一种用于筛检食品中乙酰甲胺磷残留的微生物方法

摘要

本发明提供了一株长双歧杆菌LJM002菌株，保藏号为CGMCC No.4900。LJM002菌株对乙酰甲胺磷超敏感，是检测食品中乙酰甲胺磷残留的工作菌株。本发明还提供了一种筛检食品中乙酰甲胺磷残留的微生物法，根据筛检培养基上抑菌圈的大小判定待测食品样品中乙酰甲胺磷残留量是否超标。本发明提供筛检食品中乙酰甲胺磷残留的方法具有操作简便、费用低廉、灵敏度高、适合样本筛检的特点，更符合我国农药残留检测部门的大量样品筛检要求。

说明书

技术领域

本发明涉及一株长双歧杆菌菌株及其作为工作菌株在筛检食品中乙酰甲胺磷残留的应用。 

背景技术

乙酰甲胺磷，化学名称是O，S-二甲基，N-乙酰基硫代磷酰胺，是杀虫剂甲胺磷(methmaidophos)的N-乙酰基衍生物。国际通用英文名为Acephate，分子式C₄H₁₀NO₃PS，分子量183.16，结构式为： 

乙酰甲胺磷是一种高效、持效期长、内吸性强的广谱性的有机磷杀虫剂，具有胃毒和触杀作用，可杀卵，并有一定熏蒸作用，适用于蔬菜、茶树、水稻、小麦等作物，能有效防治多种咀嚼式及刺吸式口器害虫。 

但乙酰甲胺磷的过量使用，使其在蔬菜水果中高残留，给人们的健康带来巨大的威胁，因此我国已限量使用。2005年1月中华人民共和国卫生部和中国国家标准化管理委员会发布GB2763-2005规定在蔬菜的最大残留限量(maximum residue limits，MRL)为1mg/kg，水果的MRL为0.5mg/kg，并将检测食品中乙酰甲胺磷残留量列为残留监控重点。 

目前，测定乙酰甲胺磷的方法主要有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、化学发光法、酶抑制法、毛细管电泳技术(CE)等。用上述方法检测存在仪器设备复杂、样本前处理和测定操作繁琐的缺陷，不适合大量样本筛检，而且费用高昂，使其推广使用受到限制。 

微生物法突出优点是简便而经济，不需要复杂的仪器设备，在一般的实验条件下就可以进行，可以对大量样本进行快速初筛。但是，工作菌株对待测物 质的敏感性和特异性高低是影响微生物法准确度和精密度的最关键问题。迄今为止，尚无筛选出乙酰甲胺磷敏感性高、特异性高的双歧杆菌工作菌株及其在食品中乙酰甲胺磷残留筛检应用的相关报道。 

发明内容

本发明目的是提供一株对乙酰甲胺磷敏感性高的双歧杆菌。 

本发明的双歧杆菌是：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)LJM002CGMCC No.4900。 

本发明的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)LJM002，已于2011年5月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，保藏编号为CGMCCNo.4900。 

本发明的长双歧杆菌LJM002分离于一名浙江省健康青年人粪便中。 

本发明的长双歧杆菌LJM002菌株具有下述微生物学特征： 

(1)菌落形态：LJM002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光泽、表面光滑、凸起、质地软、边缘整齐，直径1-1.5mm。 

(2)个体形态：为不规则G⁺无芽孢杆菌，有直杆、弯杆、火柴头状、哑铃形状和大雁状，其中以大雁状为主。 

(3)生理生化特征：D-核糖(+)；L-阿拉伯糖(+)；乳糖(+)；纤维二糖(-)；松三糖(+)；棉籽糖(+)；山梨醇(-)；淀粉(-)；葡萄糖酸钠(-)；木糖(+)；甘露糖(-)；果糖(+)；半乳糖(+)；蔗糖(+)；麦芽糖(+)；海藻糖(-)；密二糖(+)；甘露醇(+)；菊糖(-)；水杨素(-)；F6PPK酶(+)；对氧的反应(在好气固体培养基上不生长)；硝酸盐还原(-)；触酶(-)；靛基质反应(-)。 

厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度37-41℃；最低生长温 度25-28℃；最高43-45℃；生长最适pH 6.5-7.0；在pH4.5-5.0或8.0-8.5不生长。 

LJM002菌株与同属同种标准菌株相比对乙酰甲胺磷敏感性提高了100倍以上。 

本发明的另一目的是建立一种应用长双歧杆菌LJM002作为工作菌株筛检食品乙酰甲胺磷残留的微生物法。 

本发明筛检食品乙酰甲胺磷残留的原理是基于乙酰甲胺磷对其敏感的长双歧杆菌LJM002具有明显的抑制作用，将食品样品点样双歧杆菌菌层筛检培养基上，厌氧培养18-24小时后，测定其形成的抑菌圈，根据抑菌圈的大小即可判定待测食品样品中乙酰甲胺磷残留量是否合格。 

本发明是建立一种应用长双歧杆菌LJM002作为工作菌株筛检食品乙酰甲胺磷残留的微生物法，包括步骤： 

1、筛检培养基制备：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7 H₂O 0.5g，MnSO₄·4H₂O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-80 1ml，琼脂15g，显色剂0.1g，蒸馏水1L，将以上成分加热溶解校正pH6.5，115℃高压灭菌15-20分钟。 

显色剂为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-Gal)。 

2、菌悬液制备：长双歧杆菌LJM002接种于营养琼脂的斜面培养基，35±2℃厌氧培养24小时，用灭菌生理盐水将菌苔洗下，制成悬液，置2-8℃冰箱中保存。 

3、菌层平板制备：取直径约90mm、高16～17mm的平板，注入加热融化的筛检培养基20mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层；在已凝固的底层培养基(放冷至48～50℃)上加入菌悬液0.5mL，充分混匀，使在底层上均匀摊布，作为菌层。 

4、样品前处理：取待检的食品样品匀浆组织5g，用无菌1％磷酸盐缓冲液(pH6.0)20ml稀释，漩涡混匀，于80℃水浴加热5min，冷却后于5000r/min 离心15min，取上清液作为供试样品液。 

5、样品测定：在菌层平板的培养皿中放置圆滤纸片(直径13±1mm)，用镊子轻压纸片，使纸片与培养基紧密接触，用微量移液器在圆滤纸片上滴加供试样品液90μl。每个供试样至少重复2个培养皿，35±2℃厌氧培养18～24小时，抑菌圈直径通过抑菌圈电脑测量分析仪测量。 

6、结果判定： 

当抑菌圈≥15mm，判断食品样品中乙酰甲胺磷残留阳性(+)。 

本发明工作菌株为长双歧杆菌LJM002，已于2011年5月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4900。 

本发明步骤2菌悬液为721分光光度计580nm波长下光透过率控制为0.8。 

本发明所述的食品样品包括：白菜、茄子、黄瓜、南瓜、冬瓜、苹果、梨子、桃子等蔬菜水果。 

本发明的优点及效果： 

(1)本发明长双歧杆菌LJM002对乙酰甲胺磷敏感性高、特异性好，可以作为微生物法筛检食品中乙酰甲胺磷残留的工作菌种； 

(2)筛检培养基中添加了X-Gal指示剂，使产生的抑菌圈更加清晰； 

(3)本发明样品前处理简单，能同时筛检大量食品样品； 

(4)本发明检测方法简便易行，具有灵敏度高，精确度高等特点，在蔬菜中最低检测限为0.1mg/kg，低于国家标准的最大残留限量，回收率均大于70％，变异系数在10％以内，符合食品乙酰甲胺磷残留筛检的准确度和精密度要求，完全适合食品中乙酰甲胺磷残留的筛检。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

