一种从酵母发酵液中分离纯化赤藓糖醇的方法

摘要

本发明公开一种从酵母发酵液中分离纯化赤藓糖醇的方法。该制备方法的步骤包括发酵液预处理、上清液处理、脱盐、过柱液浓缩、结晶和重结晶。本发明方法以赤藓糖醇收率为指标，采用单因子实验、正交实验相结合的静态优化方法，优化了提纯工艺，工艺条件合理，具有良好的功效稳定性。本发明能解决目前该产品生产工艺复杂，无法将发酵液中大量的可溶性蛋白、大分子有机物予以分离和收率低等问题，且具有条件温和、生产周期短、产品色泽洁白、纯度高、易于工业化生产等优势。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地说是一种从酵母发酵液中分离纯化赤藓糖醇的方 法。

背景技术

赤藓糖醇(1，2，3，4-丁四醇)是一种天然的四碳糖醇。它广泛存在于海藻、蘑菇、瓜 类、葡萄、梨以及发酵食品中；同时，也存在于人和动物的组织及体液中。它外观为白 色的结晶性粉末，无异味，具有蔗糖甜度约75％甜度物质。

赤藓糖醇作为一种最热门的天然低热值甜味料如今在食品工业中已广泛应用。由于 赤藓糖醇的溶解热比较低，溶解时的吸热作用很强，入口中时会产生清凉感觉，因此将 其使用在巧克力、八宝粥、糖果等食品中，品尝之后会有一种冰凉清爽感觉。除此之外， 赤藓糖醇还具有低能量值、高耐受量、无副作用、糖尿病人可食用、非致龋齿性等优越 特性，极其适合应用于功能性食品中。

目前研究和应用最多的是以葡萄糖为原料的发酵法生产赤藓糖醇的工艺方法。一般 经耐高渗酵母菌株发酵产生赤藓糖醇及少量的核糖醇、丙三醇等副产物，经分离、提取、 精制，获得高纯度的赤藓糖醇产品，产品得率大约60％。有关从发酵液中分离提纯赤藓 糖醇的研究文献和专利技术比较少，CN101182282A详细叙述一种从发酵液中分离提纯 赤藓糖醇的方法，包括发酵液菌体分离、发酵液澄清和初步净化、脱色和净化、发酵液 浓缩结晶、重结晶得到赤藓糖醇纯品；CN101085720A公开一种赤藓糖醇发酵液的提纯 处理方法，主要创新点是提供一种利用膜分离和膜脱色的生产工艺，赤藓糖醇发酵液进 行高效分离、脱色获得透析液。但是，已有的工艺方法都存在一些问题，不能实现赤藓 糖醇的品质提升。因此，研究如何在现有的技术基础上，将发酵液中赤藓糖醇高效、安 全、低成本地提纯为符合国际标准要求的合格赤藓糖醇具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了改进现有技术的不足而提供了一种从酵母发酵 液中分离纯化赤藓糖醇的方法。该方法具有工艺简单、品质稳定、产品收率高、性能好 等优点。

本发明的技术方案如下：一种从酵母发酵液中分离纯化赤藓糖醇的方法，其具体步 骤如下：

(1)发酵液预处理：将发酵液离心，得菌体与上清液，上清液加热至80-90℃，恒温 10-30min，备用；

(2)上清液处理：将步骤(1)中处理后的上清液先经微孔滤膜过滤，再用超滤膜超 滤，获得滤液；

(3)脱盐：将步骤(2)的滤液先通过阳离子交换树脂柱，再通过阴离子交换树脂柱， 控制阴、阳柱温度，收集脱盐的过柱液；

(4)过柱液浓缩、结晶：将步骤(3)的过柱液在65-75℃下旋转蒸发，浓缩至赤藓 糖醇的质量浓度为60-70％；浓缩液结晶，边搅拌边降温至5-15℃，保温使赤藓 糖醇晶体析出；离心，获得粗赤藓糖醇晶体；

(5)重结晶：将步骤(4)的粗赤藓糖醇晶体与溶剂混合均匀后，加热使粗赤藓糖醇 晶体完全溶解；搅拌并降温至5-15℃，保温至溶液中不再析出赤藓糖醇晶体； 离心，45-60℃下真空干燥，获得赤藓糖醇晶体。

优选步骤(2)中所述的微孔滤膜孔径为0.22-0.6μm，材质为聚四氟乙烯、聚醚 砜或混合纤维素酯；所述的超滤膜的截留分子量为2000-4000，材质为聚醚砜、聚酰胺 或聚碳酸酯。

优选步骤(1)、(4)和(5)中离心均采用4000-5000rmp转速，离心时间均为10-20min。

优选步骤(3)中阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂；阴离子交换树脂 为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。阳离子交换树脂、阴离子交换树脂分开装柱，树脂 装柱后的高径比均为7-16，柱温为30-40℃。

