激光共聚焦斜入射椭偏高通量生物分子反应成像检测装置

摘要

本发明涉及激光共聚焦斜入射椭偏高通量生物分子反应成像检测装置。在样品平台上有载有生物样品微阵列的样品基片，样品基片下方有进出液口与多通道注射泵相连接的多通道恒温流通池；在一倒置激光共聚焦显微镜的载物台位置安置多通道恒温流通池；在样品平台的对应两边分别有两个对称竖直放置带有凹槽的平板，且在凹槽中分别安装有沿入射光路方向顺序设置的激光器、起偏器、光弹调制器、相移器和聚焦透镜的机械臂，和沿反射光路方向顺序设置的聚焦透镜、斩波器、偏振分析器和光电探测器的机械臂；一锁相放大器的数据入出口端分别与光电探测器的数据出口端及数据采集卡的数据入口端相连接，计算机分别与数据采集卡和多通道注射泵的控制器相连接。

说明书

技术领域

本发明属于高通量检测生物分子反应的装置，特别涉及一种基于激光共 聚焦显微系统的实时观测和高通量检测生物分子微阵列(生物芯片)反应的斜 入射椭偏成像检测装置。

背景技术

在生命科学研究中，生物分子之间的相互作用是一种基本的生命现象， 也是现代生命科学研究的重大问题之一，研究生物分子之间的相互作用的传 统方法有多种，如放射免疫分析方法、酶连结免疫分析方法、标记示踪法等。 然而，由于这些方法要涉及不同种类和含量的细胞、生物分子，而且各种物 质间存在着复杂的相互作用，因而利用这些传统的研究方法很难准确获取生 物分子之间的相关的传递信息，同时，日益增加的新蛋白和DNA序列数据也 迫切需要能够准确、高通量的快速鉴定生物分子之间的相互作用的方法。上 个世纪80年代初期，有人提出通过微电子技术和生物技术相结合，制作出具 有生物活性的微结构的构想来实现高通量检测生物分子之间的相互作用，这 就是生物芯片技术的原型。但是由于加工技术等相关科技手段的限制，直到 上个世纪90年代，生物芯片技术才取得长足的进步。目前生物芯片特别是二 维生物芯片已经实现了产业化。伴随生物芯片技术发展起来的芯片检测技术 目前主要分为两种，一是化学方法，如同位素标记、荧光标记和电化学方法 等，目前使用最多的是荧光标记方法，主要采用荧光激光共聚焦系统进行高 通量检测微阵列生物分子反应，这种方法的灵敏度较高，但需要对样品进行 前期处理、定量检测困难、对待测样品有损伤且易发生光漂泊现象；二是物 理方法，如表面等离子激元显微镜、原子力显微镜、质谱法、椭偏仪等，其 中椭偏仪由于它不需要对待测物作标记，也不会对待测生物分子活性造成任 何扰动和损伤，具有实时和灵敏度较高等优点而被广泛应用。目前已经出现 了消光式椭偏仪、光度式椭偏仪、椭偏光谱仪、红外椭偏光谱仪、成像椭偏 仪和广义椭偏仪等。其中用于芯片生物分子之间相互作用检测的主要是成像 椭偏仪，可进行生物分子的厚度、直径和的三维形貌的测量；非标记实时生 物芯片的扫描和各种生物分子的吸附、解吸附过程测量和动力学研究，通过 它可以实时观察分子之间相互作用过程中的变化情况，得到很多传统技术难 以提供的生物分子之间相互作用的信息。但是由于该领域的研究正处于发展 阶段，在实际应用中的许多科学问题尚待进一步探索，如成像椭偏仪一般都 采用复色光或多波长激光光源，机械结构比较复杂；采用CCD器件，干扰了 样品反射光的偏振态，且有很强的本底信号，成像速度慢，无法实现原位高 灵敏度在线检测，数据处理复杂，准确性不够高等；对于多元阵列既同一芯 片上的阵列有不同生化反应的精度测量还很难实现，多数实验数据是在不精 确的实验设计下获得的，而且检测的精确度和方便程度都有一定的欠缺；无 法避免服特异性吸附等。因此椭偏系统仍需优化、原理和数据处理方法上有 待改进和提高。其中方法之一是与其它仪器联合使用以提高仪器灵敏度和可 靠性，如文献(Wei-Liang Hsu，Shu-Sheng Lee，Chih-Kung Lee，J.Biomed.Opt.， 2009，14，024036)中介绍了Wei-Liang Hsu等人将其与表面等离子共振结合起 来提高生物芯片检测的灵敏度和准确性等，文献(Schuy S，Faiss S，Yoder NC， Kalsani V，Kumar K，Janshoff A，et al，J.Phys.Chem.B Biointerfaces，2008，112， 8250.)介绍了Schuy S等人将其与全内反射光谱相结合来实现高灵敏检测等。 方法之二就是新技术和有效算法的使用，如文献(Cormier G，Boudreau R.Opt.Soc.Am，2000，1，129.)中介绍了偏振调制器的使用和遗传算法的 引入。斜入射椭偏法是在传统光学椭偏技术的基础上有了很大的灵活性。传 统光学椭偏的入射光是接近正入射，只适用于表面各向异性的材料光学特性 的检测，斜入射差分光学椭偏技术在斜入射光路中加入了调整背底强度的器 件来消除背底信号，这样使其测量不限于具有表面光学各向异性的材料，同 时采用差分的方法大大提高了精度。如果将激光共聚焦技术与光学椭偏技术 相结合，利用斜入射椭偏技术的高灵敏性，能获取分子间相互作用的动力学 信息，及激光共聚焦技术的高三维图像分辨率和较深的穿透性等特点，辅以 微流控技术经济集成的优点，有望实现对生物阵列反应的原位实时、高通量、 定性、定量多元灵敏检测。而目前国内外还没有集激光共聚焦技术与光学椭 偏技术于一体的商品化产品。本发明的装置可以应用于包括小分子，蛋白分 子，大分子，纳米单体，细胞之间的相互作用及动力学过程实现原位实时， 定量、定性灵敏检测中的应用，同时也使研究领域从生物体系扩展至纳米、 信息、材料等领域，从而进一步丰富人们对微观世界的认识和了解，为揭示 生命科学、纳米科学、信息科学、材料科学研究中的基本物理化学问题提供 新的研究方法和手段。

