截短的人乳头瘤病毒33型L1蛋白

摘要

本发明涉及一种截短的人乳头瘤病毒33型L1蛋白，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防HPV(特别是HPV33)感染及由HPV(特别是HPV33)感染所导致的疾病例如宫颈癌等。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV(特别是HPV33)感染及由HPV(特别是HPV33)感染所导致的疾病例如宫颈癌等。

说明书

技术领域

本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种 截短的人乳头瘤病毒33型L1蛋白，其编码序列和制备方法，以及包 含其的病毒样颗粒，所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防HPV(特别是 HPV33)感染及由HPV(特别是HPV33)感染所导致的疾病例如宫颈癌 等。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗 的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV(特别是HPV33)感染及 由HPV(特别是HPV33)感染所导致的疾病例如宫颈癌等。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属于乳头瘤病毒科 (Papillomaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。该病毒基因 组为双链闭环DNA，大小约为7.2～8kb，具有8个开放阅读框。该病 毒基因组按功能的不同可以分为三个区域：①早期区(E)，约4.5kb， 编码E1、E2、E4～E7共6个与病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋 白；②晚期区(L)，约2.5kb，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白 L2；③长调控区(LCR)，位于L区末端与E区起始端之间，长约800～ 900bp，不编码任何蛋白，含DNA复制和表达调控元件。HPV病毒颗粒 直径为45～55nm，核衣壳呈20面体对称，有72个壳微粒，由L1及 L2组成。

目前已知的HPV约有90多种亚型，在人群中主要引起皮肤，粘膜 的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为3组：①低或无 致癌风险组，包括HPV6、11、39、41、42、43；②中度致癌风险组， 包括HPV31、33、35、51、52；③高度致癌风险组，包括HPV16、18、 58、45。

HPV分子流行病学调查证实，高危型HPV感染是宫颈癌发生的重 要启动因子。在所有宫颈癌标本中，HPV DNA检出率高达80％以上。 宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，是严重 威胁女性健康的杀手。据统计，每年世界范围内约有490,000例的新 发病例，约有270,000人死于该疾病(Boyle，P.，and J.Ferlay.Ann  Oncol 2005，16：481-8)。在所有宫颈癌病例中，发生于发展中国家 的占了约83％，在这些国家中，宫颈癌甚至能够占到女性恶性肿瘤的 15％。而在发达国家，这个数字仅占到1.5％。在撒哈拉以南地区， 中南亚，拉丁美洲，东亚均为宫颈癌的高发区。我国也属于宫颈癌高 发区。在陕西略阳县，已婚妇女中宫颈癌的发病率高达1026/100000。

有关世界范围内宫颈癌标本中HPV型别分布的荟萃分析发现，宫 颈癌中最常见的HPV型别依次是16、18、45、31、33、58、52、35、 59、56、6、51、68、39、82、73、66和70(按照降序排列，Clifford  GM，Smith JS，Plummer M，et al.Br J Cancer，2003，88(1)：63-73)。 近期一项对中国妇女感染HPV型别的调查结果表明，在宫颈癌患者中 HPV33的感染率为3.6％，在HPV16(58.7％)、HPV18(11.0％)、HPV58 (7.2％)之后，位于第4位(Y P Bao，N Li，J S Smith and Y L Qiao. International Journal of STD&AIDS，2008，19：106-111)。这 说明HPV33在世界范围内的妇女宫颈癌患者中的感染率较高，是普遍 易感染的HPV型别之一。

目前已上市的HPV疫苗为Merck的及GSK的 上述两种疫苗分别含有HPV6/11/16/18及HPV16/18 VLP， 但均不包含在中国及亚洲妇女中普遍易感的HPV33型别VLP。

因此，针对中国以及亚洲等发展中国家妇女安全有效的HPV疫苗， 特别是针对HPV16，18及33等高危型别的疫苗，是有效预防宫颈癌， 改善广大妇女(特别是我国及亚洲妇女)健康状况的有效途径。

HPV L1蛋白为主要衣壳蛋白，分子量为55-60kDa，是HPV疫苗主 要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助即 可形成在形态结构上与天然病毒颗粒相似的病毒样颗粒(Virus-Like  Particle，VLP)。该病毒样颗粒为二十面体立体对称结构，由72个 L1蛋白的五聚体组成。其保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免 疫原性，可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy， et al.1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24)：12180-4)。并且， 病毒样颗粒不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性。 因此，VLP疫苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。

HPV VLP疫苗研制的关键是能够大量高效制备VLP样品。目前较 为常用的VLP表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。

常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、 酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏 少，能自发形成VLP，往往只需进行简单的密度梯度离心即可得到纯 化的VLP，为纯化工作提供极大的便利。但是由于真核表达系统的表 达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。目前已 上市的HPV疫苗采用了酿酒酵母表达系统，其表达量低， 生产成本高，因此该产品价位偏高，影响其广泛应用。