实施例1 长双歧杆菌LJM002菌株的分离与鉴定 

以一名浙江省健康青年人的粪便作为分离样品，在改良MRS琼脂培养基上，37℃厌氧条件下，48h涂布分离培养，获得本发明所述的长双歧杆菌LJM002，鉴定为长双歧杆菌，该菌株已于2011年5月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，保藏号为CGMCC No.4900。 

改良MRS琼脂培养基的配方：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，MnSO₄·4H₂O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-80 1ml，琼脂15g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-Gal)0.1g，蒸馏水1L，调pH至7.0，115℃灭菌15分钟。 

本发明的LJM002菌株具有下述微生物学特征： 

(1)菌落形态：LJM002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光泽、表面光滑、凸起、质地软、边缘整齐，直径1-1.5mm。 

(2)个体形态：为不规则G⁺无芽孢杆菌，有直杆、弯杆、火柴头状、哑铃形状和大雁状，其中以大雁状为主。 

(3)生理生化特征：D-核糖(+)；L-阿拉伯糖(+)；乳糖(+)；纤维二糖(-)；松三糖(+)；棉籽糖(+)；山梨醇(-)；淀粉(-)；葡萄糖酸钠(-)；木糖(+)；甘露糖(-)；果糖(+)；半乳糖(+)；蔗糖(+)；麦芽糖(+)；海藻糖(-)；密二糖(+)；甘露醇(+)；菊糖(-)；水杨素(-)；F6PPK酶(+)；对氧的反应(在好气固体培养基上不生长)；硝酸盐还原(-)；触酶(-)；靛基质反应(-)。 

厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度37-41℃；最低生长温度25-28℃；最高43-45℃；生长最适pH 6.5-7.0；在pH4.5-5.0或8.0-8.5不生长。 

试验1 敏感性试验 

采用纸片琼脂扩散(K-B)法，选取不同浓度的乙酰甲胺磷标准液，以改良 MRS琼脂培养基，培养基配方见实施例1，以本发明长双歧杆菌LJM002为测试菌，置于37℃培养箱中厌氧培养24h后观察LJM002菌株的生长情况，用纸片琼脂扩散法做乙酰甲胺磷敏感性试验，测定乙酰甲胺磷对LJM002菌株的抑菌性能。 

上述试验做3次重复，以同属同种的长双歧杆菌标准菌株为对照。 

表1 敏感性试验 

试验结果：本发明长双歧杆菌LJM002对乙酰甲胺磷具有高度的敏感性，其与同属标准菌株相比，对乙酰甲胺磷的敏感性提高了100倍以上，长双歧杆菌LJM002的乙酰甲胺磷敏感度≤0.1mg/kg，低于国家标准的最大残留限量(MRL)，完全可以作为筛检乙酰甲胺磷残留的工作菌株。 

试验2 特异性试验 

在平板上相间的牛津杯中分别滴加乙酰甲胺磷参照浓度(0.1mg/kg)标准液和乐果、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏、对硫磷等工作标准液。比较本发明长双歧杆菌LJM002对乐果、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏、对硫磷6种农药的敏感性。 

用以下公式计算乙酰甲胺磷与其他5种农药的交叉反应率。 

试验结果：本发明长双歧杆菌LJM002对乙酰甲胺磷最敏感，对其他5种农药不敏感，在其他5种农药中，LJM002菌株对2倍MRL及其以下剂量水平的各农药均不敏感。 

实施例2 白菜样品中乙酰甲胺磷残留的筛检 

1、筛检培养基制备： 

蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，MnSO₄·4H₂O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-80 1ml，琼脂15g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-Gal)0.1g，蒸馏水1L，将以上成分加热溶解校正pH6.5，115℃高压灭菌15-20分钟。 

2、菌悬液制备： 

长双歧杆菌LJM002接种于营养琼脂的斜面培养基，35±2℃厌氧培养24小时，用灭菌生理盐水将菌苔洗下，制成悬液，在721分光光度计580nm波长下将光透过率控制为0.8，置2～8℃冰箱中保存。 