本发明的建立一套激光共聚焦斜入射椭偏高通量生物分子反应成像检测 装置，在传统椭偏原理上又引入了差分偏振法，结合激光共聚焦技术灵敏荧 光成像的特点，辅以微流控和化学手段避免了非特异吸附，可实现生物芯片 的原位、实时、定量、定性、高通量、多元反应的精确检测。同时采用有效 的数学物理方法研究典型生物反应机理，拓展了该系统的应用范围。本发明 的开展能够开发出我国自主知识产权的多元生化反应检测系统，提高我国在 生物芯片检测仪器方面的国际竞争力，有巨大应用前景和经济价值。研制的 成像系统能够应用于不同物种。

发明内容

本发明的目的是将激光共聚焦技术与斜入射椭偏技术相结合，利用椭偏 检测技术的高灵敏性能获取分子间相互作用的动力学信息，及利用激光共聚 焦技术的高三维图像分辨率和较深的穿透性等特点，辅以微流控技术，以实 现对生物分子的高通量、原位实时、定量灵敏检测，从而提供一种既能原位 定性定量检测又能实时观测生物分子反应的激光共聚焦斜入射椭偏高通量生 物分子反应成像检测装置。

本发明的激光共聚焦斜入射椭偏高通量生物分子反应成像检测装置是基 于激光共聚焦显微系统，所采用的原件均为市售产品；所述的装置包括样品 平台、手动机械转角装置、椭偏检测单元、共聚焦单元、数据采集和数据处 理系统。

