用β-半乳糖苷酶催化水解甜菊糖苷制备悬钩子苷的方法

摘要

一种用β-半乳糖苷酶催化水解甜菊糖苷制备悬钩子苷的方法，属于有机化合物的生物合成技术领域。本发明以β-半乳糖苷酶选择性催化水解从甜叶菊提取物中获得的甜菊糖苷，用以制备悬钩子苷，具有转化率高、速度快、选择性高、分离纯化简单等优点。本发明提供了一种高效、环境友好的新方法以制备悬钩子苷。

说明书

技术领域

本发明属于有机化合物的生物合成技术领域，具体涉及一种用β-半乳糖苷酶催化水解甜菊糖苷制备悬钩子苷的方法。

背景技术

悬钩子苷(又名甜茶甙或甜茶素，Rubusoside，Ru)为广西甜茶(Rubus usavissmius. S Lee)的主要甜味成分，具有高甜度、低热值、天然无毒等特点，对有糖尿病人或“三高”人群都有很好的保健作用。但甜茶的种植区域范围小、产量低，目前只有屈指可数几家广西公司从事悬钩子苷的生产，产品纯度最高仅为70%左右，成分复杂，含有甜菊醇和甜菊单糖苷等物质。

甜菊糖苷(13-[(2-O-β-D-Glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]kaur-16-en -18-oic acid β-D-glucopyranosyl ester，stevioside，以下简称St)是从甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)中提取出的四环二萜类化合物，是一种具有后苦涩味的甜味剂，可以低成本大量生产。St水解后可以得到甜菊醇、异甜菊醇、甜菊双糖苷、悬钩子苷或者其混合物；各组分含量取决于水解的选择性。化学水解时，完全水解St可以得到甜菊醇或异甜菊醇，部分水解则得到上述多种化合物。通过酶催化方法水解St有希望利用酶的高区域选择性，只水解St分子中β-1,2糖苷键，专一性的得到悬钩子苷。

St被各种催化剂水解的方程式如下：

陈育如课题组报道的用于食品添加剂领域的悬钩子苷的制备方法，其所用催化剂为黄杆菌(黄杆菌属，Chryseobacterium sp.)产出的葡萄糖苷酶。但仅从质谱等分析手段表征产物，缺乏结构表征，不能证明得到的物质是悬钩子苷还是其同分异构体甜菊双糖苷，且反应时间需要48 h，底物浓度低达为10g/L，产物分离困难，同时该菌属的安全性值得商榷。

发明内容

本发明的目的是提供一种用β-半乳催化水解甜菊糖苷制备悬钩子苷的方法。本发明筛选出来源于aspergillus oryzae的β-半乳糖苷酶，对St和β-1,2葡萄糖苷键具有高区域选择性，制备出附加值高于St数倍的悬钩子苷。生产过程绿色环保，产品分离纯化简单，纯度高。

本发明的目的可以通过如下的技术方案达到：以甜菊糖苷St或者含有St的甜菊叶提取物(还含有莱鲍迪甙A (RA)、莱鲍迪甙C (RC)等为底物，将底物用水或缓冲液配制成10-200mg/mL的反应液，50 ^oC-65 ^oC下恒温0.3h-0.7h后加入β-半乳糖苷酶(加酶量为2000-14000 U/g St，U为FCCIV法测定的酶活)，反应至转化率不再升高。St转化率可参照国标(GB8270-1999)通过HPLC外标法测定 (式1)。对反应液进行浓缩、重结晶、柱层析等纯化工序后即得到高纯度产物。比较产物与市售悬钩子苷两者的UPLC，保留时间均为1.3min左右(图1，图2)；通过一级、二级质谱确定产物分子量为643，即St(分子量为805)失去一个葡萄糖残基(分子量为162) (图2，图3)；以氘代吡啶为溶剂对产物进行核磁表征，产物¹³CNMR数据与多篇悬钩子苷文献报道一致，产物的C19(见方程式)的化学位移值为177.3，这是一个特征谱线(图4)；结合上面所有分析，可以判断得到的产物为悬钩子苷。

式 1

X_t：t时间St的转化率；

C₀：初始St的浓度(mg/mL)；

C_t：t时间St的浓度(mg/mL)；

所说的缓冲液为pH 4.0-5.4的醋酸缓冲液或者pH 6.0的磷酸缓冲液。

所说的β-半乳糖苷酶来源于aspergillus oryzae，其形态是酶液或固定化酶。

本发明β-半乳糖苷酶催化甜菊糖苷制备悬钩子苷的反应方程式如下：

本发明的有益效果：提供了一种用β-半乳糖苷酶催化水解甜菊糖苷制备悬钩子苷的方法，所使用的酶制剂为食品工业用酶制剂，反应条件温和、选择性高、产率高、产物分离纯化简单。拓展了劣质甜菊糖苷St的用途，大大提升其附加值。

