作为CDK抑制剂的砜取代的苯胺基嘧啶衍生物、其制备以及作为药物的用途

摘要

本发明涉及式(I)的砜取代的苯胺基嘧啶衍生物、其制备方法以及其用作治疗多种疾病的药物的用途。

说明书

本发明涉及砜取代的苯胺基嘧啶衍生物、其制备方法以及其用作治疗多种疾病的药物的用途。

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是一类在调节细胞周期中起重要作用的酶，并且由此代表用于开发小的抑制分子的特别令人关注的目标。CDK的选择性抑制剂可用于治疗癌症或者由细胞增殖紊乱引起的其它疾病。

已描述了作为活性成分的嘧啶化合物及其类似物，例如2-苯胺基嘧啶化合物作为杀真菌剂(DE 4029650)或取代嘧啶衍生物用于治疗神经疾病或神经变性疾病(WO 99/19305)。已描述了作为CDK抑制剂的多种嘧啶衍生物，例如2-氨基-4-取代的嘧啶类(WO 01/14375)、嘌呤类(WO 99/02162)、5-氰基嘧啶类(WO 02/04429)、苯胺基嘧啶类(WO 00/12486)和2-羟基-3-N，N-二甲基氨基丙氧基-嘧啶类(WO 00/39101)。

具体而言，WO 02/096888和WO 03/076437中公开了对CDK具有抑制作用的嘧啶衍生物。

WO 2005/037800公开了作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的开放的亚砜亚胺取代的苯胺基嘧啶衍生物。所给出的实例是未取代的或者在嘧啶的5位被卤素，特别是被溴取代的结构。具体公开的结构均不具有5-三氟甲基取代基。

WO 2003/032997公开了砜取代的苯胺基嘧啶，然而其嘧啶的4位必须具有含氮基团。

具体公开的与本发明的结构最为接近的结构为实施例1的结构692。

从这一现有技术出发，本发明的目的在于提供比现有技术化合物更大程度地抑制细胞周期蛋白依赖性激酶活性的化合物。此外，该化合物应当对VEGF受体激酶-2(VEGF-R2)的抑制具有更高的选择性。该化合物应当在吸收方向容易渗透，且在流出方向不易渗透。具体而言，该化合物还应当在耐化学疗法的肿瘤细胞中具有强的抗增殖作用。

现已发现通式(I)的化合物及其盐、非对映体和对映体，

其中

R¹为各自任选地被羟基、-NR³R⁴、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基、-OCF₃和/或C₁-C₆烷基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或C₃-C₇环烷基或苯环，并且

R²为各自任选地被以下取代基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₁₀烷基、C₃-C₁₀烯基或C₃-C₁₀炔基或C₃-C₇环烷基环，

a)卤素、羟基、-NR³R⁴、氰基、-CF₃、-OCF₃、和/或

b)C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、或者C₃-C₈环烷基、-O-CH₂-苯基、C_n-烷氧羰基，

上述取代基自身各自任选地被卤素、羟基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、-NR³R⁴、-CF₃和/或-OCF₃相同或不同地取代一次或多次，并且

R³和R⁴相互独立地为氢和/或任选地被羟基、-NR⁵R⁶、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基和/或-OCF₃相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₃-C₈环烷基和/或苯环、具有3至8个环原子的杂环和/或单环杂芳环，

或者

R³和R⁴与氮原子共同形成5元至7元环，所述5元至7元环除了氮原子外，还任选地含有一个或两个其它杂原子，并且所述5元至7元环可以被羟基、-NR⁵R⁶、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基和/或-OCF₃相同或不同地取代一次或多次，并且

R⁵和R⁶相互独立地为氢或任选地被羟基、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基和/或-OCF₃相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₆烷基。

本发明基于以下定义：

C_n-烷基：

具有n个碳原子的单价的、直链或支链的饱和烃基团。

C₁-C₆烷基特别包括例如：

甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1，1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，1-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基。

