野野村放线菌发酵生产A40926的发酵培养基以及发酵方法

摘要

本发明提供了一种有利于野野村放线菌(Nonomuraea.sp)高效发酵生产抗生素A40926的发酵培养基以及相应的发酵方法。该发酵培养基包括碳源和氮源，其中所述的碳源是有机碳源，含量是5-180g/L，所述的氮源是有机氮源，含量是2-210g/L，所述的含量按培养基的总体积计。本发明通过优选发酵培养基的碳氮源成分及配比，优化培养温度、PH等发酵参数，从而大大提高A40926的产量。提供的发酵生产方法，大幅提高了A40926的发酵单位，适用于A40926的规模化生产。

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，特别涉及一种新的野野村放线菌发酵生产抗生素A40926的发酵培养基以及相应的发酵方法。

背景技术

1984年，科学家在培养分离自土壤的马杜拉(Actinomadura)品系菌时发现了抗生素A40926。并于1984年6月8日将菌株保藏于美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection，ATCC)，编号ATCC39727。该品系最初被认为属于链霉菌属，后经进一步研究，特别是对细胞壁合成的研究，在2003年，将其产生菌归类于野野村放线菌属(Nonomuraea.sp)。A40926属于万古霉素类抗生素，具有结合酰基-D-丙胺酰基-D-丙氨酸的能力。对革兰氏阳性菌以及淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)具有较好的抗菌效果，且具有较长的半衰期。

达巴万星是以A40926为前体的半合成糖肽类抗生素。达巴万星最先是由Vicuron公司开发研究，目前正处于III期临床试验。达巴万星对革兰氏阳性菌具有很好的抗菌活性，其作用机制同万古霉素和替考拉宁相同，主要用于治疗由革兰氏阳性菌引起的复杂性皮肤、软组织感染。但其更强的生物活性和更长的半衰期使其具有更诱人的开发前景。随着耐药菌的不断出现，而具有良好抗MRSA和VRE作用的抗生素却开发缓慢。因此，达巴万星的出现给临床治疗耐药菌带来了新的希望和突破，而其前体A40926的微生物发酵工艺也倍受业内人士的瞩目。目前，A40926主要由意大利的VicuronPharmaceuticals制药公司通过发酵进行生产，但其报道的发酵配方仅为一些简单的无机盐培养基，培养温度为28℃，培养时间160h。由于其发酵培养基种的营养成分仅为一些简单的无机盐，菌体活力较差，发酵单位较低，其报道的最高发酵单位为128mg/L，而目前国内外的新的发酵工艺未见有报道。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的利用野野村放线菌发酵生产抗生素A40926发酵单位低的不足，提供一种新的用于野野村放线菌发酵生产抗生素A40926的发酵培养基以及相应的发酵方法，其可以大大提高A40926的发酵单位，提高生产效率。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种用于野野村放线菌(Nonomuraea.sp)发酵生产抗生素A40926的发酵培养基，包括碳源和氮源，其中，所述的碳源是有机碳源，含量是5-180g/L，所述的氮源是有机氮源，含量是2-210g/L，所述的含量按培养基的总体积计。

在本发明的发酵培养基中，所述的有机碳源包括培养基中常用的各种有机碳源，较佳的为选自葡萄糖、麦芽糊精、玉米淀粉和可溶性淀粉中的一种或多种，更佳的是葡萄糖和选自麦芽糊精、玉米淀粉和可溶性淀粉中的至少一种的混合物。有机碳源的用量5-180g/L，优选15-100g/L。其中葡萄糖较优的范围为5-20g/L，麦芽糊精较优的范围为10-80g/L，玉米淀粉较优的范围为10-60g/L，可溶性淀粉较优的范围为5-20g/L。

在本发明的发酵培养基中，所述的有机氮源包括培养基中常用的各种有机氮源，较佳的为选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、蛋白胨和酵母浸膏(粉)中的一种或多种。所述的黄豆饼粉较佳的可以选自热榨黄豆饼粉和/或冷榨黄豆饼粉。所述蛋白胨较佳的是大豆蛋白胨、胰蛋白胨和肉蛋白胨中的一种或多种。所述的酵母浸膏(粉)是采用新鲜酵母乳液经自溶、酶解、分离、浓缩等技术精制而成的一种可溶性膏状或粉状纯天然制品。所述的有机氮源更佳的是选自黄豆饼粉、棉籽饼粉和蛋白胨中的至少一种和选自酵母浸粉和酵母浸膏中的至少一种的混合物。有机氮源的用量为2-210g/L，优选30-50g/L。其中热榨黄豆饼粉较优的范围为5-40g/L，冷榨黄豆饼粉较优的范围为5-40g/L，棉籽饼粉较优的范围为5-30g/L，大豆蛋白胨较优的范围为2-20g/L，胰蛋白胨较优的范围为2-20g/L，肉蛋白胨较优的范围为2-20g/L，酵母浸粉较优的范围为5-100g/L，酵母浸膏较优的范围为5-100g/L。