一具有三维电动调节机构的所述的样品平台上有载有生物样品微阵列的 样品基片，在所述的样品基片下方有多通道恒温流通池；

所述的多通道恒温流通池的进液口通过管路与多通道注射泵的出液口相 连接，多通道恒温流通池的出液口通过管路与多通道注射泵的进液口相连接， 以使多通道恒温流通池中的液体循环流通；

所述的共聚焦单元包括一倒置激光共聚焦显微镜，在倒置激光共聚焦显 微镜的载物台位置安置所述的多通道恒温流通池；

所述的手动机械转角装置包括固定在所述的样品平台对应两边的两个对 称竖直放置的带有凹槽的平板，及两个分别安装在两个凹槽中的机械臂；所 述的机械臂可在竖直方向上进行角度0-90°之间的随意调节(通过手动控制机 械臂的转动，可以调节聚焦在样品上的入射光束和出射光束的角度)；

所述的椭偏检测单元包括安装在所述的一机械臂上的沿入射光路方向顺 序设置的激光器、起偏器、光弹调制器、相移器和聚焦透镜，安装在所述的 另一机械臂上的沿反射光路方向顺序设置的聚焦透镜、斩波器、偏振分析器 和光电探测器；

所述的数据采集和数据处理系统包括锁相放大器、数据采集卡和计算机；

所述的锁相放大器的数据入口端通过数据线与所述的光电探测器的数据 出口端相连接，锁相放大器的数据出口端通过数据线与所述的数据采集卡的 数据入口端相连接，所述的数据采集卡的数据出口端通过数据线与所述的计 算机的一数据入口端相连接，计算机的另一数据入口端通过数据线与所述的 多通道注射泵的控制器相连接。

所述的多通道恒温流通池采用石英玻璃或毛玻璃做四壁和底面，由橡胶 密封圈实现密封。

所述的数据采集卡带有BNC适配器和数据采集软件，数据采集卡进行数 据采集，并由数据采集卡中的数据处理软件进行简单的数据处理。

所述的BNC适配器接收所述的锁相放大器的输出数据信号，由数据采集 卡采集BNC适配器输出的数据，并传送给所述的计算机，计算机对数据采集 卡发送来的数据进行数据存储、分析和处理并成像。

所述的沿入射光路上方向顺序设置的激光器、起偏器、光弹调制器、相移 器和聚焦透镜，沿反射光路方向顺序设置的聚焦透镜、斩波器、偏振分析器 和光电探测器分别集成在两个机械臂上，两个机械臂分别安装在两个对称的 带有凹槽的平板上，通过手动转动机械臂，可以调节聚焦在样品基片上的入 射光束和反射光束的角度。

所述的椭偏检测单元中的激光器是波长为632.8nm的He-Ne激光器。

所述的光弹调制器的调制频率O＝50kHz。

所述的样品基片是普通盖玻片或载玻片。

上述激光器输出的光通过起偏器成线偏振光后，经过光弹调制器产生P 偏振光和S偏振光的周期变化，再经过相移器进入聚焦透镜聚焦后照射到样 品上，反射光进入聚焦透镜后，再经斩波器和偏振分析器后，由光电探测器 接收，再由数据线输出到锁相放大器进行振幅与位相分离后再由数据采集卡 进行数据采集，并由计算机中的数据处理系统进行数据处理，然后将处理后 的数据信息转换成图像。

本发明结合倒置激光共聚焦显微镜和椭偏检测的优点，可以同时对生物样 品间的反应进行定量定性椭偏信号检测的同时进行荧光成像观察。

本发明具有：

(1)本发明采用光路不动，样品做二维移动的方式，结合斜入射和位相 调制方式，提高了信噪比和检测灵敏度。

(3)本发明可实现固相和液相生物样品的高通量检测。

(3)本发明的装置中结合了微流控技术，能够真正实现多种反应同时高 通量检测。

(4)本发明的装置结构简单，易于操作，能应用于化学、生物、医学、 材料、环境、安全等多个领域。为纳米科学、材料科学、生物化学及交叉领 域的科学问题的深入研究提供新的高效率研究手段。

