伸10 min终止反应，产物4℃保存；

取PCR反应液在琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳图谱结果如图1。

为了对钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定的随机引物进行筛选，以条带稳定、丰富、清晰为标准, 确定最佳引物。如图1所示，泳道1为1 kb Marker，泳道2-11依次为随机引物1-10，泳道12为阴性对照。由图1可见，以随机引物P1和随机引物P2扩增出现的信息含量丰富，因此选用随机引物P1和随机引物P2作为本发明对噬菌体分型鉴定的引物。

本发明的有益效果是：由于本发明是基于PCR技术，对模板DNA要求不高，分型操作时间短，分辨率高。本发明只需引物P1和P2即可将样液中获得的不同钝齿棒杆菌噬菌体株进行分型鉴定，成本低。本发明可用来解决氨基酸发酵生产过程中的钝齿棒杆菌噬菌体污染的监测和对氨基酸发酵生产环境中钝齿棒杆菌噬菌体的分型鉴定等问题。

附图说明

图1是钝齿棒杆菌噬菌体ФG1 IVCAS 3.0076的随机引物筛选结果的电泳图谱。

图2A 是使用随机引物P1扩增5株标准钝齿棒杆菌噬菌体的PCR产物的电泳图谱；

图中，泳道1为1 kb marker，泳道2-6分别为钝齿棒杆菌噬菌体ФG1 IVCAS 3.0076、ФG3 IVCAS 3.0077、ФG8 IVCAS 3.0078、ФG12 IVCAS 3.0079、ФG15 IVCAS 3.0080 的PCR产物。

图2B是使用随机引物P2扩增5株标准钝齿棒杆菌噬菌体的PCR产物的电泳图谱；

图中，泳道1为1kb Marker，泳道2-6分别为钝齿棒杆菌噬菌体ФG1 IVCAS 3.0076、ФG3 IVCAS 3.0077、ФG8 IVCAS 3.0078、ФG12 IVCAS 3.0079、ФG15 IVCAS 3.0080 的PCR产物。

图3A是使用随机引物P1扩增样品中获得的3株钝齿棒杆菌噬菌体分离株的PCR产物的电泳图谱；

图中，泳道1为1 kb marker，泳道2-4分别为钝齿棒杆菌噬菌体分离株Cp09-001，Cp09-002和Cp09-003 的PCR产物。

图3B是使用随机引物P2扩增样品中获得的3株钝齿棒杆菌噬菌体分离株的PCR产物的电泳图谱；

图中，泳道1为1 kb marker，泳道2-4分别为钝齿棒杆菌噬菌体分离株Cp09-001，Cp09-002和Cp09-003的PCR产物。

具体实施方式

实施例1   可行性验证

1）钝齿棒杆菌噬菌体的获得： 5株标准钝齿棒杆菌噬菌体分别为ФG1 IVCAS 3.0076、ФG3 IVCAS 3.0077、ФG8 IVCAS 3.0078、ФG12 IVCAS 3.0079、ФG15 IVCAS 3.0080。

标准钝齿棒杆菌噬菌体ФG1 IVCAS 3.0076、ФG3 IVCAS 3.0077、ФG8 IVCAS 3.0078、ФG12 IVCAS 3.0079和ФG15 IVCAS 3.0080购于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

2） 钝齿棒杆菌噬菌体DNA的提取：将纯化的噬菌体液经8000 rpm离心10 min，用0.22um滤膜过滤，分别加入终浓度为1ug/mL的DNase I和RNase A，37℃温育30 min。取700 ul消化后的噬菌体液，加入70 ul浓度为10%的SDS，4.2 ul浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，65℃温育30 min，再加入等体积酚/氯仿（酚：氯仿：异丙醇=25：24：1），12000 rpm离心7 min，取上层水相，加入1倍体积的3 mol/L乙酸钠，2倍体积的无水乙醇，冰上放置20 min，接着12000 rpm离心10 min，加入1 ml 80%乙醇，12000 rpm离心10 min，沉淀物于室温下风干，将沉淀溶解于20 ul的TE  (10 mM Tris-HCI，1 mM EDTA；pH8.0) 缓冲液中。

3）钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定：将提取的噬菌体DNA分别经引物P1和P2进行PCR扩增；