附图说明

图1 市售天然悬钩子苷产品(含量70%)的UPLC(a)和总离子流图(b)。

图2 本发明产物的UPLC(a)、总离子流图(b)和641.5(产物M-1)碎片离子二级离子流图(c)。

图3 本发明产物的一级质谱(a)和二级质谱(b)。

图4 本发明专利产物的¹³CNMR。

图5 HPLC分析不同时间取样组成。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明，但并不以任何方式限制本发明。

实施例1

将20g St溶解在100mL去离子水中，放入水浴摇床中震摇并在50 ^oC下恒温0.5h，摇床转速为150rpm；加入β-半乳糖苷酶酶液14000U/g St；反应4h后，至St转化率不再上升。St转化率为99%。煮沸反应液10min灭酶活，离心后取上清液浓缩干燥。在20mL甲醇中加入2g粗产品；连续搅拌并加热至回流；逐渐滴加甲醇直至溶液澄清，甲醇总加入量为160mL左右；放置自然冷却析出晶体，抽滤、干燥晶体；重复上述步骤进行二次重结晶，最后可以得到含量大于97%的产品1.2g。选用柱层析硅胶(200-300目)，以氯仿、甲醇和水为洗脱剂5:5:1(v/v/v)，按照硅胶质量的2%上样，流速为1mL/min，分段收集洗脱剂，用HPLC(国标GB8270-1999)分析每段洗脱液组成，最后将含目标化合物的洗脱液合并、浓缩、干燥，即可得含量大为于98%的悬钩子苷。产物的具体表征如技术方案部分所述。

实施例2

首先对酶进行固定化，AB-8树脂0.1g，0.5mL酶液溶解于pH6的磷酸缓冲液配制成20mL体系，温度为4^oC下固定5h，固定化后的β-半乳糖苷酶在5%的CaCl₂溶液保存，FCCIV法测定其酶活为20000U/g。将1g St溶解在100mL去离子水中，放入水浴摇床中震摇并在50 ^oC下恒温0.5h，摇床转速为150rpm；加入固定化β-半乳糖苷酶反应10000U/g St；定时取样进行HPLC分析，直至St转化率不再变化(图5)。反应液中主要为悬钩子苷和水解出的葡萄糖。回收固定化酶，浓缩干燥所得悬钩子苷粗品(80%悬钩子苷，20%葡萄糖，w/w)即可用于食品等领域中。产物的具体表征如技术方案部分所述。

实施例3

将1g St溶解在100mL去离子水中，放入水浴摇床中震摇并在50 ^oC下恒温0.5h，摇床转速为150rpm；加入固定化β-半乳糖苷酶10000U/g St；反应5h至St转化率不再上升。回收固定化酶，通过重结晶纯化即可得含量大于97%的悬钩子苷。产物的具体表征如技术方案部分所述。

实施例4

将4g St粗品(St 50%)溶解在200mL去离子水中，放入水浴摇床中震摇并在65 ^oC下恒温0.5h，摇床转速为150rpm；加入固定化β-半乳糖苷酶2000U/g St；反应5h后，通过HPLC分析发现仅有St全部转化为悬钩子苷，其他成分转化率<5%。产物的具体表征如技术方案部分所述。

实施例5

将4g St粗品(St 90%)溶解在200mL去离子水中，放入水浴摇床中震摇并在65 ^oC下恒温0.5h，摇床转速为150rpm；加入固定化β-半乳糖苷酶2000U/g St；反应5h后，通过HPLC分析发现仅有St全部转化为悬钩子苷，其他成分转化率<5%。产物的具体表征如技术方案部分所述。

实施例6

将1g St溶解在100mL醋酸缓冲液(pH 4.5，50mM)中，放入水浴摇床中震摇并在50 ^oC下恒温0.5h，摇床转速为150rpm；加入固定化β-半乳糖苷酶4000U/g St；反应5h后，St转化率不再上升，通过重结晶即可得含量大于97%的悬钩子苷。产物的具体表征如技术方案部分所述。

实施例7

将1g St溶解在100mL磷酸缓冲液(pH 6.0，50mM)中，放入水浴摇床中震摇并在50 ^oC下恒温0.5h，摇床转速为150rpm；加入固定化β-半乳糖苷酶4000U/g St；反应5h后St转化率不再上升。回收固定化酶，通过甲醇重结晶即可得含量大于97%的悬钩子苷。产物的具体表征如技术方案部分所述。

实施例8

将2g St溶解在100mL水中，放入水浴摇床中震摇并在65 ^oC下恒温0.5h，摇床转速为150rpm；加入固定化β-半乳糖苷酶7000U/g St；反应5h后St转化率不再上升。回收固定化酶，通过甲醇重结晶即可得含量大于97%的悬钩子苷。产物的具体表征如技术方案部分所述。

实施例9

将200g St溶解在1L去离子水中，放入水浴摇床中震摇并在60 ^oC下恒温0.7h，摇床转速为150rpm；加入固定化β-半乳糖苷酶10000U/g St；反应6h后St转化率不再上升。回收固定化酶，首先甲醇重结晶初步提纯，再通过柱层析进一步纯化即得含量大于98%的悬钩子苷。产物的具体表征如技术方案部分所述。