优选甲基、乙基、丙基或异丙基。

C_n-烯基：

具有n个碳原子且至少具有一个双键的单价的、直链或支链的烃基。

C₂-C₁₀烯基特别包括例如：

乙烯基、烯丙基、(E)-2-甲基乙烯基、(Z)-2-甲基乙烯基、高烯丙基(homoallyl)、(E)-丁-2-烯基、(Z)-丁-2-烯基、(E)-丁-1-烯基、(Z)-丁-1-烯基、戊-4-烯基、(E)-戊-3-烯基、(Z)-戊-3-烯基、(E)-戊-2-烯基、(Z)-戊-2-烯基、(E)-戊-1-烯基、(Z)-戊-1-烯基、己-5-烯基、(E)-己-4-烯基、(Z)-己-4-烯基((Z)-hen-4-enyl)、(E)-己-3-烯基、(Z)-己-3-烯基、(E)-己-2-烯基、(Z)-己-2-烯基、(E)-己-1-烯基、(Z)-己-1-烯基、异丙烯基、2-甲基丙-2-烯基、1-甲基丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、(E)-1-甲基丙-1-烯基、(Z)-1-甲基丙-1-烯基、3-甲基丁-3-烯基、2-甲基丁-3-烯基、1-甲基丁-3-烯基、3-甲基丁-2-烯基、(E)-2-甲基丁-2-烯基、(Z)-2-甲基丁-2-烯基、(E)-1-甲基丁-2-烯基、(Z)-1-甲基丁-2-烯基、(E)-3-甲基丁-1-烯基、(Z)-3-甲基丁-1-烯基、(E)-2-甲基丁-1-烯基、(Z)-2-甲基丁-1-烯基、(E)-1-甲基丁-1-烯基、(Z)-1-甲基丁-1-烯基，1，1-二甲基丙-2-烯基、1-乙基丙-1-烯基、1-丙基乙烯基、1-异丙基乙烯基、4-甲基戊-4-烯基、3-甲基戊-4-烯基、2-甲基戊-4-烯基、1-甲基戊-4-烯基、4-甲基戊-3-烯基、(E)-3-甲基戊-3-烯基、(Z)-3-甲基戊-3-烯基、(E)-2-甲基戊-3-烯基、(Z)-2-甲基戊-3-烯基、(E)-1-甲基戊-3-烯基、(Z)-1-甲基戊-3-烯基、(E)-4-甲基戊-2-烯基、(Z)-4-甲基戊-2-烯基、(E)-3-甲基戊-2-烯基、(Z)-3-甲基戊-2-烯基、(E)-2-甲基戊-2-烯基、(Z)-2-甲基戊-2-烯基、(E)-1-甲基戊-2-烯基、(Z)-1-甲基戊-2-烯基、(E)-4-甲基戊-1-烯基、(Z)-4-甲基戊-1-烯基、(E)-3-甲基戊-1-烯基、(Z)-3-甲基戊-1-烯基、(E)-2-甲基戊-1-烯基、(Z)-2-甲基戊-1-烯基、(E)-1-甲基戊-1-烯基、(Z)-1-甲基戊-1-烯基、3-乙基丁-3-烯基、2-乙基丁-3-烯基、1-乙基丁-3-烯基、(E)-3-乙基丁-2-烯基、(Z)-3-乙基丁-2-烯基、(E)-2-乙基丁-2-烯基、(Z)-2-乙基丁-2-烯基、(E)-1-乙基丁-2-烯基、(Z)-1-乙基丁-2-烯基、(E)-3-乙基丁-1-烯基、(Z)-3-乙基丁-1-烯基、2-乙基丁-1-烯基、(E)-1-乙基丁-1-烯基、(Z)-1-乙基丁-1-烯基、2-丙基丙-2-烯基、1-丙基丙-2-烯基、2-异丙基丙-2-烯基、1-异丙基丙-2-烯基、(E)-2-丙基丙-1-烯基、(Z)-2-丙基丙-1-烯基、(E)-1-丙基丙-1-烯基、(Z)-1-丙基丙-1-烯基、(E)-2-异丙基丙-1-烯基、(Z)-2-异丙基丙-1-烯基、(E)-1-异丙基丙-1-烯基、(Z)-1-异丙基丙-1-烯基、(E)-3，3-二甲基丙-1-烯基、(Z)-3，3-二甲基丙-1-烯基、1-(1，1-二甲基乙基)乙烯基。