附图说明

图1.本发明的激光共聚焦斜入射椭偏高通量生物分子反应成像检测装置 的结构示意图。

图2.本发明实施例1的采用激光共聚焦斜入射椭偏高通量生物分子反应 成像检测装置对在同一盖玻片上进行不同生物蛋白分子检测的结果；其中， 图2a和图2b分别为椭偏成像和共聚焦荧光成像结果。

附图标记

1.He-Ne激光器               2.起偏器            3.光弹调制器

4.相移器                    5.聚焦透镜          6.多通道恒温流通池

7.倒置激光共聚焦显微镜      8.多通道注射泵      9.聚焦透镜

10.斩波器                   11.偏振分析器       12.光电探测器

13.锁相放大器               14.数据采集卡       15.计算机

16.载有生物样品微阵列的盖玻片

具体实施方式

下面结合具体实施例来对本发明做进一步的解释和说明。

实施例1

请参见图1，激光共聚焦斜入射椭偏高通量生物分子反应成像检测装置包 括样品平台、手动机械转角装置、椭偏检测单元、共聚焦单元、数据采集和 数据处理系统。

一具有三维电动调节机构的所述的样品平台上有载有生物样品微阵列的 盖玻片16，在所述的盖玻片下方有尺寸为15mm×15mm×3mm的多通道恒温 流通池6，所述的多通道恒温流通池6是采用石英玻璃聚四氟乙烯材料做四壁 和底面，由橡胶密封圈密封。

所述的多通道恒温流通池6的进液口通过管路与多通道注射泵8的出液 口相连接，多通道恒温流通池6的出液口通过管路与多通道注射泵8的进液 口相连接，多通道注射泵作为多通道恒温流通池中液体的流通动力源，以使 多通道恒温流通池中的液体循环流通。

所述的共聚焦单元包括一倒置激光共聚焦显微镜7，在倒置激光共聚焦显 微镜7的载物台位置安置所述的多通道恒温流通池6。

所述的手动机械转角装置包括固定在所述的样品平台对应两边的两个对 称竖直放置的带有凹槽的平板，及两个分别安装在两个凹槽中的机械臂；所 述的机械臂可在竖直方向上进行角度0-90°之间的随意调节。

所述的椭偏检测单元包括安装在上述两机械臂中的一机械臂上的沿入射 光路方向顺序设置的激光器1、起偏器2、光弹调制器3、相移器4和聚焦透 镜5，安装在上述两机械臂中的另一机械臂上的沿反射光路方向顺序设置的聚 焦透镜9、斩波器10、偏振分析器11和光电探测器12；激光器1输出的光通 过起偏器2成线偏振光后，经光弹调制器3及相移器4后，由聚焦透镜5聚 焦后入射到样品台上的载有生物样品微阵列的盖玻片16上；经生物样品的反 射，经由聚集透镜9进入斩波器10，再由偏振分析器11后被光电探测器12 接收后，再由数据线输出。

所述的数据采集和数据处理系统包括锁相放大器13、带有BNC适配器和 数据采集软件的数据采集卡14和计算机15。

所述的锁相放大器13的数据入口端通过数据线与所述的光电探测器12 的数据出口端相连接，锁相放大器13的数据出口端通过数据线与所述的数据 采集卡14的数据入口端相连接，所述的数据采集卡14的数据出口端通过数 据线与所述的计算机15的一数据入口端相连接，计算机15的另一数据入口 端通过数据线与所述的多通道注射泵8的控制器相连接。