在原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPV L1蛋白已有报 道。例如已报道利用大肠杆菌表达HPV16 L1蛋白(Banks，L.，G. Matlashewski，et al.(1987).J Gen Virol 68(Pt 12)：3081-9)。 但是大肠杆菌表达的HPV L1蛋白大多失去其天然构象，不能产生针对 HPV的保护抗体。或者尽管上述蛋白通过包含体纯化，复性等步骤也 可得到HPV VLP(Kelsall，S.R.and J.K.Kulski(1995).J Virol  Methods 53(1)：75-90)，但是在复性过程中蛋白损失量大，得率低， 因此，难以在大规模生产上应用。虽然HPV L1蛋白也可以在大肠杆菌 中以正确构象可溶性地表达，溶解于菌体的裂解上清中，但是其表达 量较低，而且上清中杂蛋白种类多且量大，要从中纯化出目的蛋白难 度相当大。虽然也有文献报道通过GST融合表达的方式可以增加上清 中L1蛋白的表达量，而且有助目的蛋白的纯化(Li，M.，T.P.Cripe， et al.(1997).J Virol 71(4)：2988-95)，但融合蛋白的切割往 往需要价格昂贵的酶，依然无法应用于大规模生产。

因此，本领域仍然需要能够低成本获得且能够诱导针对HPV的保 护性抗体的HPV L1蛋白及由其组成的病毒样颗粒，从而使大规模工业 化生产宫颈癌疫苗成为可能。

发明内容

本发明至少部分基于发明人的出人意料的发现：利用大肠杆菌表 达系统能大量表达可以诱导针对HPV33的中和抗体的截短的HPV33 L1 蛋白，该截短的HPV33 L1蛋白具有高产率，且经纯化后纯度可达到 96％或更高，并且纯化后的所述蛋白经进一步处理可得到可诱导针对 HPV33的保护性抗体的病毒样颗粒。

因此，在一个方面，本发明涉及一种截短的HPV33 L1蛋白或其变 体，其与野生型HPV33 L1蛋白相比，N端截短了9-19个氨基酸，例如9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18和19个氨基酸。

在一个优选的实施方案中，与野生型HPV33 L1蛋白相比，该截短 的HPV33 L1蛋白的N端截短了9个、11个、14个或19个氨基酸。

在另一个优选的实施方案中，该截短的HPV33 L1蛋白(以下也简 称为截短蛋白)具有SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6或 SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，该截 短蛋白具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明涉及编码本发明的截短蛋白或其变体的多 核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。

可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于 克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒， 噬菌体，柯斯质粒等等。

在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细 胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及 真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动 物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细 胞系，例如293T细胞。

在另一个方面，本发明涉及一种HPV33病毒样颗粒，其中该病毒样 颗粒含有本发明的截短蛋白或其变体，或者由本发明的截短蛋白或其 变体组成或形成。

在一个优选的实施方案中，本发明的HPV33病毒样颗粒包含与野生 型HPV33 L1蛋白相比，N端截短了9-19个氨基酸，例如9个、11个、14 个或19个氨基酸的截短的HPV33 L1蛋白，或由所述蛋白组成或形成。 在一个特别优选的实施方案中，本发明的HPV33病毒样颗粒包含具有 SEQ ID NO：4，5，6或7所示序列的截短的HPV33 L1蛋白，或由所述蛋 白组成或形成。

在另一个方面，本发明还涉及包含上述截短蛋白或其变体，或上 述多核苷酸或载体或宿主细胞或HPV33病毒样颗粒的组合物。在一个优 选的实施方案中，所述组合物包含本发明的截短蛋白或其变体。在另 一个优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的HPV33病毒样颗粒。

在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含本 发明的HPV33病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形 剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防HPV(特别是HPV33)感 染或由HPV(特别是HPV33)感染所导致的疾病例如宫颈癌等。

在一个优选的实施方案中，所述HPV33病毒样颗粒以预防HPV感染 或宫颈癌有效量存在。在另一个优选的实施方案中，本发明的药物组 合物或疫苗还包含至少一种选自下列的病毒样颗粒：HPV6 L1蛋白病毒 样颗粒，HPV11 L1蛋白病毒样颗粒，HPV16 L1蛋白病毒样颗粒，HPV18 L1蛋白病毒样颗粒，HPV31 L1蛋白病毒样颗粒，HPV45 L1蛋白病毒样 颗粒，HPV52 L1蛋白病毒样颗粒，HPV58 L1蛋白病毒样颗粒；优选地， 这些病毒样颗粒各自独立地以预防宫颈癌或者相应HPV亚型感染有效 量存在。

本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用， 例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中，特别优选的 施用方式是注射。

在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗以单位剂 量形式进行施用。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量中包含的 HPV33病毒样颗粒的量为5μg-80μg，优选20μg-40μg。

在另一个方面，本发明涉及一种获得本发明的截短蛋白的方法， 其包括利用大肠杆菌表达系统表达本发明的截短蛋白，然后将含有该 截短蛋白的裂解上清进行纯化处理。

在一个优选实施方案中，获得本发明的截短蛋白的方法包括

a)在大肠杆菌中表达所述截短蛋白，

b)将表达所述截短蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100mM-600mM的溶 液中破碎，分离得到上清液，

c)用水或低盐溶液将b)获得的上清液的盐浓度降至100mM或以 下，最低至0，并收集沉淀，

d)将c)获得的沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解，同时加 入还原剂，分离得到溶液，该溶液中含纯度至少50％的截短的HPV33 L1 蛋白。