本发明的发酵培养基中，如常规的野野村放线菌的发酵培养基一样，较佳的还进一步包含氨基酸。所述的氨基酸优选缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中的一种或多种，最佳的是缬氨酸。氨基酸的用量为0.5-3.0g/L，较优的范围为1.0-2.5g/L。

在本发明的发酵培养基中，较佳的还进一步包含金属离子。所述的金属离子优选铜离子、镁离子和亚铁离子中的一种或多种。金属离子的用量为0.05ppm-12.0ppm，较优的范围为0.5-10.0ppm。

本发明的发酵培养基中，如常规的野野村放线菌的发酵培养基一样，较佳的还进一步含有矿物质。所述的矿物质一般作为渗透压调节剂，其用量较佳的是1.0-5.0g/L。所述的矿物盐可以是常规的发酵培养基中所使用的各种矿物盐，较佳的是NaCl。

本发明的发酵培养基如常规的抗生链霉菌的发酵培养基一样，较佳的还可以含有消泡剂。消泡剂的用量为常规用量。

本发明的一较佳的实施例是，本发明的发酵培养基包含：

5-20g/L葡萄糖；

5-80g/L麦芽糊精、玉米淀粉和可溶性淀粉中的至少一种；

2-40g/L黄豆饼粉、棉籽饼粉和蛋白胨中的至少一种；

5-100g/L酵母浸膏和酵母浸膏粉中的至少一种；和

0.5-3.0g/L缬氨酸。

本发明的另一较佳的实施例是，本发明的发酵培养基包含：葡萄糖5-20g/L、糊精10-80g/L、玉米淀粉10-60g/L、冷榨黄豆饼粉5-40g/L、棉籽饼粉5-30g/L、大豆蛋白胨2-20g/L、肉蛋白胨2-20g/L、酵母浸粉5-100g/L、缬氨酸0.5-3.0g/L、NaCl 1.0-5.0g/L和CuSO₄ 0.5-10.0ppm。

本发明的发酵培养基的pH值较佳的是pH5.0-8.5，更佳的是pH5.5-8.0。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种抗生素A40926的发酵生产方法，包括步骤：

(a)将野野村放线菌(Nonomuraea.sp)的种子液接种于发酵培养基中进行液体发酵培养，所述的发酵培养基是如上所述的任一项发酵培养基；

(b)从发酵液中分离出抗生素A40926。

在步骤(a)中，所述的野野村放线菌的种子液是按常规的方法将野野村放线菌在种子培养基中培养而得到的。所述的种子培养基可以是现有的野野村放线菌的种子培养基，较佳选自ISP2培养基和M707培养基。种子培养的温度较佳的是25-32℃。

本发明中，所述的野野村放线菌可以是现有的各种抗生链霉菌菌株，较佳的是野野村放线菌ATCC39727。

在步骤(a)中，所述的发酵培养的温度是20-40℃，较优的为25-37℃；优选的pH为5.0-8.5，较优的范围为5.5-8.0。

在步骤(b)中，从发酵液中分离出抗生素A40926的方法可以是常规的方法，一般是将发酵液调节至碱性，50℃温育后离心取上清，从上清中获得抗生素A40926。

本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明提供了一种有利于野野村放线菌高效发酵生产抗生素A40926的发酵培养基以及相应的发酵方法。通过优选发酵培养基的碳氮源成分及配比，优化培养温度、pH等发酵参数，从而大大提高A40926的产量。本发明提供的A40926的发酵生产方法大幅提高了A40926的发酵单位，适用于A40926的规模化生产。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

取一株野野村放线菌(Nonomuraea.sp)ATCC39727划线于种子斜面培养基，30℃培养7d后接种于摇瓶种子培养基，装液量为20ml/250ml，于30℃，200rpm的旋转式摇床培养72h。种子液以10％(v/v)接种量接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度30℃，发酵周期5d。发酵结束后将发酵液用NaOH调pH至12.0，50℃温育1h后离心取上清，HPLC测定，A40926产量达366mg/L。

其中所用的斜面培养基组成：ISP2培养基，组分为葡萄糖4.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，麦芽浸粉10.0g/L，琼脂粉20g/L，pH7.3。

所用的种子培养基组成：ISP2培养基，组分为葡萄糖4.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，麦芽浸粉10.0g/L，pH7.3。

发酵培养基的组成：葡萄糖5.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，肉蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，冷榨黄豆饼粉10.0g/L，棉籽饼粉5.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，CuSO₄0.75ppm，pH8.0。

