用于检测水体中微囊藻毒素的PCR引物及其应用

摘要

一种用于检测水体中微囊藻毒素的PCR引物，根据微囊藻毒素生物合成途径中不同区域共设计了6对特异性引物。本发明还公开了该PCR引物的应用。通过特异性评估分析显示，应用该6对引物进行的微囊藻毒素检测结果与LC-MS检测结果一致，且PCR扩增结果条带单一。相对于水体中传统的微囊藻毒素的检测，运用成熟的PCR技术该6对引物可以快速，灵敏的检测水体中是否存在微囊藻毒素，从而大大提高检测的灵敏度和效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测水体中微囊藻毒素的PCR引物，本发明还涉及该PCR引 物在水体中检测微囊藻毒素的应用。

背景技术

蓝藻又名“蓝绿藻”，在一些营养丰富的水体中，某些蓝藻常于夏季大量繁殖形成 “水华”。在引起水质恶化的同时，某些“水华”种类还会产生具有生物毒性的次生代 谢产物，称为“蓝藻毒素”。这些蓝藻毒素的释放直接对鱼类、人畜产生危害。蓝藻毒 素依据其最终导致的病症的不同可以分为四大类：神经毒素、肝毒素、细胞毒素以及刺 激性毒素(irritant toxins)。在这四类毒素中，肝毒素即微囊藻毒素(microcystin)对公 众的健康危害最大，严重的会引起其死亡。因此，围绕如何检测、控制和消除蓝藻毒素， 各国的科学工作者开展了大量的研究工作。

对于微囊藻毒素的检测，早期通过构建相应的生物模型进行生物毒性实验以检测水 体中是否有蓝藻毒素存在。然而，较低的灵敏度、较高的实验耗费以及生物毒性实验带 来的一系列伦理问题，使得人们不得不选择别的方法来对蓝藻毒素进行诊断。随着微量 样品分析仪器(如，HPLC、MALDI-TOF)的发展，依托这些仪器开发出多种用于检测 自然水体中蓝藻毒素的方法。这些方法分析过程简单快捷并且具有很高的灵敏度。然而， 由于分析仪器对样品的前处理有着很高的要求，因此在实际运用中，样品的处理变得既 费时又费力，并且昂贵的分析仪器和标准品也使得许多实验室无法开展对蓝藻毒素的诊 断。同时，依靠免疫学和生物化学的方法开发出的诊断手段也逐渐运用于实验室或自然 环境水体中蓝藻毒素的检测。如，对肝毒素(microcystin和nodularin)进行检测的ELISA 方法、比色法(蛋白磷酸酶抑制剂)和细胞毒性诊断。

然而，前述多种诊断方法，均以释放至水体中的微囊藻毒素为检测对象，不能在毒 素从藻细胞内释放到水体之前对其进行预判断。无法通过这些方法对潜在的产毒蓝藻进 行预检。相对于传统的微囊藻毒素检测技术，运用成熟的PCR技术结合高效，特异的 针对微囊藻毒素合成基因的引物可以快速，灵敏的检测水体中是否存在产毒基因进而可 以确定水体中是否含有或可能会产生微囊藻毒素，从而在增加检测的灵敏度的同时也提 高了毒素检测的预判力。总所周知，PCR检测技术的关键是引物的特异性，好的特异性 引物可以使得PCR结果清晰、条带单一，同时还能避免假阳性的产生。因此，引物的 设计与发明对于能否成功将PCR技术运用于微囊藻毒素检测就显的尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种用于检测水体中微 囊藻毒素的PCR引物，针对微囊藻毒素生物合成途径中不同区域共设计了6对特异性 引物。

微囊藻毒素的生物合成基因簇中，mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE、mcyG这 6个主要大片段基因对微囊藻毒素的合成具有举足轻重的作用。另一方面，非产毒微囊 藻也可能含有部分产毒基因。因此，我们针对微囊藻毒素合成基因簇设计了6对引物。 以通过多对引物的相互矫正来排除假阳性的产生，同时也使得6对引物具有相同的退火 温度，可同时进行PCR扩增，提高扩增效率。