更一般性地，本发明还涉及一种获得HPV L1蛋白例如本发明的截 短蛋白的方法，其包括

a)在大肠杆菌中表达编码HPV L1蛋白的HPV L1基因，

b)将表达HPV L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100mM-600mM的溶液 中破碎，分离得到上清液，

c)用水或低盐溶液将b)获得的上清液的盐浓度降至100mM或以 下，最低至0，收集沉淀，

d)将c)获得的沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解，同时加 入还原剂，分离得到溶液，该溶液中含纯度至少50％的HPV L1蛋白。

本发明还涉及一种获得本发明的HPV33病毒样颗粒的方法，其在 获得本发明的截短蛋白的基础上，包括步骤：

e)将纯度至少50％的上述截短的HPV33 L1蛋白进一步通过色谱 层析纯化，

f)将步骤e)中得到的截短蛋白去除还原剂。

本发明还涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HPV33病 毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合，任选地还混合一种或 多种选自HPV6，11，16，18，31，45，52和58的HPV型别的病毒样 颗粒。如上所论述的，所获得的疫苗可以用于预防HPV(特别是HPV33) 感染或由HPV(特别是HPV33)感染所导致的疾病例如宫颈癌等。

在另一个方面，本发明涉及一种预防HPV感染或由HPV感染所导致 的疾病的方法，其包括将预防有效量的根据本发明的HPV33病毒样颗粒 或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中，所述 HPV感染是HPV33感染。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所 导致的疾病包括但不限于，宫颈癌。在另一个优选的实施方案中，所 述受试者是哺乳动物，例如人。

在另一个方面，还涉及根据本发明的截短蛋白或HPV33病毒样颗粒 在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防 HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述 HPV感染是HPV33感染。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所 导致的疾病包括但不限于，宫颈癌。

本发明中相关术语的说明及解释

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词 具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培 养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内 广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关 术语的定义和解释。

根据本发明，表述“N端截短了X个氨基酸的蛋白质”是指，用起 始密码子(用于起始蛋白质翻译)编码的甲硫氨酸残基置换蛋白质N 末端的第1-X位氨基酸残基所获得的蛋白质。例如N端截短了9个氨基 酸的HPV33 L1蛋白是指，用起始密码子编码的甲硫氨酸残基置换野生 型HPV33 L1蛋白N末端的第1-9位氨基酸残基所获得的蛋白质。

根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本 发明的截短的HPV33 L1蛋白(如SEQ ID NO：4，5，6或7所示的蛋白) 的氨基酸序列具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸 不同或者具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％ 的同一性，并且其保留了所述截短蛋白的必要特性。此处术语“必要 特性”可以是如下特性中的一个或者多个：能够诱导针对HPV33的中和 抗体；能够在大肠杆菌中可溶性地表达；利用本发明所涉及的表达纯 化方法能够获得高产率的纯化蛋白。术语“同一性”是对核苷酸序列 或氨基酸序列的相似性的量度。通常将序列排列起来，以获得最大限 度的匹配。“同一性”本身具有本领域公知的意义并且可用公开的算 法(例如BLAST)来计算。

根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株) 与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到 的菌株，例如但不限于：ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。

根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入 其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白 获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染 导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载 体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质 粒等等。

根据本发明，术语“截短的HPV33 L1蛋白”是指在野生型HPV33 L1蛋白的N端和/或C端去掉一个或者多个氨基酸后的蛋白质，其中 野生型HPV33 L1蛋白的例子包括但不限于NCBI数据库中P06416.1， ACV84008.1，ACV84011.1，ACV84012.1或ACL12333.1等全长L1蛋白。

术语“截短的HPV33 L1蛋白基因片段”是指这样的基因片段，其 与野生型HPV33 L1蛋白基因(cDNA)相比，在5′端或3′端去掉编码 一个或多个氨基酸的核苷酸，其中野生型HPV33 L1蛋白基因的全长序 列例如但不限于NCBI数据库中如下序列：GQ479013.1，GQ479014.1， M12732.1，GQ479012.1，GQ479015.1，GQ479016.1，EU918766.1， GQ479017.1，GQ479018.1或GQ479019.1等。

根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理 学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是 本领域公知的(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR，19th ed.Pennsylvania：Mack Publishing  Company，1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐 剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液； 表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂， 例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐 剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

根据本发明，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。 例如，预防疾病(例如HPV感染)有效量是指，能够有效预防，阻止， 或延迟疾病(例如HPV感染)的发生的量。测定这样的有效量在本领 域技术人员的能力范围之内。

根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱(例 如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷 灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。

根据本发明，本发明的截短的HPV33 L1蛋白优选通过如下步骤获 得：将表达截短的HPV33 L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100-600mM， 优选200-500mM的缓冲液中进行破碎，离心破碎溶液，得到上清液； 用水或低盐浓度(通常低于破碎用的盐浓度)的溶液降低所得上清液 的盐浓度至盐浓度100mM-0mM，从而截短的HPV33 L1蛋白在上清液 中沉淀；将沉淀在含还原剂及盐浓度为150-2500mM，优选200mM以 上的溶液中重新溶解，从而分离得到含截短的HPV33 L1蛋白的溶液， 其中所述蛋白的纯度为至少50％，优选至少70％，更优选至少80％。

可用于本发明的方法中的缓冲液是本领域公知的，包括但不限于， Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。

根据本发明，宿主细胞的破碎可通过本领域技术人员熟知的各种 方法来实现，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、 研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。