本装置中的激光器是采用功率为10mW，波长为632.8nm的He-Ne激光 器作为光源，出光孔径为3mm；从激光器1出射的激光束经由起偏器(New Focus 5524)校正偏振方向后变成偏振方向平行于入射面的线偏振光，经 PEM100光弹调制器(调制频率O＝50kHz)后产生P偏振光和S偏振光建的 周期变化(调制周期为50kHz)，再经相移器补偿(多级半玻片)调节相位后 聚焦到载有生物样品微阵列的盖玻片上；所述的盖玻片上用化学的方法修饰 有生物敏感膜如IgG抗体分子阵列，通过手控转角装置调节光束的入射角度， 使入射光入射角在80-90°间，盖玻片带有生物样品一面的下面的多通道恒温 流通池里流通有anti-IgG，并与生物分子微阵列接触发生反应，通过多通道注 射泵(74901-15：0.001ul/hr～147ml/hr流速，适配10ul～140ml注射器，最小 步进为9.5×10-6mm/min，可以实现10个通道同时自动吸注)控制anti-IgG反 应物进出多通道恒温流通池与生物分子微阵列反应引起折射率改变，折射率 的改变引起椭偏检测信号的变化。所述多通道恒温流通池的温度范围为 20℃～45℃，精度±0.5℃，anti-IgG反应物进出多通道恒温流通池的流速范围 为0.005～380ml/min，精度为±1％。；所述的载有生物样品的盖玻片16采用市 场上购买的K9玻璃，盖玻片固定于一市场上可以买到的三维电动调载物台 上，载物台与倒置激光共聚焦显微镜配套使用。所述的倒置激光共聚焦显微 镜(Nikon C1 Si)分辨率为2um。

经生物样品表面反射的光经聚焦透镜9后，由斩波器10(Stanford Research Systems SR540)斩波和偏振分析器11(CVI Laser CPAD-10.0-425-675)后由 光电探测器12(硅光电二极管9863/100B)接收；锁相放大器13(Stanford Research Systems SR830 DSP)通过数据线收到光电探测器12的光信号，光信 号转换成电信号后由数据采集和处理系统读取。

本发明的装置是采用固定光路样品二维移动的方式，具体是将两个分别 集成有入射光路和反射光路元件的机械臂(铝合金加工而成)的侧面通过螺 钉固定在同一个带有凹槽的平板上，两个机械臂可以在凹槽中进行垂直于水 平面的转动，可同时以同一点为轴转动，从而可以按照实验的需要在80°～90° 之间调节光束的入射角度，由此组成手动机械转角装置；同时样品置于可精 密移动的电动控制样品台上，这样实现了样品移动光路固定的检测装置。

所述的数据采集和数据处理系统包括锁相放大器13、带有BNC适配器 (BNC-2110)和Labview编写的数据采集软件的数据采集卡14(PCI-6220) 和计算机15。锁相放大器13输出的电信号首先经由BNC适配器进行分通道 处理，锁相放大器输出的信号被分成振幅信息和位相信息两个部分，然后将 锁相放大器的振幅信息和位相信息分别送入数据采集卡采集，最后把采集到 的数据传送给用Labview编写的数据处理程序进行存储、分析和处理，同时 倒置激光共聚焦显微镜对反应过程进行成像，结果输入到计算机15与椭偏检 测信号数据实时对比。

采用上述实验装置能够检测到折射率变化2×10^-4，样品检测灵敏度达到 10^-11g/ml，并达到荧光图像分辨率为2μm，纵向分辨率为0.05nm。

图2为采用激光共聚焦斜入射椭偏高通量生物分子反应成像检测装置对 在同一盖玻片上进行不同生物蛋白分子与被检测单一目标相互作用的结果。 盖玻片上有3×4生物分子阵列，第一列为牛血清蛋白(BSA)，第二列为前 列腺特异性抗体(anti-PSA)，第三列为羊抗鼠IgG(Goat Anti-Mouse IgG)， 第四列为癌胚抗体(anti-CEA)。通过四通道注射泵为多通道样品池中每个通 道注入相同浓度的Cy3荧光标记前列腺特性抗原(PSA)，通入PSA后只有第 二列的anti-PSA与其能够发生相互作用，图2a和图2b分别为使用本发明的 装置得到的斜入射椭偏和共聚焦荧光成像的结果。在图2a中只有第二列的斜 入射椭偏成像在PSA通入前后有明显的变化，第一列基本没有变化，第三和 第四列变化均不明显。图2b中只有第二列在通入PSA后有明显的荧光。通过 图2a和图2b的比较，进一步确定只有anti-PSA才能与PSA发生特异性反应。 以上结果表明：本发明的装置可以同时实现高通量生物分子反应的激光共聚 焦和椭偏成像，能够对生物分子反应进行定量和定性灵敏检测，荧光图像可 以排除椭偏成像中的非特异性吸附，使得检测结果更加准确。