优选乙烯基或烯丙基。

C_n-炔基：

具有n个碳原子且至少具有一个三键的单价的、直链或支链的烃基。

C₂-C₁₀炔基特别包括例如：

乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊-1-炔基、戊-2-炔基、戊-3-炔基、戊-4-炔基、己-1-炔基、己-2-炔基、己-3-炔基、己-4-炔基、己-5-炔基、1-甲基丙-2-炔基、2-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、1-乙基丙-2-炔基、3-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-4-炔基、1-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-3-炔基、1-甲基戊-3-炔基、4-甲基戊-2-炔基、1-甲基戊-2-炔基、4-甲基戊-1-炔基、3-甲基戊-1-炔基、2-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-2-炔基、1-丙基丙-2-炔基、1-异丙基丙-2-炔基、2，2-二甲基丁-3-炔基、1，1-二甲基丁-3-炔基、1，1-二甲基丁-2-炔基或3，3-二甲基丁-1-炔基。

优选乙炔基、丙-1-炔基或丙-2-炔基。

C_n-环烷基：

具有n个碳原子的单价的环烃环。

C₃-C₇环烷基环包括：

环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。

优选环丙基、环戊基或环己基环。

C_n-烷氧基：

式-OR的直链或支链的C_n-烷基醚，其中R＝C_n-烷基。

C_n-烷氧羰基：

C_n-烷氧羰基为-C(O)-O-C_n-烷基。

通常，n为1至6，优选为1至4，特别优选为1至3。

例如且可以优选地提及：

甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、异丙氧羰基、叔丁氧羰基、正戊氧羰基和正己氧羰基。

卤素

术语卤素包括氟、氯、溴和碘。

优选氟。

在通式(I)中，R¹可以为：

各自任选地被羟基，-NR³R⁴、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基、-OCF₃和/或C₁-C₆烷基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或C₃-C₇环烷基或苯环。

优选地，R¹为各自任选地被羟基、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基、-OCF₃和/或C₁-C₆烷基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或C₃-C₇环烷基或苯环。

更优选地，R¹为各自任选地被羟基、氰基、卤素和/或C₁-C₆烷基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₆烷基或C₂-C₆烯基或C₃-C₇环烷基或苯环。

更优选地，R¹为各自任选地被羟基、氰基、卤素和/或C₁-C₃烷基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₄烷基或C₂-C₄烯基或C₃-C₅环烷基或苯环。

格外优选地，R¹为甲基或环丙基环。在通式(I)中，R²可以为：

各自任选地被以下取代基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₁₀烷基、C₃-C₁₀烯基或C₃-C₁₀炔基或C₃-C₇环烷基环，

a)卤素、羟基、-NR³R⁴、氰基、-CF₃、-OCF₃、和/或

b)C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、或者C₃-C₈环烷基、-O-CH₂-苯基、C_n-烷氧羰基，上述取代基自身各自任选地被卤素、羟基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、-NR³R⁴、-CF₃和/或-OCF₃相同或不同地取代一次或多次。

优选地，R²为各自任选地被卤素、羟基、氰基、-CF₃、-OCF₃和/或C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₁₀烷基、C₃-C₁₀烯基或C₃-C₁₀炔基或C₃-C₇环烷基环，上述取代基自身各自任选地被卤素或羟基相同或不同地取代一次或多次。