引物的设计理念：针对微囊藻毒素基因簇中的mcyA基因编码的Ala-D和Mdha的 A结构域设计合成引物对MCYAAAF\MCYAAAR和MCYAMAF\MCYAMAR；针对 mcyB基因编码的D-MeAsp的A结构域设计合成引物对MCYBAF\MCYBAR；针对mcyE 基因编码的D-Glu的A结构域设计合成引物对MCYEAF\MCYEAR；mcyG基因编码的 Adda的A结构域设计合成引物对MCYGAF\MCYGAR；针对mcyE基因编码的KS domain，mcyG基因编码的KS domain，mcyD基因编码的KS domain1及KS domain2 合成引物对MCYKSF\MCYKSR。

6对引物的详细信息：

与现有技术相比，本发明的优点在于：通过特异性评估分析显示，应用6对引物进 行的微囊藻毒素检测结果与LC-MS检测结果一致，且PCR扩增结果条带单一。同时， 6对引物具有相同的退火温度，可同时进行PCR扩增，避免由于单对引物检测形成假阳 性的现象。综上所述，相对于水体中传统的微囊藻毒素的检测，运用成熟的PCR技术 该6对引物可以快速，灵敏的检测水体中是否存在微囊藻毒素，从而大大提高检测的灵 敏度和效率。

附图说明

图1为实施例中引物组MCYAMAF\MCYAMAR的PCR扩增结果。

图2为实施例中引物组MCYBAF\MCYBAR的PCR扩增结果

图3为实施例中引物组MCYGAF\MCYGAR的PCR扩增结果。

图4为实施例中引物组MCYAAAF\MCYAAAR的PCR扩增结果。

图5为实施例中引物组MCYEAF\MCYEAR的PCR扩增结果

图6为实施例中引物组MCYKSF\MCYKSR的PCR扩增结果。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施实例：

1、藻种培养：从中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB Collection) 购买十株藻种，其中3株Microcystis aeruginosa(MA-1、MA-2、MA-3)，2株 Microcystis-flos-aquae(MF-2、MF-3)，2株Microcystis wesenbergii(MW-1、MW-2)，1 株Microcystis elabens(ME-1)，1株Microcystis viridis(MV-1)，1株Microcystis ichy0blabe(MI-1)。采用BG11液体培养基培养，室内温度25℃，光照强度为 1000-1500lux，光暗比为12∶12，每天摇瓶1-2次，静置培养。

2、毒素分析：采用液相色谱-三重四极杆质谱仪(LC-MS)作毒素分析，分析结果 (表1)：

表1十株微囊藻毒素的LC-MS分析结果

注：表中MCYST为microcystin，“no”表示未检测到毒素

3、毒素合成基因簇的PCR检测：用我们设计的6对针对微囊藻毒素合成基因簇设 计的引物对十株微囊藻进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL体系。毒素合成基因PCR 反应条件为：94℃min；94℃30s，50℃30s，72℃30s；30个循环；72℃3min。 PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图1～图6所示，PCR条带特异且单一。其中图1、 图2、图3、图5和图6中M：Marker2000分子量标准，1-11分别为：MF-2、MF-3、 MI-1、MA-1、MW-1、ME-1、MA-2、MA-3、MW-2、MV-1、空白对照。图4中M： Marker2000分子量标准，1-11分别为：MF-2、MF-3、MI-1、MA-1、MW-1、MW-2、 MA-2、MA-3、ME-1、MV-1、空白对照。

4、PCR结果与LC-MS分析结果的比较：通过将PCR结果与LC-MS分析结果进行 比较，我们发现6对引物的扩增结果与LC-MS分析结果有高度的一致性(表2)。

表2毒素基因PCR扩增结果与LC-MS结果比较

注：“-”：表示结果为阴性，“+”：表示为阳性。

从以上实验数据可以看出，本发明的针对微囊藻毒素合成基因簇设计的6对引物， 能通过多对引物的相互矫正来排除假阳性的产生，除此之外，6对引物具有相同的退火 温度，可同时进行PCR扩增，大大地提高扩增效率。