用作葡萄糖激酶激活剂的芳基环丙基乙酰胺衍生物

摘要

用于治疗糖尿病的式(A)的化合物以及药物组合物。

说明书

糖尿病是一种渐进性疾病，对寿命和生活质量均会产生不利影响。现 有的口服疗法，无论是单独还是联用，都不能在糖尿病患者中产生足够或 持续的降糖效果。因此，一直需要改进的对糖尿病患者的治疗方法。

葡萄糖激酶激活剂(GKA)代表了一类降糖药，其主要通过在胰腺β细胞 和肝脏中的调节作用来降低血糖。已经公开了多种用于治疗糖尿病的合成 GKA，例如WO 04/063179中所公开的那些。仍然需要可供选择的其它GKA 作为糖尿病患者的治疗药物。

已经证实葡萄糖激酶(GK)对于介导神经元中的葡萄糖感应是非常重 要的。下丘脑中GK的激活抑制了对于胰岛素诱导的低血糖的负调节反应。 因此，GK在脑中被GKA的激活可能通过减少肾上腺素、去甲肾上腺素的 分泌以及低葡萄糖水平下的胰高血糖素水平引起低血糖风险性的增加。血 脑屏障通透性有限的GKA化合物产生严重低血糖的可能性较低。

已经发现本发明的化合物可以在体外以及体内激活葡萄糖激酶。本发 明的化合物显示出比现有的GKA改善了的效力。已发现本发明的化合物 表现出有限的血脑屏障通透性。

本发明涉及可以激活葡萄糖激酶的化合物、包含所述化合物的药物组 合物、治疗与葡萄糖激酶功能障碍有关的疾病的方法以及所述化合物用于 治疗糖尿病、特别是II型糖尿病的用途。

本发明涉及下式化合物或其可药用盐：

本发明的化合物具有两个立构中心(＊)，因此有四种可能的立体异构 体。各个立体异构体以及外消旋或非对映异构体混合物，无论是纯净的还 是部分纯净的，均包括在本发明的范围内。

一种优选的本发明化合物的立体异构体具有如下结构式：

本发明提供了包含本发明化合物或其可药用盐以及可药用的稀释剂或 载体的药物组合物。

本发明提供了用于治疗的式I的化合物或其可药用盐。本发明还提供 了用于治疗糖尿病、特别是II型糖尿病的式I的化合物或其可药用盐。另 一方面，本发明提供了式I的化合物或其可药用盐在制备用于治疗糖尿病、 特别是II型糖尿病的药物中的用途。

本发明提供了治疗糖尿病的方法，该方法包括向需要治疗的人或动物 施用有效量的式I的化合物或其可药用盐。本发明还提供了治疗II型糖尿 病的方法，该方法包括向需要治疗的人或动物施用有效量的式I的化合物 或其可药用盐。

本发明提供了用于治疗的药物组合物，其包含本发明的化合物或其可 药用盐。本发明提供了用于治疗糖尿病、特别是II型糖尿病的药物组合物， 其包含本发明的化合物或其可药用盐。

本文所用的术语“可药用盐”是指对生物体基本上无毒的本发明化合 物的盐。所述的盐以及它们的常用制备方法是本领域众所周知的。参见例 如P.Stahl等，Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties Selection and Use，(VCHA/Wiley-VCH，2002)；和J.Pharm.Sci.66，2-19(1977)。一种优 选的可药用盐是盐酸盐。

优选将本发明的化合物配制成通过各种途径给药的药物组合物的形 式。首选所述的组合物是用于口服给药的组合物。所述药物组合物及其制 备方法是本领域众所周知的。参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(A，Gennaro等编，第19版，Mack Publishing Co.， 1995)。