实施例2

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精5.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，热榨黄豆饼粉20.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926产量达98mg/L。

实施例3

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精5.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，热榨黄豆饼粉20.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达180mg/L。

实施例4

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精50.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，热榨黄豆饼粉20.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达175mg/L。

实施例5

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精30.0g/L，可溶性淀粉10.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，热榨黄豆饼粉20.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达210mg/L。

实施例6

发酵培养基组成：葡萄糖5.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，热榨黄豆饼粉20.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达214mg/L。

实施例7

发酵培养基组成：葡萄糖5.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，冷榨黄豆饼粉20.0g/L，大豆胨5.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达226mg/L。

实施例8

发酵培养基组成：葡萄糖5.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，酵母浸膏10.0g/L，冷榨黄豆饼粉20.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达218mg/L。

实施例9

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，冷榨黄豆饼粉20.0g/L，大豆蛋白胨10.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达234mg/L。

实施例10

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，肉蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，冷榨黄豆饼粉20.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达256mg/L。

实施例11

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，肉蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，冷榨黄豆饼粉20.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达292mg/L。

实施例12

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，肉蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，冷榨黄豆饼粉20.0g/L，棉籽饼粉10.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达308mg/L。

实施例13

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，肉蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，冷榨黄豆饼粉10.0g/L，棉籽饼粉10.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达320mg/L。

实施例14

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，肉蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，冷榨黄豆饼粉10.0g/L，棉籽饼粉5.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达325mg/L。

实施例15

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，肉蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，冷榨黄豆饼粉10.0g/L，棉籽饼粉5.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，CuSO₄ 0.75ppm，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达334mg/L。

实施例16

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，肉蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，冷榨黄豆饼粉10.0g/L，棉籽饼粉5.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，CuSO₄ 0.75ppm，pH至7.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达304mg/L。

实施例17

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，肉蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，冷榨黄豆饼粉10.0g/L，棉籽饼粉5.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，CuSO₄ 0.75ppm，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达298mg/L。

实施例18

发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，糊精30.0g/L，玉米淀粉60.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，肉蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，冷榨黄豆饼粉10.0g/L，棉籽饼粉5.0g/L，缬氨酸1.0g/L，NaCl 2.0g/L，CuSO₄0.75ppm，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期5d，其他条件同实施例1。A40926的产量达366mg/L。

实施例19

发酵培养基组成：葡萄糖10g/L，玉米淀粉10g/L，冷榨黄豆饼粉5g/L，肉蛋白胨2g/L，缬氨酸3g/L，CuSO₄ 0.5ppm，pH至5.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度20℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达234mg/L。

实施例20

发酵培养基组成：葡萄糖10g/L，可溶性淀粉20g/L，大豆蛋白胨2g/L，缬氨酸0.5g/L，CuSO₄ 10ppm，pH至8.5。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度40℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达197mg/L。

实施例21

发酵培养基组成：糊精10g/L，可溶性淀粉5g/L，冷榨黄豆饼粉40g/L，胰蛋白胨2g/L，酵母浸粉50g/L，缬氨酸1g/L，NaCl 1g/L，pH至7.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度37℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达175mg/L。

实施例22

发酵培养基组成：葡萄糖5g/L，热榨黄豆饼粉5g/L，胰蛋白胨20g/L，缬氨酸1g/L，NaCl 5g/L，pH至7.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度37℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达190mg/L。

实施例23

发酵培养基组成：葡萄糖20g/L，糊精80g/L，玉米淀粉60g/L，热榨黄豆饼粉40g/L，棉籽饼粉30g/L，大豆蛋白胨20g/L，肉蛋白胨20g/L，酵母浸粉100g/L，缬氨酸1g/L，NaCl 2g/L，pH至8.0。

按实施例中1制得的种子以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，发酵温度30℃，发酵周期7d，其他条件同实施例1。A40926的产量达289mg/L。

对比实施例1

按文献“Zuzana TD，Fabrizio D，Salvatore M，et al.Design of mineralmedium for growth of Actinomadura sp.ATCC39727，producer of theglycopeptide A40926：effects of calcium ions and nitrogen sources[J].ApplMicrobiol Biotechnol，2004，65：671-677.”所述方法，将按实施例中1制得的种子液以接种量10％(v/v)接种于装液量为20ml的250ml发酵摇瓶中进行发酵，温度30℃，发酵周期5d。发酵结束后发酵液用NaOH调pH至12.0，50℃温育1h后离心取上清，HPLC测定，A40926的产量为92mg/L。其中发酵培养基为MM-103/Gln：L-Gln 2.0g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.2g/L，FeSO₄0.01g/L，葡萄糖10.0g/L，pH7.0-7.2。