更优选地，R²为任选地被羟基、卤素、-CF₃和/或C₁-C₃烷氧基取代一次或多次的C₂-C₆烷基、C₃-C₆烯基或C₃-C₆炔基或C₃-C₇环烷基环。

特别优选地，R²为式(I_-R²)的基团，

其中

R^a为甲基、乙基、丙基或异丙基，并且

R^b和R^c相互独立地为氢、甲基或乙基。

式(Ia)概括了这类化合物。

优选地，R^a和R^b为甲基，并且R^c为氢或甲基。

在通式(I)中，R³和R⁴可以相互独立地为：

氢和/或任选地被羟基、-NR⁵R⁶、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基和/或-OCF₃相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₃-C₈环烷基和/或苯环、具有3至8个环原子的杂环和/或单环杂芳环，

或者

R³和R⁴与氮原子共同形成5元至7元环，所述5元至7元环除了氮原子外，还任选地含有一个或两个其它杂原子，并且所述5元至7元环可以被羟基、-NR⁵R⁶、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基和/或-OCF₃相同或不同地取代一次或多次。

优选地，R³和R⁴相互独立地为：

氢和/或任选地被羟基、-NR⁵R⁶、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基和/或-OCF₃相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₄烷基、C₃-C₆烯基、C₃-C₆环烷基和/或苯基、具有5个或6个环原子的杂环基和/或单环杂芳环基，

或者

R³和R⁴与氮原子共同形成5元至7元环，所述5元至7元环除了氮原子外，还任选地含有一种其它杂原子，并且所述5元至7元环可以被羟基、-NR⁵R⁶、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基和/或-OCF₃相同或不同地取代一次或多次。

更优选地，R³和R⁴相互独立地为氢和/或任选地被羟基、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆-烷氧基和/或-OCF₃相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₆烷基、C₃-C₈环烷基和/或苯环。

在通式(I)中，R⁵和R⁶可以相互独立地为：

氢或任选地被羟基、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基和/或-OCF₃相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₆烷基。

优选地，R⁵和R⁶相互独立地为氢和/或C₁-C₃烷基。

如下通式(I)的化合物及其盐、非对映体和对映体形成优选的亚组，其由

R¹为各自任选地被羟基、氰基、卤素、-CF₃、C₁-C₆烷氧基、-OCF₃和/或C₁-C₆烷基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基或C₃-C₇环烷基或苯基，并且

R²为各自任选地被卤素、羟基、氰基、-CF₃、-OCF₃和/或C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₁₀烷基、C₃-C₁₀烯基或C₃-C₁₀炔基或C₃-C₇环烷基环，

上述取代基自身各自任选地被卤素或羟基相同或不同地取代一次或多次。

如下通式(I)的化合物及其盐、非对映体和对映体形成更优选的亚组，其中

R¹为各自任选地被羟基、氰基、卤素和/或C₁-C₆烷基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₆烷基或C₂-C₆烯基或C₃-C₇环烷基或苯环，并且

R²为任选地被羟基、卤素、-CF₃和/或C₁-C₃烷氧基取代一次或多次的C₂-C₆烷基、C₃-C₆烯基或C₃-C₆炔基或C₃-C₇环烷基环。

通式(Ia)的化合物及其盐、非对映体和对映体形成特别优选的亚组

其中

R¹为各自任选地被羟基、氰基、卤素和/或C₁-C₃烷基相同或不同地取代一次或多次的C₁-C₄烷基或C₂-C₄烯基或C₃-C₅环烷基或苯环，并且

R^a为甲基、乙基、丙基或异丙基，并且

R^b和R^c相互独立地为氢、甲基或乙基。

下组化合物及其盐、非对映体和对映体形成通式(Ia)的化合物的优选的亚组

其中

R¹为甲基或环丙基，并且

R^a和R^b为甲基，并且

R^c为氢或甲基。

本发明的化合物适于治疗以下疾病：

●癌症，例如实体瘤、瘤转移以及血液肿瘤，特别是：

头颈部肿瘤；肺部和支气管肿瘤；胃肠肿瘤，例如胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝细胞癌；内分泌活性肿瘤(endocrine active tumor)；乳腺癌和妇科肿瘤；泌尿生殖系统肿瘤，例如肾癌、膀胱癌、前列腺癌；皮肤肿瘤；肉瘤；白血病和淋巴瘤；