在本发明的另一方面，将本发明的化合物与一种或多种活性物质联合 给药。所述活性物质包括例如二甲双胍。

联合给药包括同时、顺序或分别给药。

以下实施例中的化合物名称用AutoNom 2000生成。

一般方法：

所有对水或空气敏感的反应均在干燥的溶剂中在惰性气氛下进行。质 谱(MS)在Agilent 1100 MSD质谱仪上采用电喷雾模式获得。旋光度在氯仿 中、在JASCO DIP-370数字旋光仪上用钠D线在20℃下获得。

实施例1：(1R，2S)-2-环己基-1-(4-环丙烷磺酰基-苯基)-环丙烷甲酸[5-(2-吡 咯烷-1-基-乙硫基)-噻唑-2-基]-酰胺

A)(4-环丙烷磺酰基-苯基)-重氮基-乙酸乙酯

将(4-环丙烷磺酰基-苯基)-氧代-乙酸乙酯(250 g，806 mmol)和对甲苯 磺酰肼(187g，984 mmol)在1.5 L乙醇中的混合物在室温下搅拌直至获得浅 黄色的溶液。然后加入浓盐酸(20 mL，233 mmol)，将形成的混合物加热回 流3.5小时。除去挥发性物质得到透明的浅黄色油，将其溶于1.5 L乙酸乙 酯。然后将该溶液用1 L饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用1 L饱和氯化 钠水溶液洗涤。将水相用乙酸乙酯反萃取(2 x 500 ml)，将有机层合并，用 硫酸镁干燥并过滤。将粗品腙溶液(约2.1 L，推测其含有363 g腙中间体) 充分搅拌并缓慢加入三乙胺(100 mL，890 mmol)。将形成的溶液放置过夜， 在此期间有一些固体析出。将混合物用乙酸乙酯稀释至3 L的体积得到溶 液，将其用1 L水洗涤，然后用2份500 mL的水洗涤(需要时与饱和氯化 钠水溶液混合以破乳)。然后将得到的有机相用硫酸镁干燥，过滤并浓缩得 到潮湿的固体，将其用甲基叔丁基醚研制。将形成的浆液过滤得到浅黄色 固体，将其真空干燥得到155 g标题化合物。将滤液浓缩成油，将其按照 以上描述研制直至获得自由流动的固体。将该固体通过过滤分离并干燥得 到另外10 g标题化合物。LCMS(m/e)：295(M+H)。

B)(1R，2S)-2-环己基-1-(4-环丙烷磺酰基-苯基)-环丙烷甲酸

向在惰性气氛下保持在25-30℃的乙烯基环己烷(300 mL，2.72 mol)的 150 mL无水二氯甲烷溶液中滴加四[N-邻苯二甲酰-(R)-叔亮氨酸基]二铑双 (乙酸乙酯)加合物(120 mg，84 μmol)的乙烯基环己烷(40 mL)溶液，同时分 批加入(4-环丙烷磺酰基-苯基)-重氮基-乙酸乙酯(169.40 g，575.5 mmol)。调 整加入的速度以使内部温度保持在40℃。约1.5小时后加料结束，将反应混 合物在30℃继续搅拌2小时。然后真空除去挥发性物质得到粘稠棕色油状 的(1R，2S)-2-环己基-1-(4-环丙烷磺酰基-苯基)-环丙烷甲酸乙酯粗品(218 g， 579 mmol)，将其溶于1.1 L甲醇得到黄棕色的溶液，向其中缓慢加入5 N氢 氧化钠水溶液(500 mL，2.5 mmol)。然后将形成的浆液在50℃搅拌1小时， 在此期间形成溶液。真空除去甲醇，加入1 L乙酸乙酯。通过加入约550 mL 5％的盐酸水溶液将形成的混合物酸化，将两层分离。然后将水层用两份 500mL的乙酸乙酯萃取。将有机相合并，用500 mL饱和氯化钠水溶液洗涤， 用硫酸镁干燥，过滤并浓缩得到潮湿的浅黄色固体。然后将该物质溶于1 L 甲醇。然后在1.5小时内向搅拌的溶液中加入水(1 L)。将形成的浆液在室温 下搅拌30分钟，然后过滤。将滤饼用1∶1甲醇/水洗涤，然后干燥得到浅黄 色结晶状标题化合物(166 g)。MS精确质量：计算值349.14735；实测值 349.14679(Agilent 1100 LC-TOF，采用电喷雾解离)；