优选步骤(4)中结晶时搅拌速度为150-200rpm，降温速度为5-10℃/h。优选步骤 (4)和(5)中所述保温时间均为2-10h。

优选步骤(5)中所述的溶剂为甲醇的水溶液、乙醇的水溶液或丙醇的水溶液，其 中醇占整个溶液的体积分数为15-60％。优选步骤(5)中所述的粗赤藓糖醇晶体与溶剂 质量比为1∶(1-2.5)；步骤(5)中加热使粗赤藓糖醇晶体完全溶解的温度为80-90℃； 步骤(5)中结晶时搅拌速度为150-200rpm，降温速度为15-25℃/h。

本发明所述的酵母，其分类命名为酿酒酵母，菌种的拉丁学名是Saccharomyces  cerevisiae，参据的微生物：NJWGYH30566，由本实验室选育并保藏于中国普通微生物 菌种保藏管理保藏中心(北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物所)，其简 称为CGMCC，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.4349。

上述酵母Saccharomyces cerevisiae NJWGYH30566是由本实验室从南京郊区养蜂 场生产的蜂蜜、糖厂的废液中分离得到，薄层色谱法(TLC)初筛得到11株产赤藓糖醇的 菌株；经摇瓶复筛，用HPLC(高效液相色谱)检测获得一株赤藓糖醇产生菌株，通过 生理生化特性实验和26S rDNA序列相似性分析，分类鉴定命名为酿酒酵母，并保藏于 中国普通微生物菌种保藏管理中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC  No.4349，保藏日期是：2010年11月15日。以此菌种作为生产菌株。

CGMCC No.4349菌株具有下述性质：

1、形态特征：

菌落在PDA培养基上，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，有光泽；在光学显微 镜下，细胞圆形和椭圆形。

2、生理生化性质：

表1CGMCC No.4349菌株的生理生化性质

+：为可利用；-：为不可利用

3、26S rDNA序列分析

参考周小玲等的方法从新鲜菌体提取基因组DNA(周小玲，沈微，饶志群等.一 种快速提取真菌染色体的方法.微生物学通报，2004，31(4)：89-92)，采用酵母通用引物 (NL-1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，NL-4：5′- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)进行26S rDNA扩增，PCR产物经检测、纯化后交 由TAKARA公司进行测序。所测的26S rDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库 中相关种属的序列进行BLAST比较，菌株NJWGYH30566(CGMCC No.4349)的16S rDNA序列与酿酒酵母同源性较高。菌株CGMCC No.4349的26S rDNA序列已经提 交GenBank，接受号为HQ677628(Accession number：HQ677628)。

测得26S rDNA大部分序列558bp，具体如下：

5`-TGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACC TTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTAT GTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCG GTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTG GGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTA CAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAA TTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTT GTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATA AATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCA GCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCC GC-3`

本发明所述方法的优越性主要表现在：

(1)本发明将发酵液依次经过阳离子交换柱和阴离子交换柱，除去大量离子，有利 于赤藓糖醇结晶工序，提高产品收率。此外，树脂无毒性且可反复再生使用， 不使用有机溶剂，操作方便。

(2)本发明将粗赤藓糖醇晶体用易挥发的醇类水溶液重结晶，醇类可回收利用，精 制后的赤藓糖醇质量显著提高，经浓缩、结晶、重结晶得到的赤藓糖醇纯度达 99.6％以上，并且结晶过程成本较低。

(3)本发明发酵液处理、提纯过程简单，工艺条件温和，赤藓糖醇收率高、质量稳 定。

保藏信息

上述酵母Saccharomyces cerevisiae NJWGYH30566是由本实验室选育并保藏于 中国普通微生物菌种保藏管理保藏中心(北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院 微生物所)，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.4349，保藏日期是： 2010年11月15日。

具体实施方式

以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限 定。

实施例1

(1)发酵液预处理：将赤藓糖醇发酵液以4000rpm转速离心10min，得菌体与上清 液，上清液加热至80℃，恒温20min，备用；

(2)上清液处理：将步骤(1)中处理后的上清液先经孔径为0.22μm聚醚砜材质的 微孔滤膜过滤，再用截留分子量为3000的聚醚砜材质的超滤膜超滤，获得滤液；

(3)脱盐：将步骤(2)的滤液先通过001×8强酸性阳离子交换树脂柱，再通过201×7 强碱性阴离子交换树脂柱，阴、阳离子交换树脂分开装柱，树脂装柱高度为 30cm、直径为3cm、柱温为30℃，收集脱盐的过柱液；

(4)脱盐液浓缩、结晶：将步骤(3)的过柱液在65℃下旋转蒸发，浓缩至赤藓糖 醇质量分数为60％；浓缩液以5℃/h的降温速度、150rpm的搅拌速度进行结晶， 冷却至15℃，保温10h使赤藓糖醇晶体析出，以4000rpm转速离心10min，获 得粗赤藓糖醇晶体；