可用于本发明的方法中的盐包括但不限于酸式盐，碱式盐，中性 盐，例如碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐、碳酸氢盐、 磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、KCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄中的一种或 几种。特别优选的盐是NaCl。可用于本发明的方法中的还原剂包括但 不限于DTT，2-巯基乙醇，其用量包括但不限于10mM-100mM。

根据本发明的HPV33病毒样颗粒可通过如下步骤获得：将上述纯 度至少50％的截短的HPV33 L1蛋白通过例如色谱层析进行进一步分 离，得到经纯化的截短蛋白溶液；去除该溶液中的还原剂，得到所述 HPV33病毒样颗粒。去除还原剂的方式是本领域已知的，包括但不限 于，透析，超滤或者层析等。

发明的有益效果

目前用于制备HPV病毒样颗粒的表达系统可以分为真核表达系统 和原核表达系统。

在真核表达系统中表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少，能自发形 成VLP，往往只需进行简单的纯化过程即可获得具有正确构象的VLP。 但目前真核表达系统例如杆状病毒表达系统和酵母表达系统存在表达 量低，培养成本高等缺陷，给大规模工业化生产带来了极大困难。

在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统具有培养成本低，表达量 大的优点。然而，在大肠杆菌中表达的HPV L1蛋白往往失去正确的天 然构象，以包含体形式表达于沉淀中。目前对表达于包含体中的蛋白 进行复性依然是一个世界性难题。复性困难和效率低下使得从包含体 中获得有正确构象的VLP难以在大规模生产中实施，只能局限于小规 模的实验室研究中。虽然HPV L1也可以以正确构象可溶性地表达于大 肠杆菌中，但是其表达量低下。并且，从包含种类繁多的可溶性蛋白 的大肠杆菌裂解上清中纯化出HPV L1蛋白也相当困难，往往需要借助 融合表达及亲和层析等手段，而这些手段又往往需要昂贵的酶，因此， 仍然无法实现工业化生产。

本发明提供的N端截短的HPV33 L1蛋白和其制备方法有效地解决 了上述问题。首先，本发明使用大肠杆菌表达系统来表达N端截短的 HPV33 L1蛋白，确保了其高表达量。其次，本发明采用温和的手段选 择性沉淀大肠杆菌裂解上清中的截短蛋白，然后采用含盐缓冲液重新 溶解截短蛋白，从而在保持截短蛋白的正确构象的前提下使蛋白纯度 有了显著提高，并且获得的截短蛋白溶液可以直接通过色谱层析例如 离子交换层析及疏水交换层析进行进一步纯化，获得高纯度的目的蛋 白(例如纯度达到96％)。进一步，所获得的高纯度截短蛋白可以组 装为病毒样颗粒，并且该病毒样颗粒可以在体内诱导高滴度的针对 HPV33的中和抗体，具有良好的免疫原性，是一种良好的疫苗形式， 可用于预防HPV33对人体的感染。由此可见，本发明具有以下优点： 本发明的截短蛋白在保留全长HPV33 L1蛋白的抗原性及颗粒组装能力 的同时，可在大肠杆菌表达系统中实现大量表达；本发明所采用的制 备方法无需使用昂贵的酶，成本低廉；截短蛋白在纯化过程中构象没 有经过剧烈的变性复性过程，损失小，产率高；截短蛋白所形成的病 毒样颗粒能够诱导高滴度的针对HPV的保护性抗体，可用于生产疫苗。 因此，本发明的截短蛋白和其制备方法可应用于大规模工业化生产， 并且使大规模工业化生产宫颈癌疫苗成为可能。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但 是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而 不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描 述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显 然。

附图说明

图1显示了在实施例2的不同步骤中获得的HPV33N9C-L1蛋白的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1： 破菌上清(即，破碎菌体后离心获得的上清)；泳道2：无盐沉淀产 物(即，透析后离心获得的沉淀)；泳道3：重溶后上清(即，将无 盐沉淀产物重新溶解后离心获得的上清)；泳道4：重溶后沉淀(即， 将无盐沉淀产物重新溶解后离心获得的沉淀)。结果显示，HPV33N9C-L1 蛋白在通过沉淀，重溶的步骤之后，纯度从之前的约10％提高到了约 70％(参见泳道1和3)。

图2显示了实施例3中经HIC(疏水相互作用色谱)纯化获得的 HPV33N9C-L1的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M：蛋白分子量 标记；泳道1：用Butyl Sepharose 4 Fast Flow柱进行纯化前的样 品；泳道2：Butyl Sepharose 4 Fast Flow柱穿透级分；泳道3：Butyl Sepharose 4 Fast Flow柱200mmol/L NaCl洗脱级分(10μl)。结果 显示，经过Butyl Sepharose 4 Fast Flow柱纯化后，HPV33N9C-L1 蛋白纯度达到98％以上(参见泳道3)。

图3显示了实施例4中所得的HPV33N9C-L1病毒样颗粒的透射电 镜观察(放大50,000倍，Bar＝0.2μm)结果。视野中可见大量半径为 25nm左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。

图4显示了实施例4中所得的HPV33N9C-L1病毒样颗粒的动态光 散射观测结果。结果显示，HPV33N9C-L1病毒样颗粒的水化分子动力 学半径为27.77nm，颗粒组装百分比为100％。

图5显示了实施例5中用HPV33N9C-L1病毒样颗粒接种小鼠后不 同阶段血清的中和抗体滴度。在初次免疫2周后，中和抗体滴度即有 明显上升；在经过一次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到10⁵的 较高水平。