通过比较与对映体相对应的两个峰的积分测得酸的对映体过量为 97.7％，所述对映体通过手性色谱在AD-H柱(150 mm)上分离，在35℃下用 含有0.05％三氟乙酸的10％乙醇的己烷溶液洗脱。

C)5-(2-吡咯烷-1-基-乙硫基)-噻唑-2-基胺

将硫杂环丙烷(550 mL，9.2 mol)在惰性气氛下加入到吡咯烷(543 mL， 6.57 mol)在2.5 L无水二恶烷中的混合物中。温度缓慢升高，当内部温度 达到54℃时，将反应混合物在冰浴中冷却。当温度降至45℃时，移走冷 却浴并将反应混合物加热至60℃。3小时后，将混合物冷却至室温并真空 浓缩。然后将残余物在6 mm Hg下蒸馏，收集在50℃沸腾的级分得到无 色油状的2-吡咯烷-1-基-乙硫醇(643 g)。MS(m/e)：132(M+H)。

将碳酸氢钠(1.232 kg，14.7 mol)缓慢地分批加入到5-溴-噻唑-2-基胺氢 溴酸盐(1.53 Kg，5.87 mol)在7.5 L异丙醇中的混合物中。然后在15分钟内加 入2-吡咯烷-1-基-乙硫醇(1.060 Kg，8.07 mol)并将形成的混合物在60℃搅拌 96小时。将温度升至70℃达1小时，然后将混合物冷却至室温。真空蒸除 大部分异丙醇，向残余物中加入4 L异丙醇/氯仿溶液(1∶9)。加入饱和碳酸 氢钠水溶液(4 L)，将形成的混合物搅拌30分钟。分层，将水相用每份4 L 的异丙醇/氯仿溶液(1∶9)萃取3次。将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤并 在真空下浓缩。将得到的残余物用3 L乙醚研制，过滤得到浅黄色固体状的 第一部分标题化合物(410 g)。将滤液浓缩至橙色固体，将其用2 L乙醚研制， 通过过滤分离出灰褐色固体。然后将该固体溶于2 L甲醇，将溶液在45 ℃ 加热30分钟。冷却至室温后形成固体。将该物质通过过滤分离，用乙醚按 照上述进行研制，真空干燥得到另外310 g标题化合物。MS(m/e)：230 [M+H]

D)(1R，2S)-2-环己基-1-(4-环丙烷磺酰基-苯基)-环丙烷甲酸[5-(2-吡咯烷-1- 基-乙硫基)-噻唑-2-基]-酰胺

将草酰氯(146.89 mL，1.69 mol)在惰性气氛下在15分钟内加入到搅拌 中的(1R，2S)-2-环己基-1-(4-环丙烷磺酰基-苯基)-环丙烷甲酸(295.00 g， 0.847 mol)的10 L无水二氯甲烷溶液中。然后一次性加入二甲基甲酰胺 (654.61 μL，8.5 mmol)并将形成的溶液搅拌过夜。然后在40℃下真空除去挥 发性物质得到油，将其溶于3 L无水二氯甲烷中。重新建立惰性气氛，将溶 液冷却至＜5℃。然后在20分钟内滴加三乙胺(177 mL 1.27 mol)，生成深色 的溶液。加入硫酸钠(120.25 g，0.847 mol)，然后加入5-(2-吡咯烷-1-基-乙硫 基)-噻唑-2-基胺(213.60 g 0.931 mole)。内部温度上升至20℃。将反应混合 物在冷却下搅拌10分钟，然后升温至室温。搅拌过夜后，将反应混合物倒 入3 L水中。将形成的混合物搅拌数分钟，然后将两层分离。将水层用1 L 二氯甲烷萃取，然后将二氯甲烷溶液合并，用MgSO₄干燥，过滤并在40℃ 下真空浓缩。将得到的油(556 g)以二氯甲烷溶液的形式上到短硅胶柱上。 将柱子用1∶12∶7 2M氨的甲醇溶液/甲基叔丁基醚/庚烷洗脱，然后用1∶19 2M氨的甲醇溶液/乙酸乙酯洗脱得到棕色泡沫(351 g)。将320 g该物质用甲 基叔丁基醚和庚烷结晶，在45℃下干燥2天后得到灰白色固体状标题化合 物(279.4 g)。LCMS(m/e)：560(M+H)；