●病毒病，以及

●心血管疾病，例如狭窄、动脉硬化和再狭窄、支架诱导的再狭窄(stent-induced restenoses)。

使用制药技术中常用的赋形剂将一种或多种活性成分转化为期望的剂型，通过本身已知的方法将本发明的化合物配制为药物制剂。

本文中可以使用的赋形剂为例如载体物质、填充剂、崩解剂、粘合剂、保湿剂、助流剂、吸附剂和吸收剂、稀释剂、溶剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、矫味剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、用于改变渗透压的盐或缓冲剂。

关于这一点，可以参考Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，East Pennsylvania(1980)。

所述药物制剂可以是：

固体形式的，例如片剂、糖衣片剂、丸剂、栓剂、胶囊剂、经皮系统，或

半固体形式的，例如软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、栓剂、乳剂，或

液体形式的，例如溶液剂、酊剂、混悬剂或乳剂。

用于本发明目的的赋形剂可以是例如盐、糖类(单糖、二糖、三糖、寡糖和/或多糖)、蛋白质、氨基酸、肽、脂肪、蜡、油、碳氢化合物及其衍生物，其中所述赋形剂可以是天然来源的或者是可通过合成或部分合成得到的。

对于口服或经口施用，片剂、糖衣片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、锭剂、混悬剂、乳剂或溶液剂是特别适合的。

对于肠胃外施用，混悬剂、乳剂以及首选是溶液剂是特别适合的。

本发明化合物的制备

以下实施例阐释了本发明化合物的制备，而并未将所要求保护的化合物的范围限制于这些实施例中。

可以通过这样的方法制备本发明的化合物，所述方法的特征在于以下步骤：

a₁)通过与式(2)的醇反应将2，4-二氯-5-碘嘧啶(1)的4位官能化以形成式(3)的中间体，

随后使中间体(3)反应以形成5-CF₃中间体(4)

或者

a₂)使2，4-二氯-5-三甲基嘧啶(5)与式(2)的醇直接反应以形成5-CF₃中间体(4)，

b)将式(7)的硫醚氧化以得到式(8)的砜，

c)将式(8)的化合物还原为式(9)的化合物，

d)将式(4)和式(9)的化合物偶联

制备本发明化合物任选地需要(例如在4-位的侧链)引入保护基和随后将其脱除(参见例如：P.J.Kocienski，Protecting Groups，Georg Thieme Verlag Stuttgart，New York，1994)。

方法步骤a₁)

在碱性条件下使2，4-二氯-5-碘嘧啶(1)与式(2)的醇反应以合成式(3)的产物(参见例如：(a)U.Lücking等人，WO 2007/071455)。所述氢化钠的使用特别适合于本合成。

原则上有多种方法可用于在含氮的杂芳族化合物中用三氟甲基置换卤素(参见例如：a)G.E.Carr，R.D.Chambers，T.F.Holmes，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，1988，921；b)F.Cottet，M.Schlosser，Eur.J.Org.Chem.2002，327；c)F.G.Njoroge等人，J.Med.Chem 1997，40，4290)。

所述的在N-甲基-2-吡咯烷酮和THF中使用碘化亚铜、氟化钾和(三氟甲基)-三甲基甲硅烷特别适合于用CF₃基团置换嘧啶(3)的5位的碘以形成式(4)的化合物。

方法步骤a₂)

在碱性条件下使2，4-二氯-5-三氟甲基嘧啶(5)与式(2)的醇反应以合成产物(4)和(6)。通常可通过色谱法来分离区域异构体(regioisomer)(参见例如：(a)T.M.Caldwell等人，WO 2006/081388，第50页，实施例1，D)。所述氢化钠的使用特别适合于本合成。

方法步骤b)