图6显示了实施例5中用HPV33N9C-L1病毒样颗粒接种兔子后不 同阶段血清的中和抗体滴度。在初次免疫1个月后，中和抗体滴度即 有明显上升；在经过一次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到10⁶的较高水平。

图7显示了实施例6得到的N端截短了11个，14个或19个氨基 酸的HPV33 L1蛋白--HPV33N11C-L1，HPV33N14C-L1，HPV33N19C-L1 (其氨基酸序列分别是SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7) 的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M，蛋白分子量标记；泳道1， HPV33N11C-L1蛋白，上样体积为10μl；泳道2，HPV33N14C-L1蛋白， 上样体积为10μl；泳道3，HPV33N19C-L1蛋白，上样体积为10μl。 结果显示，实施例6得到的蛋白HPV33N11C-L1，HPV33N14C-L1， HPV33N19C-L1的蛋白纯度均达到了98％以上。

图8显示了实施例6中所述的HPV33N11C-L1病毒样颗粒的透射电 镜观察(50,000倍，0.2um)结果。结果显示，视野中可见大量半径 为25nm左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。

图9显示了实施例6中所述的HPV33N14C-L1病毒样颗粒的透射电 镜观察(50,000倍，0.2um)结果。结果显示，视野中可见大量半径 为25nm左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。

图10显示了实施例6中所述的HPV33N19C-L1病毒样颗粒的透射 电镜观察(50,000倍，0.2um)结果。结果显示，视野中可见大量半 径为25nm左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。

图11显示了实施例6中所述的HPV33N11C-L1病毒样颗粒的动态 光散射观测结果。结果显示，HPV33N11C-L1病毒样颗粒的水化分子动 力学半径为28.34nm左右，颗粒组装百分比为100％。

图12显示了实施例6中所述的HPV33N14C-L1病毒样颗粒的动态 光散射观测结果。结果显示，HPV33N14C-L1病毒样颗粒的水化分子动 力学半径为26.03nm左右，颗粒组装百分比为100％。

图13显示了实施例6中所述的HPV33N19C-L1病毒样颗粒的动态 光散射观测结果。结果显示，HPV33N19C-L1病毒样颗粒的水化分子动 力学半径为27.11nm左右，颗粒组装百分比为100％。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来 描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检 测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2 版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分 子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所 述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本 领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本 发明所要求保护的范围。

实施例1.具有SEQ ID NO：4所示序列的截短的HPV33 L1蛋白 的表达

HPV33 L1全长基因片段的制备

以从福建省厦门市子宫颈癌病人阴道分泌物中提取的DNA为模 板，HPV33S：5′-CAT ATG TCC GTG TGG CGG CCT AG-3′(SEQ ID NO：12) 为正向引物，HPV33 R：5′-GTC GAC TTA TTT TTT AAC CTT TTT GC-3′ (SEQ ID NO：13)为反向引物，在PCR仪(Biometra，T3)中按照如下 条件进行PCR反应，制备HPV33 L1全长基因片段。

在HPV33阳性的多份标本中，扩增得到大小特异的1.5kb左右的 产物，经测序获得3条HPV33 L1基因序列(SEQ ID NO：1，2和3)。 在本实施例中，示例性地将SEQ ID NO：1作为模板，用于制备编码本 发明的截短蛋白的DNA片段。

截短的HPV33 L1基因的非融合表达载体的构建

以前一个步骤获得的HPV33 L1全长基因片段(SEQ ID NO：1)为 模板，以HPV33N9F：5′-CAT ATg ACA gTg TAC CTg CCT CCT-3′(SEQ  ID NO：14)为正向引物(其5′端引入限制性内切酶NdeI位点CAT ATG， ATG为大肠杆菌系统中的起始密码子)；以HPV33R：5′-GTC GAC TTA TTT TTT AAC CTT TTT GC-3′(SEQ ID NO：13)为反向引物(其5′端引入 限制性内切酶SalI位点)，在PCR热循环仪(Biometra T3)中按照 如下条件进行PCR反应。

扩增得到1.5kb左右的大小特异的DNA片段。将该PCR产物与商 售的pMD 18-T载体(TAKARA公司生产)连接，转入大肠杆菌；提取 质粒，经NdeI/SalI酶切鉴定，得到插入截短的HPV33 L1基因的阳性 克隆pMD 18-T-HPV33N9C-L1。

利用M13(+)/(-)引物，测得pMD 18-T-HPV33N9C-L1质粒中插入 的目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，其编码的氨基酸序列 如SEQ ID NO：4所示。该序列对应的蛋白质为N端被截短9个氨基酸、 C端未被截短的HPV33 L1蛋白，将其命名为HPV33N9C-L1。

将上述的pMD 18-T-HPV33N9C-L1质粒进行NdeI/SalI酶切，获 得HPV33N9C-L1基因片段。再将该片段与经NdeI/SalI酶切的非融合 表达载体pTO-T7(罗文新等，生物工程学报，2000，16：53-57)相连 接，转入ER2566细菌；提取质粒，经NdeI/SalI酶切鉴定得到插入目 的片段的阳性表达克隆pTO-T7-HPV33N9C-L1。