3、菌层平板制备： 

取直径约90mm、高16～17mm的平板，注入加热融化的筛检培养基20mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层；在已凝固的底层培养基(放冷至48～50℃)上加入菌悬液0.5mL，充分混匀，使在底层上均匀摊布，作为菌层。 

4、样品前处理： 

取待检的白菜样品匀浆组织5g，用无菌1％磷酸盐缓冲液(pH6.0)20ml稀释，漩涡混匀，于80℃水浴加热5min，冷却后于5000r/min离心15min，取上清液作为供试样品液。 

5、样品测定： 

在菌层平板的培养皿中放置圆滤纸片(直径13±1mm)，用镊子轻压纸片，使纸片与培养基紧密接触，用微量移液器在圆滤纸片上滴加供试样品液90μl。每个供试样至少重复2个培养皿，35±2℃厌氧培养18～24小时，抑菌圈直径通过抑菌圈电脑测量分析仪测量。 

6、结果判定： 

当抑菌圈≥15mm，判断食品样品中乙酰甲胺磷残留阳性(+)。 

试验1 标准品精密度的测定 

取浓度为0.1mg/kg，1mg/kg的乙酰甲胺磷标准液，分别用移液器移取90μl加入菌层筛检培养基表面，菌层表面放置的四个圆滤纸片(直径13±1mm)上，每个浓度滴加一个圆滤纸片，重复5个培养皿，35±2℃厌氧培养18-24小时。 

表2 标准品精密度的测定 

注：圆滤纸片直径为13±1mm，圆滤纸片下区不长菌 

试验结果：0.1mg/kg乙酰甲胺磷标准液的变异系数为2.6％，1mg/kg乙酰甲胺磷标准液的变异系数为2.5％。变异系数都在10％以内，符合筛检精密度要求。 

试验2 食品样本精密度的测定 

取农药空白匀浆白菜样品5g，一式三份，使食品中乙酰甲胺磷浓度分别为0.1mg/L，1mg/L，用移液器移取90μl加入菌层培养基表面放置的四个圆滤纸片上，每个浓度滴加2个圆滤纸片，重复3个培养皿，35±2℃培养18～24小时。 

表3 食品样本精密度试验 

试验结果：0.1mg/kg浓度样品碟子间的变异系数为1.83％，总变异系数为2.43％；1mg/kg浓度样品的碟间变异系数为1.77％，总变异系数为2.97％。 

本发明方法变异系数都在10％以内，完全符合农药筛检的精密度要求。 

试验3 食品样本准确度试验 

取农药空白匀浆食品样品各5g，一式五份，使食品中乙酰甲胺磷浓度分别为0.1、0.5、0.75、1、1.25mg/kg，用移液器移取90μl加入菌层培养基表面放置的四个圆滤纸片上，每个浓度滴加2个圆滤纸片，另3个滴入标准液参照浓度。重复5个培养皿，置35±2℃的培养箱中18～24小时，量取抑菌圈直径。 

用以下公式计算乙酰甲胺磷在食品样品中的回收率。 

表4 食品样本准确度试验 

试验结果：食品样品甲乙酰甲胺磷添加回收率为83.2％～98.6％，日间变异系数为1.32％～8.89％，回收率均大于70％，变异系数在10％以内，表明本方法具有较高的准确性和重复性，完全符合我国现行的食品农药残留筛检的要求。 

试验4 假阴性率试验 

称取均质的农药空白食品样品各5g，加入乙酰甲胺磷标准液，使食品中乙酰甲胺磷浓度1mg/kg，测定方法同实施例2，重复测定100次，观察阴性结果出现的概率，计算假阴性率。 

试验结果：黄瓜中乙酰甲胺磷残留为1mg/kg时，假阴性率为0；冬瓜中乙酰甲胺磷残留为1mg/kg时，假阴性率为2％。 

表5 假阴性率试验