将式(7)的化合物氧化为式(8)的砜。有多种方法可以将硫醚转化为砜，例如使用氧化剂过氧化氢或高锰酸钾。所述间氯过氧苯甲酸(MCPBA)的使用特别适合于合成式(8)的化合物。

方法步骤c)

原则上有一系列反应条件可用于随后将芳族硝基还原得到式(9)的化合物(参见例如：R.C.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH，New York，1989，411)。例如所述使用THF中的拉尼镍的氢化反应特别适合。

方法步骤d)

可以使式(4)的化合物与式(9)的苯胺反应以得到式(I)的化合物(参见例如：(a)J.Bryant等人，WO 2004/048343)。

一般信息

所有氧化敏感性或水解敏感性化合物的反应均是在氩气下使用干燥溶剂进行的。

利用在MDL ISIS Draw中实行的Autonom 2000 Name来命名物质。

缩写

实施例1

(2R，3R)-3-[2-(4-环丙烷磺酰基苯基氨基)-5-三氟甲基嘧啶-4-基氧基]丁-2-醇

1a)中间体的制备

化合物1.1

1-环丙基硫烷基-4-硝基苯

将浓度为4％的3.00g(40.5mmol)的环丙烷硫醇(根据E.Block等人，J.Am.Chem.Soc.1992，114，3492制备)的THF/乙醚(1∶1)溶液分批与1.78g(44.6mmol)氢化钠(60％)混合，并在室温下搅拌30分钟。然后分批加入6.00g(38.7mmol)的1-氟-4-硝基苯。将该混合物在40℃下搅拌2小时。将其冷却，然后将混合物放入水中，并用苯萃取(3次)。通过蒸发浓缩合并的有机相，并将残余物色谱纯化(己烷/乙酸乙酯95∶5)。得到4.6g(23.6mmol；收率：61％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.12(m，2H)，7.54(m，2H)，2.35(m，1H)，1.16(m，2H)，0.61(m，2H)。

化合物1.2

1-环丙烷磺酰基-4-硝基苯

在0℃下将1.00g(5.12mmol)的1-环丙基硫烷基-4-硝基苯的120mlDCM溶液与2.3g的间氯过氧苯甲酸(最大值77％)混合，然后在室温下搅拌4.5小时。在搅拌下将混合物加入到饱和碳酸氢钠溶液中。通过Whatman过滤器过滤有机相，并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(DCM/MeOH 95∶5)。得到1.07g(4.70mmol；收率：92％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.41(m，2H)，8.15(m，2H)，2.98(m，1H)，1.11(m，4h)。

化合物1.3

4-环丙烷磺酰基苯胺

将1.60g(7.0mmol)的1-环丙烷磺酰基-4-硝基苯在50ml乙醇和50mlTHF中的溶液与3.2g拉尼镍(湿度50％)混合，并在0℃及大气压下氢化1.5小时。将混合物过滤，并通过蒸发浓缩。得到1.28g(6.5mmol；收率：92％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝7.41(m，2H)，6.60(m，2H)，6.05(br，2H)，2.58(m，1H)，0.92(m，4H)

MS：198(ESI+)。

化合物1.4

(2R，3R)-3-苄氧基丁-2-醇

在室温下将4.0g(44.4mmol)的(2R，3R)-丁烷-2，3-二醇的300ml THF溶液与5.0g(44.6mmol)的叔丁醇钾(potassium tert-butylate)混合，并将混合物回流15分钟。将混合物冷却至约50℃，并与5.3ml(44.6mmol)的溴化苄混合。将混合物回流3小时，然后在室温下搅拌过夜。将混合物用乙酸乙酯和氯化钠溶液稀释，然后用1N的氯化氢溶液(1次)和氯化钠溶液(2次)洗涤。将有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(己烷/乙酸乙酯1∶1)。得到3.4g(18.9mmol；收率：43％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝7.35(m，4H)，7.28(m，1H)，4.52(m，3H)，3.67(m，1H)，3.37(m，1H)，1.05(d，3H)，1.01(d，3H)。