取1μL的pTO-T7-HPV33N9C-L1质粒(0.15mg/ml)转化40μL 以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室 公司)，将其涂布于含卡那霉素(终浓度25mg/mL，下同)的固体LB 培养基(LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠， 下同)，并37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落 至含4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管，在37℃220转/分钟 下振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-70℃保存。

HPV33N9C-L1蛋白的大量表达

从-70℃中取出携带重组质粒pTO-T7-HPV33N9C-L1的大肠杆菌菌 液，接种入50ml含卡那霉素的LB液体培养基中，在200rpm，37℃下 培养大约8小时；然后转接入10瓶500ml含卡那霉素的LB培养基中 (每瓶接入5ml菌液)，在200rpm，37℃下培养过夜，作为种子液。

采用上海保兴生物公司生产的50L发酵罐进行大规模培养。校正 发酵罐PH电极，将30L LB培养基装入发酵罐，原位121℃灭菌30min； 校正溶氧电极，以灭菌后未通气前为零点，以发酵时通气后未接种前 初始搅拌速度100rpm时为100％。

补料准备：配制30％的蛋白胨和酵母膏混合物(20g蛋白胨、10g 酵母膏溶至100ml)，50％的葡萄糖(50g溶至100ml)，121℃灭菌20min。

次日将10瓶种子液共5L接入发酵罐中，设定温度37℃，pH值 7.0，手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧在40％以上。

流加补料：将50％的葡萄糖和30％的蛋白胨和酵母膏混合物按溶质 质量比2∶1的比例混合。

流加速度如下：第一小时：5％；第二小时：10％；第三小时：20％； 第四小时：40％；第五小时及以后60％(以25mL/min为100％)。

当细菌浓度达到OD₆₀₀为10左右时，将培养温度降至25℃，加入 4g IPTG诱导培养4小时。终浓度为大约60(OD₆₀₀)，下罐，离心收 集菌体。获得表达了HPV33N9C-L1蛋白的菌体，重大约2.5kg。

实施例2.纯度约70％的HPV33N9C-L1蛋白的获得

按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl) 的比例重悬菌体。采用APV均质机(An Invensys Group产品)以600bar 压力破碎菌体5次。以13500rpm(30000g)离心菌体破碎液15min，留 取上清(即，破菌上清)。通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测上 清，此时上清中HPV33N9C-L1的纯度约为10％(参见图1，泳道1)。

采用CENTRASETTE 5切向流装置(PALL产品)对上清进行透析， 所用膜包截留分子量为30kDa，透析液为10mM磷酸盐缓冲液pH6.0， 透析体积为三倍上清体积，运行压力为0.5psi，流速为500mL/min， 切向流速为200mL/min。

充分透析后，使用Beckman J25高速离心机以9500rpm(12000g) 离心20min，收获沉淀(即，无盐沉淀产物)。用1/10上清体积的20mM 磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT，300mM NaCl重悬沉淀，搅拌30min， 然后使用Beckman J25高速离心机以13500rpm(30000g)离心20min， 并收获上清和沉淀(即，重溶后沉淀)。使用20mM磷酸盐缓冲液pH8.0， 20mM DTT稀释该上清至3倍体积，以使NaCl终浓度为0.1M，然后使 用0.22μm孔径滤膜进行过滤，所获得的样品(即，重溶后上清)用 于进行阳离子交换色谱纯化(如实施例3所述)。取150μL过滤后样 品，加入30μL 6X Loading Buffer(12％(w/v)SDS，0.6％(w/v) 溴酚蓝，0.3M Tris-HCl pH 6.8，60％(v/v)甘油，5％(v/v)β-巯 基乙醇)，混匀并于80℃水浴10min；然后取10μL于10％SDS-聚丙 烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰染色显示 电泳条带。电泳结果见图1。结果显示，HPV33N9C-L1蛋白在经过沉淀、 重溶的步骤之后，得到了纯化和富集，其纯度从之前的约10％提高到 了约70％(见图1，泳道1和3)。

实施例3：HPV33N9C-L1的色谱纯化

HPV33N9C-L1的阳离子交换色谱纯化

仪器系统：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司) 生产的AKTA explorer 100型制备型液相色谱系统。

层析介质：SP Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司)。

柱体积：5.5cm×20cm。

缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT

20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT，2M NaCl。

流速：25mL/min

检测器波长：280nm。

样品为实施例2中获得的经0.22μm孔径滤膜过滤的、纯度约为 70％的HPV33N9C-L1蛋白溶液。

洗脱程序为：400mM NaCl洗脱杂蛋白，800mM NaCl洗脱目的蛋白， 收集800mM NaCl洗脱级分。

HPV33N9C-L1的CHT II(羟基磷灰石色谱)纯化

仪器系统：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司) 生产的AKTA explorer 100型制备型液相色谱系统。

层析介质：CHT-II(购自Bio-RAD)

柱体积：5.5cm×20cm

缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT

20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mM DTT，2M NaCl。

流速：20mL/min。

检测器波长：280nm。

样品为：前一步骤获得的800mM NaCl洗脱级分，将NaCl浓度稀 释至0.5M。

洗脱程序为：500mM NaCl洗脱杂蛋白，1000mM NaCl洗脱目的蛋 白，收集1000mM NaCl浓度时的洗脱级分。

HPV33N9C-L1的HIC(疏水相互作用色谱)纯化

仪器系统：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司) 生产的AKTA explorer 100型制备型液相色谱系统。