PCR 的反应体系：Taq酶12.5 ul，引物（10 uM）1.25 ul，DNA模板1 ul，纯水10.25 ul，反应总体积25 ul；

PCR反应条件：

预变性：94℃ 2 min；

变性：94℃ 1 min，退火：36℃ 1 min，延伸72℃ 2 min ，40次循环；

72℃ 延伸10 min终止反应，产物4℃保存；

取PCR反应液在琼脂糖凝胶中进行电泳，采用引物P1的结果如图2A，采用引物P2的结果如图2B。

为验证本发明用于钝齿棒杆菌噬菌体分型的可行性，使用随机引物P1和P2对5株标准钝齿棒杆菌噬菌体ФG1 IVCAS 3.0076、ФG3 IVCAS 3.0077、ФG8 IVCAS 3.0078、ФG12 IVCAS 3.0079、ФG15 IVCAS 3.0080进行分型鉴定。

由图2A可以看出，使用随机引物P1，尽管泳道4，6的带型相同，但泳道2，3, 5的带型明显不同。然而，使用随机引物P2（图2B），泳道2,  3，4，5，6之间的带型明显不同。表明同时使用随机引物P1和随机引物P2，分别对5株钝齿棒杆菌噬菌体DNA进行PCR扩增，根据其电泳结果完全可以将5株钝齿棒杆菌噬菌体进行区分，即可达到对钝齿棒杆菌噬菌体的分型鉴定。

实施例2   实际应用1

钝齿棒杆菌选用钝齿棒杆菌CGMCC 1.542，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

1）获得钝齿棒杆菌噬菌体分离株：取某氨基酸发酵生产环境中排出的废水，经由8层纱布过滤后，4000 rpm离心20 min，去除比较大的杂质颗粒；再用无菌的0.22 um 过滤器过滤，收集过滤液，置于4 ℃冰箱保存。取过滤液80 ml与5倍浓度的LB培养基20 ml混合，加入终浓度为0.1 mmol/L的CaCl₂溶液，以1%接种量向其接入对数末期（约12 h）的钝齿棒杆菌悬液，30 ℃，恒温静置培养24 h。将富集的培养液在12000 rpm条件下，离心20 min，再经0.22 um滤膜过滤，收集滤液。将此滤液以1%接种量接入新鲜无菌LB液体培养基中，再向其接入1%的对数末期的钝齿棒杆菌悬液，30 ℃，180 rpm恒温振荡培养6 h。噬菌体的平板分离  将上述扩增后的噬菌体液进行稀释，将 0.1 ml噬菌体稀释液和0.3 ml对数末期的钝齿棒杆菌悬液混合，制成双层平板。30 ℃，恒温培养12 h。挑取双层平板上的不同噬菌斑，反复扩增3次，得到3株钝齿棒杆菌噬菌体分离株，分别定名为Cp10-001，Cp10-002和Cp10-003。

2）提取钝齿棒杆菌噬菌体DNA；将纯化的噬菌体液经8000 rpm离心10 min，用0.22 um滤膜过滤，分别加入终浓度为1 ug/mL的DNase I和RNase A，37℃温育30 min。取700 ul消化后的噬菌体液，加入70 ul浓度为10%的SDS，4.2 ul浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，65℃温育30 min，再加入等体积酚/氯仿（酚：氯仿：异丙醇=25：24：1），12000 rpm离心7 min，取上层水相，加入1倍体积的3mol/L乙酸钠，2倍体积的无水乙醇，冰上放置20 min，接着12000 rpm离心10 min，加入1ml 80%乙醇，12000 rpm离心10 min，沉淀物于室温下风干，将沉淀溶解于20 ul的TE  (10 mM Tris-HCI，1 mM EDTA；pH8.0) 缓冲液中。 

3）钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定：将提取的钝齿棒杆菌噬菌体DNA分别经引物P1和引物P2进行PCR扩增，

PCR反应体系：Taq酶12.5 ul、10 uM引物1.25 ul、DNA模板1 ul和纯水10.25 ul，反应总体积25 ul；

PCR反应条件：

预变性：94℃ 2 min；

变性：94℃ 1 min，退火：36℃ 1 min，延伸72℃ 2 min ，40次循环；

72℃ 延伸10 min终止反应，产物4℃保存；

取PCR反应液在琼脂糖凝胶中进行电泳。采用引物P1的结果如图3A，采用引物P2的结果如图3B。

由图3A可以看出，使用随机引物P1，泳道2与泳道3, 4的带型明显不同，但泳道3和4的带型几乎相同。而使用随机引物P2（图3B），泳道2, 3的带型几乎相同，而它们与泳道4的带型明显不同。表明获得的3株钝齿棒杆菌噬菌体分离株Cp10-001，Cp10-002和Cp10-003为三种不同类型的钝齿棒杆菌噬菌体。也进一步证明单一使用随机引物P1或P2都不能完全区分3株钝齿棒杆菌噬菌体分离株，但综合随机引物P1和P2的结果可以明显地区分3株钝齿棒杆菌噬菌体。