化合物1.5

4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-2-氯-5-碘嘧啶

在0℃下将56ml乙醚中的8.55g(47.4mmol)的(2R，3R)-3-苄氧基丁-2-醇在搅拌下分批与2.07g氢化钠(55％)混合。10分钟后，移除冰浴，并将混合物在室温下再搅拌3分钟。在0℃下将形成的悬浮液加入到6.52g(23.7mmol)2，4-二氯-5-碘嘧啶的65ml乙腈溶液中。在40℃下将混合物搅拌4小时，然后与稀氯化钠溶液混合。用乙酸乙酯萃取(2次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(己烷/乙酸乙酯4∶1)。得到4.12g(9.8mmol；收率：41％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.78(s，1H)，7.29(m，5H)，5.27(m，1H)，4.64(d，1H)，4.53(d，1H)，3.73(m，1H)，1.30(d，3H)，1.19(d，3H)。

化合物1.6

4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-2-氯-5-三氟甲基嘧啶

在室温下将4.66g(11.1mmol)4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-2-氯-5-碘嘧啶在15.8ml NMP和15.8ml THF中的溶液在搅拌下与3.82g(20.0mmol)碘化亚铜、0.97g(16.7mmol)氟化钾和2.47ml(16.7mmol)(三氟甲基)三甲基甲硅烷混合。将混合物在80℃下搅拌5.5小时。将混合物冷却，然后将其加入到稀氯化钠溶液中，并用乙酸乙酯萃取(2次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(己烷/乙酸乙酯4∶1)。得到2.17g(6.0mmol；收率：54％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.81(s，1H)，7.21(m，5H)，5.40(m，1H)，4.57(d，1H)，4.42(d，1H)，3.70(m，1H)，1.28(d，3H)，1.13(d，3H)。

或者，还可以通过以下操作来制备化合物1.6：

在0℃下将5.00g(23.0mmol)2，4-二氯-5-三氟甲基嘧啶和5.40g(30.0mmol)(2R，3R)-3-苄氧基丁-2-醇在60ml乙醚和65ml乙腈中的溶液与分为3份的1.21g(27.7mmol)氢化钠(浓度55％)混合，然后在15℃下搅拌90分钟。将混合物与稀氯化钠溶液混合，并用乙酸乙酯萃取(3次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(己烷/乙酸乙酯95∶5)。得到1.60g(4.4mmol；收率：19％)的产物。

化合物1.7

[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基](4-环丙烷磺酰基苯基)胺

将9.5ml乙腈中的700mg(1.94mmol)4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-2-氯-5-三氟甲基嘧啶和460mg(2.33mmol)4-环丙烷磺酰基苯胺与0.49ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在80℃下搅拌5.5小时。将混合物冷却，然后将其用乙酸乙酯稀释，并用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(DCM/乙醇95∶5)。得到649mg(1.24mmol，收率：64％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.55(s，1H)，8.58(s，1H)，7.96(m，2H)，7.79(m，2H)，7.22(m，5H)，5.48(m，1H)，4.57(d，1H)，4.46(d，1H)，3.73(m，1H)，2.71(m，1H)，1.31(d，3H)，1.15(d，3H)，1.05(m，2H)，0.96(m，2H)。

MS：522(ESI+)

b)终产物的制备

将541mg(1.04mmol)的[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基](4-环丙烷磺酰基苯基)胺的110ml乙醇溶液与541mg的钯碳(10％)混合，并在室温及大气压下氢化1小时。将混合物过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(DCM/EtOH 98∶2)。得到175mg(0.41mmol；收率：39％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.54(s，1H)，8.56(s，1H)，7.95(m，2H)，7.79(m，2H)，5.28(m，1H)，4.86(d，1H)，3.83(m，1H)，2.76(m，1H)，1.26(d，3H)，1.01(m，7H)。