层析介质：Butyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司)。

柱体积：5.5cm×20cm

缓冲液：20mM磷酸缓冲液pH8.0，20mM DTT。

20mM磷酸缓冲液pH8.0，20mM DTT，2M NaCl。

流速：20mL/min。

检测器波长：280nm。

样品为：前一步骤获得的1000mM NaCl洗脱级分。

洗脱程序为：1000mM NaCl洗脱杂蛋白，200mM NaCl洗脱目的蛋 白，收集200mM NaCl浓度时的洗脱级分。

取200mM NaCl浓度时的洗脱级分150μL，加入30μL 6X Loading  Buffer，混匀并于80℃水浴10min；然后取10μl于10％SDS-聚丙烯 酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰染色显示电 泳条带。电泳结果见图2。结果显示，经过上述纯化步骤后， HPV33N9C-L1蛋白的纯度大于98％。

实施例4：HPV33N9C-L1病毒样颗粒的组装

仪器系统为PALL生产的CENTRASETTE 5切向流系统；膜包截留分 子量为30kDa；样品为实施例3所得的纯度大于98％的HPV33N9C-L1。

样品的复性：以复性缓冲液(50mM PB(磷酸钠缓冲液)pH 6.0， 2mM CaCl₂，2mM MgCl₂，0.5M NaCl，0.003％Tween-80)充分交换样 品缓冲液，交换体积为样品原始体积的10倍以上。切向流装置的运行 压力为0.5psi，切向流速度为10mL/min。在复性缓冲液交换完后，用 储存缓冲液(20mM PB(磷酸钠缓冲液)pH 6.5，0.5M NaCl)进行交 换，交换体积为样品体积4倍以上。切向流装置的运行压力为0.5psi， 切向流速度为25mL/min。交换完毕后，使用PALL 0.20μm滤器无菌过 滤样品，得到HPV33N9C-L1病毒样颗粒，将其置于4℃保存备用。

实施例5：HPV33N9C-L1 VLP的形态学检测及其免疫原性的测定

HPV33N9C-L1病毒样颗粒的透射电镜观察

使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为 100,000倍。将实施例4所得HPV33N9C-L1病毒样颗粒用2％磷钨酸 pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上，进行观察。电镜结果见图3，其中 可见大量半径为25nm左右的病毒样颗粒，大小均匀，呈现为空心形态。

HPV33N9C-L1病毒样颗粒动态光散射观察

使用的仪器为美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X 型动态光散射仪(含温度控制器)，使用的算法为Regulation算法。 样品为实施例4所得HPV33N9C-L1病毒样颗粒。样品经0.22μm滤膜 过滤后进行测量。测量结果见图4。结果显示，HPV33N9C-L1 VLP的水 化分子动力学半径为27.77nm。

HPV33假病毒中和细胞模型的建立

由于HPV难以在体外进行培养，而且HPV宿主特异性强，难以在 人以外的宿主上繁殖，缺乏合适的动物模型，因此，为了能对HPV疫 苗的免疫保护性进行快速评估，需要建立有效的体外中和实验模型。

假病毒(pseudovirions)体外感染模型：利用HPV VLP可非特异 性包装核酸的特性，通过在细胞内表达HPV的L1和L2蛋白，通过包裹 细胞内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒，组成HPV假病毒 (Yeager，M.D，Aste-Amezaga，M.et al(2000)Virology(278)570 -7)。具体方法包括重组病毒表达系统法及多质粒共转染方法。本实 施例示例性采用多质粒共转染方法。

HPV假病毒的构建方法如下：

用CsCl密度梯度离心方法分别纯化质粒p33L1h(携带编码HPV33 L1蛋白(NCBI数据库，P06416.1)的核苷酸序列的pAAV载体)、质粒 p33L2h(携带编码HPV33 L2蛋白(NCBI数据库，P06418.1)的核苷酸 序列的pAAV载体)及带有绿色荧光蛋白基因的质粒pN31-EGFP (pN31-EGFP和上述的pAAV载体均由NIH的John T.Schiller教授馈 赠)。利用CsCl密度梯度离心来纯化质粒的方法是本领域公知的，参 见《分子克隆：第三版》。

使用磷酸钙转染法，用纯化后的p33L1h、p33L2h、pN31-EGFP各 40μg共转染培育于10cm细胞培养皿中的293FT细胞(Invitrogen)。 磷酸钙转染法是本领域公知的，参见《分子克隆：第三版》。简言之， 将p33L1h、p33L2h、pN31-EGFP各40μg加入1mL的HEPES溶液(每 50mL去离子水含有pH＝7.3的1M Hepes 125μL，4℃储存)和1mL的 0.5mol/L CaCl₂溶液的混合溶液中，混匀，然后逐滴加入2mL 2×HeBS 溶液(0.28M NaCl(16.36g)，0.05M HEPES(11.9g)，1.5mM Na₂HPO₄(0.213g)，溶解于1000mL去离子水，pH＝6.96，-70℃储存)中，室 温下静置1min；然后将混合液加入培养有293FT细胞的10cm细胞培 养皿中，培养6hr；然后弃去原培养液，加入10mL新鲜的完全培养液 (Invitrogen公司)。转染48hr后，弃去培养基，用PBS清洗细胞2 次；然后将细胞刮下收集细胞，进行细胞计数，并且每10⁸个细胞用 1mL裂解液(0.25％Brij58，9.5mM MgCl₂)重悬。裂解后，以5000g 离心10min，收集上清，加入5M NaCl(终浓度为850mM)，从而获得 假病毒液，将其分装为小份后置于-20℃保存。