实施例3   实际应用2

1）获得钝齿棒杆菌噬菌体分离株：分别取某氨基酸发酵生产环境中的排污口水样，发酵废液，车间地沟水样，每个样液经由8层纱布过滤后，4000 rpm离心20 min，去除比较大的杂质颗粒；再用无菌的0.22 um 过滤器过滤，收集过滤液，置于4 ℃冰箱保存。取过滤液80 ml与5倍浓度的LB培养基20 ml混合，加入终浓度为0.1 mmol/L的CaCl₂溶液，以1%接种量向其接入对数末期（约12 h）的钝齿棒杆菌悬液，30 ℃，恒温静置培养24 h。将富集的培养液在12000 rpm条件下，离心20 min，再经0.22 um滤膜过滤，收集滤液。将此滤液以1%接种量接入新鲜无菌LB液体培养基中，再向其接入1%的对数末期的钝齿棒杆菌悬液，30 ℃，180 rpm恒温振荡培养6 h。噬菌体的平板分离  将上述扩增后的噬菌体液进行稀释，将 0.1 ml噬菌体稀释液和0.3 ml对数末期的钝齿棒杆菌悬液混合，制成双层平板。30 ℃，恒温培养12 h。挑取双层平板上的不同噬菌斑，反复扩增3次。在排污口水样，发酵废液，车间地沟水样中分别各获得5株钝齿棒杆菌噬菌体分离株。在每个样品中获得的钝齿棒杆菌噬菌体分离株中各随机选取1株进行以下的实验。

2）提取钝齿棒杆菌噬菌体DNA；将纯化的噬菌体液经8000 rpm离心10 min，用0.22 um滤膜过滤，分别加入终浓度为1 ug/mL的DNase I和RNase A，37℃温育30 min。取700 ul消化后的噬菌体液，加入70 ul浓度为10%的SDS，4.2 ul浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，65℃温育30 min，再加入等体积酚/氯仿（酚：氯仿：异丙醇=25：24：1），12000 rpm离心7 min，取上层水相，加入1倍体积的3mol/L乙酸钠，2倍体积的无水乙醇，冰上放置20 min，接着12000 rpm离心10 min，加入1ml 浓度为80%的乙醇，12000 rpm离心10 min，沉淀物于室温下风干，将沉淀溶解于20 ul的TE  (10 mM Tris-HCI，1 mM EDTA；pH8.0) 缓冲液中。

3）钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定：将提取的3株钝齿棒杆菌噬菌体DNA分别经引物P1和引物P2进行PCR扩增，

PCR反应体系：Taq酶12.5 ul、10 uM引物1.25 ul、DNA模板1ul和纯水10.25 ul，反应总体积25 ul；

PCR反应条件：

预变性：94℃ 2 min；

变性：94℃ 1 min，退火：36℃ 1 min，延伸72℃ 2 min ，40次循环；

72℃ 延伸10 min终止反应，产物4℃保存。

PCR反应液在琼脂糖凝胶中进行电泳后的分析结果表明，使用P1引物，在3株噬菌体中，来源于发酵废液和车间地沟水样的噬菌体的PCR扩增结果的电泳图谱带型相同，而使用P2引物，则来源于排污口水样和车间地沟水样的噬菌体的PCR扩增结果的电泳图谱带型相同，综合分析使用P1引物和使用P2引物的实验结果，表明3个样品中的钝齿棒杆菌噬菌体分离株是不同的。

综合以上实验结果可以看出，只选定随机引物P1或P2都不能用来分型鉴定钝齿棒杆菌噬菌体分离株，但同时选用随机引物P1和P2，完全可以将获得的不同钝齿棒杆菌噬菌体分离株区分开来。

在以上实施例中，针对钝齿棒杆菌噬菌体分离株的获得提供了一种具体的方法，但是本发明钝齿棒杆菌噬菌体分离株的获得方法并不限于上述方法，本领域的技术人员根据现有技术中公开的方法，只要从样液中能够获得钝齿棒杆菌噬菌体分离株即可，本发明的关键在于采用RAPD的技术，从众多的引物中筛选出引物P1和P2，同时使用引物P1和P2进行PCR扩增即可对钝齿棒杆菌噬菌体分型鉴定。对于钝齿棒杆菌噬菌体DNA的提取，提供一种具体的方法，同样本发明对于钝齿棒杆菌噬菌体DNA的提取并不限于上述方法，本领域的技术人员根据现有技术中公开的方法，只要从钝齿棒杆菌噬菌体中提取其DNA即可。