(5)重结晶：将步骤(4)的粗赤藓糖醇晶体与体积分数为15％的甲醇水溶液按质量 比1∶1.5混合后搅拌均匀，加热至80℃使粗赤藓糖醇晶体完全溶解；以15℃/h 的降温速度、150rpm的搅拌速度冷却至15℃，保持恒温5h，待溶液中不再析 出赤藓糖醇晶体，然后以4000rpm转速离心10min，在50℃真空干燥，此时赤 藓糖醇收率为85％，HPLC检测其纯度达99.6％。

实施例2

(1)发酵液预处理：将赤藓糖醇发酵液以4500rpm转速离心20min，得菌体与上清 液，上清液加热至85℃，恒温10min，备用；

(2)上清液处理：将步骤(1)中处理后的上清液先经孔径为0.45μm聚四氟乙烯材 质的微孔滤膜过滤，再用截留分子量为2000的聚碳酸酯材质的超滤膜超滤，获 得滤液；

(3)脱盐：将步骤(2)的滤液先通过7320强酸性阳离子交换树脂柱，再通过201×4 强碱性阴离子交换树脂柱，阴、阳离子交换树脂分开装柱，树脂装柱高度为 35cm、直径为3cm、柱温为35℃，收集脱盐的过柱液；

(4)脱盐液浓缩、结晶：将步骤(3)的过柱液在70℃下旋转蒸发，浓缩至赤藓糖 醇质量分数为65％；浓缩液以5℃/h的降温速度、150rpm的搅拌速度进行结晶， 冷却至10℃，保温5h使赤藓糖醇晶体析出，以4500rpm转速离心10min，获 得粗赤藓糖醇晶体；

(5)重结晶：将步骤(4)的粗赤藓糖醇晶体与体积分数为30％的丙醇水溶液按质量 比1∶1.5混合后搅拌均匀，加热至85℃使粗赤藓糖醇晶体完全溶解；以20℃/h 的降温速度、150rpm的搅拌速度冷却至10℃，保持恒温10h，待溶液中不再析 出赤藓糖醇晶体，然后以4500rpm转速离心10min，在55℃真空干燥，此时赤 藓糖醇收率为90.5％，HPLC检测其纯度达99.6％。

实施例3

(1)发酵液预处理：将赤藓糖醇发酵液以5000rpm转速离心15min，得菌体与上清 液，上清液加热至90℃，恒温15min，备用；

(2)上清液处理：将步骤(1)中处理后的上清液先经孔径为0.45μm聚醚砜材质的 微孔滤膜过滤，再用截留分子量为3500的聚酰胺材质的超滤膜超滤，获得澄清 液；

(3)脱盐：将步骤(2)的澄清液先通过001×7强酸型阳离子交换树脂柱，再通过 201×7强碱性阴离子交换树脂柱，阴、阳离子交换树脂分开装柱，树脂装柱高 度为40cm、直径为3.5cm、柱温为40℃，收集脱盐的过柱液；

(4)脱盐液浓缩、结晶：将步骤(3)的过柱液在75℃下旋转蒸发，浓缩至赤藓糖 醇质量分数为70％；浓缩液以10℃/h的降温速度、200rpm的搅拌速度进行结 晶，冷却至5℃，保温10h使赤藓糖醇晶体析出，以5000rpm转速离心15min， 获得粗赤藓糖醇晶体；

(5)重结晶：将步骤(4)的粗赤藓糖醇晶体与体积分数为15％的乙醇水溶液按重量 比1∶2混合后搅拌均匀，加热至90℃使粗赤藓糖醇晶体完全溶解；以25℃/h的 降温速度、200rpm的搅拌速度冷却至5℃，保持恒温10h，待溶液中不再析出 赤藓糖醇晶体，以5000rpm转速离心15min，在60℃真空干燥，此时赤藓糖醇 收率为99.8％，HPLC检测其纯度达99.8％。

将上述提取工艺制得的赤藓糖醇进行分析，结果如下：

表1实施例1样品检测结果分析

表2实施例2样品检测结果分析

  项目   检测结果   赤藓糖醇(以干品计)，w/％   99.6   干燥减量，w/％   0.16   灼烧残渣，w/％   0.07   葡萄糖，w/％   0.24   核糖醇和丙三醇(以干品计)，w/％   0.08   铅/(mg/kg)   0.80

表3实施例3样品检测结果分析

  项目   检测结果   赤藓糖醇(以干品计)，w/％   99.8   干燥减量，w/％   0.10   灼烧残渣，w/％   0.06   葡萄糖，w/％   0.25   核糖醇和丙三醇(以干品计)，w/％   0.09   铅/(mg/kg)   0.65

由上述检测结果分析，产品均符合《GB 26404-2011食品安全国家标准食品添加剂赤 藓糖醇》指标要求。