抗体中和滴度的测定

将293FT细胞(Invitrogen)铺于96孔细胞培养板中(1.5×10⁴/ 孔)。5hr后如下进行中和实验：将待测的血清样品(含待测抗体) 分别用10％DMEM进行连续倍比稀释，然后取50μL各个经稀释的样品 分别与50μL稀释于10％DMEM中的如上制备的假病毒液混合 (moi＝0.1)；在4℃下孵育1h后，将混合物分别加入预铺有293FT 细胞的96孔细胞培养板中，并在37℃培养72h；然后先通过荧光观察 确定各样品大概的抗体滴度，再用流式细胞仪(EPICS XL，美国Beckman  Coulter公司)检测各孔细胞的感染率，计算血清的准确抗体滴度。 感染率为待测细胞样品在阳性区中的细胞数量百分率减去未感染的对 照细胞样品在阳性区中的数量百分率。

感染抑制率＝(1-加入血清的孔的感染率/未加入血清的孔的感 染率)×100％。

抗体中和滴度的定义为：达到高于50％感染抑制率的最大稀释倍 数。经50倍稀释后仍能达到50％以上感染抑制率的抗体被视为具有 中和能力。

HPV33 VLP用于免疫动物的免疫保护性的评价

使用小鼠来评价本发明的HPV33 VLP的免疫保护性。免疫用动物 为4-5周龄SPF级BALB/c小鼠8只。根据实施例1-4所述方法制备 HPV33N9C-L1病毒样颗粒。将该颗粒稀释至0.1mg/ml，然后加入等体 积的完全弗氏佐剂(用于初次免疫)或等体积的不完全弗氏佐剂(用 于加强免疫)，混合均匀。免疫程序为：0周时初次免疫；2，4和6 周时加强。免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为10μg/只，加强免 疫剂量为10μg/只。

初次免疫后，每2周抽取外周静脉血，分离血清。然后根据上述 方法检测小鼠血清中针对HPV33假病毒颗粒的中和抗体滴度。检测结 果如图5所示。结果表明，根据实施例1-4所述方法获得的 HPV33N9C-L1病毒样颗粒具有良好的免疫原性，可在小鼠体内诱导高 滴度的针对HPV33的中和抗体，可用作预防HPV33感染的有效疫苗。 除了使用弗氏佐剂外，该疫苗也可使用本领域公知的其他佐剂，例如 氢氧化铝或磷酸铝佐剂。

还使用兔子来评价本发明的HPV33 VLP的免疫保护性。免疫用动 物为6～8周龄普通级雌性兔4只(购自广西省疾病预防与控制中心)。 将实施例1-4所制备的HPV33N9C-L1病毒样颗粒稀释至1.0mg/ml，然 后加入等体积的完全弗氏佐剂(用于初次免疫)或等体积的不完全弗 氏佐剂(用于加强免疫)，混合均匀。免疫程序为：0周时初次免疫； 4，8和12周时加强。免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为1.0mg/ 只，加强免疫剂量为1.0mg/只。

初次免疫后，每2周抽取外周静脉血，分离血清。然后根据上述 方法检测兔子血清中针对HPV33假病毒颗粒的中和抗体滴度。检测结 果如图6所示。结果表明，根据实施例1-4所述方法获得的 HPV33N9C-L1病毒样颗粒具有良好的免疫原性，可在兔子体内诱导高 滴度的针对HPV33的中和抗体，可用作预防HPV33感染的有效疫苗。 除了使用弗氏佐剂外，该疫苗也可使用本领域公知的其他佐剂，例如 氢氧化铝或磷酸铝佐剂。

以上结果表明，通过本发明的方法获得的HPV33病毒样颗粒具有 良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，从而可用作 预防HPV感染的疫苗。

实施例6：HPV33N11C-L1，HPV33N14C-L1，HPV33N19C-L1蛋白和 病毒样颗粒的制备以及形态学观察

依据实施例1-3描述的方法，制备和纯化N端截短了11个，14 个或19个氨基酸的HPV33 L1蛋白(其氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5， 6，7；核苷酸序列分别为SEQ ID NO：9，10，11)。这些蛋白质的纯 度都达到98％以上(见图7)。

依据实施例4的方法，将经纯化的HPV33N11C-L1，HPV33N14C-L1， HPV33N19C-L1蛋白组装成病毒样颗粒。

依据实施例5描述的方法，对HPV33N11C-L1，HPV33N14C-L1， HPV33N19C-L1病毒样颗粒进行透射电镜观察和动态光散射观察。结果 示于图8-13。图8，9和10显示，这些截短蛋白可形成半径为25nm 左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。图11， 12和13显示，这些病毒样颗粒的水化分子动力学半径在27nm左右， 颗粒组装百分比为100％。

另外，通过使用实施例5描述的方法可证实，本发明所获得的 HPV33N11C-L1，HPV33N14C-L1，HPV33N19C-L1病毒样颗粒同样具有良 好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，从而可用作预 防HPV感染的疫苗。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术 人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和 变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。