实施例2

装置的结构与实施例1相同，只是硅光电二极管12采用型号为9863/100B 的光电倍增管，其它与实施例1相同，本实施例的装置的灵敏度和检测精度 能提高2个数量极。

实施例3

装置的结构与实施例1相同，只是硅光电二极管12采用感光面积为 1.0mm2的方形高速感应硅光二极管(BPX-65)组成30×30二维阵列，其它与 实施例1相同，本实施例的装置能够实现对面积为9(cm)²微阵列生物样品进 行检测。

实施例4

装置的结构与实施例1相同，只是硅光电二极管12采用1300×1024的 CCD面阵(AM1300)，其它与实施例1相同，本实施例的装置能够实现对面 积为9(cm)²微阵列生物样品进行检测。

实施例5

采用实施例1的装置，只是采用化学修饰的方法，将爱滋病毒1型(HIV-1) 核心蛋白p24的抗体修饰在盖玻片表面上，多通道恒温流通池中流有不同浓 度的爱滋病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的抗原，其它与实施例1相同，可 以对爱滋病毒1型同时进行多种浓度诊断检测的动力学分析。

实施例6

采用实施例1的装置，只是采用化学修饰的方法，将盖玻片表面修饰有 可以识别汞离子的荧光探针，多通道恒温流通池中流有被汞离子污染的生物 细胞蛋白，其它与实施例1相同，可以对生物体内的汞离子进行检测。

实施例7

采用实施例1的装置，只是采用化学修饰的方法，将盖玻片表面修饰有 可以识别锌离子的荧光探针，多通道恒温流通池中流有被锌离子污染的生物 细胞蛋白，其它与实施例1相同，可以对生物体内的锌离子进行检测。

实施例8

采用实施例1的装置，只是采用化学修饰的方法，将盖玻片表面修饰有 可以识别镁离子的荧光探针，多通道恒温流通池中流有被镁离子污染的生物 细胞蛋白，其它与实施例1相同，可以对生物体内的镁离子进行检测。

实施例9

将表面修饰有生物分子的盖玻片倒放，即将有样品的面向上，在不使用 施例1中的多通道流通池和多通道注射泵情况下，可实现对点样仪制备的固 体蛋白质芯片的高通量检测。

实施例10

采用实施例1的装置，只是采用化学修饰的方法，将盖玻片表面修饰有 可以识别氟离子的荧光探针，多通道恒温流通池中流有被氟离子污染的生物 细胞蛋白，其它与实施例1相同，可以对生物体内的氟离子进行检测。

实施例11

采用实施例1的装置，只是采用化学修饰的方法，将盖玻片表面修饰有 可以同时识别汞离子、锌离子、镁离子、氟离子和镉离子的荧光探针，多通 道恒温流通池中流有被汞离子、锌离子、镁离子、氟离子和镉离子污染的生 物细胞蛋白，其它与实施例1相同，可以对生物体内的汞离子、锌离子、镁 离子、氟离子和镉离子进行同时检测。

实施例12

将甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖链抗原19-19(CA199)、糖链 抗原24-2(CA242)、糖链抗原125(CA125)、糖链抗原15-3(CA153)、游 离前列腺特意性抗原(F-PSA)、前列腺特意性抗原(PSA)、神经元烯醇化酶 (NSE)、绒毛膜促性腺激素(HCG)、人生长素(HGH)、铁蛋白(Ferritin) 等肿瘤标记物修饰到同一片盖玻上，其它与实施例1相同，可以同时实现对 多种肿瘤标记物的实时定量检测。