葡萄糖激酶试验

将人胰岛GK同工型在大肠杆菌中以(His)₆-标记的融合蛋白的形式表 达并用金属螯合亲和色谱进行纯化，参见例如Tiedge等人，Biochem. Biophys.Acta 1337，175-190，1997。纯化后，将酶分成等份以0.8 mg/ml的 浓度在25 mM磷酸钠、150 mM氯化钠、100 mM咪唑、1 mM二硫苏糖 醇、50％甘油中在-80℃下保存。试验在平底的96孔板中进行，最终保温 体积为100μL。保温混合物由25 mM 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES) (pH7.4)、50 mM氯化钾、2.5 mM氯化镁、2 mM二硫苏糖醇、4 U/ml得 自肠膜明串珠菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶、5 mM ATP、1 mM NAD和设定 浓度的葡萄糖组成。将试验化合物溶于二甲亚砜，然后加入到反应混合物 中得到10％的最终二甲亚砜浓度。通过加入20 μL GK引发反应并在37℃ 进行20分钟。通过用微量板读数计测定340 nm下吸光度的增加来测定形 成的NADH的量。用吸光度值来计算EC₅₀。

实施例1的化合物在10 mM葡萄糖浓度下激活GK的EC₅₀＝42±42 nM(n＝5)。其还在低的葡萄糖浓度下以浓度依赖性的方式增加了酶的活性。

糖酵解试验

将大鼠胰岛素瘤INS-1E细胞在37℃、5％CO₂、95％湿度下在补充有 11 mM葡萄糖、5％胎牛血清、50 μM 2-巯基乙醇、1 mM丙酮酸盐、10 mM HEPES和抗生素的1640培养基中培养。在试验前，将细胞胰蛋白酶化， 通过离心使其沉积，然后以30,000个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养 试验板中。使细胞附着并在37℃、5％CO₂下培养48小时。在试验的当天， 将细胞用200μL补充有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的厄尔平衡盐缓冲液 (EBSS)洗涤并在其中进行培养。培养30分钟后，除去缓冲液并向细胞中 加入100 μL含有0.1％BSA、8 mM葡萄糖和化合物的EBSS缓冲液。然 后立即向细胞中加入20 μL CellTiterAQueous One Solution Reagent 并将细胞在37℃下继续培养1小时。在培养结束时，读取490 nm处的吸 光度。用吸光度值来计算EC₅₀。

实施例1的化合物刺激了大鼠胰岛素瘤INS1-E细胞中的葡萄糖代谢 (平均EC₅₀＝579±139 nM，n＝4)。

因此，本发明的化合物显示可以在体外激活GK。

口服葡萄糖耐量实验(OGTT)

将体重为225-250 g的雄性Wistar大鼠用常规食物在正常的光照周期 和条件下喂养。为了进行研究，将大鼠禁食过夜后测量其精确的体重并随 机分到体重相近的组中(每组n＝4)。将化合物在水浴超声仪中混悬于1∶1的 Solutol/乙醇混合物中(10％总体积)。然后将得到的混悬液用9体积的10％ 的Solutol水溶液稀释，并将化合物以1、3、6、10、20和30 mg/kg的剂 量口服给药。在给药化合物2小时后，向大鼠给予2 g/kg的口服葡萄糖药 团。通过尾部放血在给予葡萄糖后的第0、15、30、60、90和120分钟收 集血液。将收集的血液置于乙二胺四乙酸(EDTA)试管中，每次取样的体积 为400 μL，并将样品放置在冰上。分离血浆并在-20℃下保存直至将样品 用于葡萄糖和化合物含量的分析。计算各组的血浆葡萄糖曲线下面积(葡萄 糖AUC)并将葡萄糖AUC与对照组相比的下降百分比作为化合物降低血浆 葡萄糖效力的量度。

实施例1的化合物对于空腹和餐后葡萄糖水平均以剂量依赖性的方式 降低了血浆葡萄糖。与未治疗的对照组相比，在高剂量(30 mg/kg)下观察到 了葡萄糖AUC的最大下降，其降低了42％。数据内插法显示当血浆中的 平均化合物浓度为99 ng/ml(179 nM)时出现了20％的葡萄糖AUC下降， 其相当于6.9 mg/kg的化合物剂量。

因此，本发明的化合物显示可以在体内激活GK。

血脑屏障通透性

在二甲亚砜中制备10 mM的化合物储备液。然后通过将100 μL储备 液用900 μL丙二醇稀释来制备给药的溶液。将药物以静脉内推注的方式 (2.2 mL/kg)经由尾静脉对6只雄性CF-1小鼠(约23 g)进行给药，目标剂量 为2.17μmol/kg。利用CO₂和颈脱位法对小鼠实施安乐死。在给药后5分 钟处死3只小鼠，并在给药后60分钟处死3只。通过心脏穿刺从各动物收 集血液，用EDTA钠制备血浆，转移到聚丙烯样品管中并立即用干冰冷冻。 从各动物收集完整的大脑并从中间切成两半，将每一半分别转移到聚丙烯 样品管中并立即用干冰冷冻。通过将一份血浆用两份萃取溶剂(10％四氢呋 喃的乙腈溶液)使蛋白质沉淀并用旋涡混合器混合来制备用于分析的血浆 样品。对于脑组织，假设1 mg脑组织≈1 μL体积并向一份组织中加入两 份萃取溶剂。将样品立即用超声细胞破碎仪匀浆化。通过向空白小鼠血浆 中掺入已知浓度的化合物然后类似于血浆样品进行处理来制备校准标准 物。将所有样品在6000 RCF下离心5分钟。将各样品的上清液等分试样 转移到聚丙烯96孔板中，然后密封用于LC-MS/MS分析。

MS/MS用装配有涡轮增压离子喷雾源的Sciex API 4000三重四极杆质 谱仪来进行。高效液相色谱用加热至50℃并在0.6 mL/分钟的恒定流速下 运行的Phenomenex Hyrdro RP分析柱(100x 2.0 mm，4μ)进行。使用如下 流动相梯度：初始流动相为60∶40 5 mM甲酸铵水溶液：5mM甲酸铵的甲 醇溶液，保持1分钟；然后是2分钟的线性梯度至10∶90 5 mM甲酸铵水 溶液：5mM甲酸铵的甲醇溶液，最终保持1分钟。将柱流出液从0-2.8分 钟导入废液中，然后从2.8-4.0分钟将其导入质谱仪，监测到的MS/MS转 变为560/84。通过将峰面积值与由校准标准物的标称浓度和其相应的峰面 积得到的一元二次方程加权的1/x²比较来对测试样品中的化合物进行定 量。通过对超出理论值的+/-20％的校准标准物进行反算校正来确定定量的 上限和下限。用16μL血浆/g小鼠脑的文献因数将脑组织浓度对血浆组成 进行校正。

实施例1化合物的体内血脑屏障通透性引起的平均脑/血浆比值在给药 后5分钟为0.17，此时的平均总脑水平为0.539 nmol/g。

已证实本发明的化合物具有有限的血脑屏障通透性，因此产生严重低 血糖的可能性有限。