MS：432(ESI+)。

实施例2

(2R，3R)-3-[2-(4-甲磺酰基苯基氨基)-5-三氟甲基嘧啶-4-基氧基]丁-2-醇

2a)中间体的制备

化合物2.1

[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基]-(4-甲磺酰基苯基)胺

在80℃下将11ml乙腈中的810mg(2.25mmol)4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-2-氯-5-三氟甲基嘧啶和559mg(2.69mmol)4-甲磺酰基苯胺盐酸盐(Acros)搅拌16小时。将混合物冷却，然后用乙酸乙酯稀释，并用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(己烷/乙酸乙酯1∶1)。得到770mg(1.55mmol；收率：69％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.55(s，1H)，8.58(s，1H)，7.95(m，2H)，7.83(m，2H)，7.22(m，5H)，5.48(m，1H)，4.57(d，1H)，4.46(d，1H)，3.72(m，1H)，3.12(s，3H)，1.31(d，3H)，1.15(d，3H)。

MS：496(ESI+)

b)终产物的制备

将750mg(1.51mmol)[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基]-(4-甲磺酰基苯基)胺的20ml乙醇溶液与152mg钯碳(10％)混合，并在室温及大气压下氢化30分钟。再次将混合物与152mg钯碳(10％)混合，并氢化1.5小时。再加入152mg钯碳(10％)，并将混合物氢化1小时。最后，再加入152mg钯碳(10％)，并将混合物氢化15分钟。将混合物过滤，并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(DCM/EtOH 95∶5)。得到512mg(1.26mmol；收率：83％)产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.55(s，1H)，8.57(s，1H)，7.96(m，2H)，7.83(m，2H)，5.27(m，1H)，4.86(d，1H)，3.82(m，1H)，3.14(s，3H)，1.25(d，3H)，1.07(d，3H)。

MS：405(EI+)。

实施例3

(R)-3-[2-(4-甲磺酰基苯基氨基)-5-三氟甲基嘧啶-4-基氧基]-2-甲基丁-2-醇

3a)中间体的制备

化合物3.1

(R)-2-甲基丁烷-2，3-二醇

将10.0g(96.1mmol)(R)-(+)-乳酸甲酯的20ml THF溶液缓慢滴加到160ml(480.0mmol)用冰冷却的3N的甲基氯化镁的THF溶液中。首先将混合物缓慢加热至室温，然后回流30分钟。将混合物冷却，然后加入到饱和氯化铵溶液中，并用乙酸乙酯萃取(3次)。将合并的有机相通过Whatman过滤器过滤，并通过蒸发浓缩。得到4.5g(43.1mmol)的粗产物，并无需进一步纯化而使用。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝4.21(d，1H)，3.93(s，1H)，3.29(m，1H)，0.97(m，9H)。

化合物3.2

(R)-3-(2-氯-5-碘嘧啶-4-基氧基)-2-甲基丁-2-醇

在0℃下将4.40g(42.3mmol)(R)-2-甲基丁烷-2，3-二醇的83ml乙醚溶液在搅拌下分批与1.84g(42.3mmol)氢化钠(55％)混合，并搅拌10分钟。在室温下将混合物再搅拌3分钟，然后加入到用冰冷却的9.68g(35.2mmol)2，4-二氯-5-碘嘧啶的97ml乙腈溶液中。在40℃下将混合物搅拌4小时，将其冷却，然后与冰和饱和NaCl溶液混合。将混合物用乙酸乙酯萃取(3次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(己烷/乙酸乙酯4∶1)。得到4.96g(14.5mmol；收率：41％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.73(s，1H)，4.96(q，1H)，4.62(s，1H)，1.21(d，3H)，1.13(s，6H)。

ES：343(CI+)。

化合物3.3

2-氯-4-[(R)-1，2-二甲基-2-(四氢吡喃-2-基氧基)丙氧基]-5-碘嘧啶

将4.96g(14.5mmol)(R)-3-(2-氯-5-碘嘧啶-4-基氧基)-2-甲基丁-2-醇的30ml DCM溶液与2.64ml(29.0mmol)二氢吡喃和0.36g(1.5mmol)吡啶对甲苯磺酸盐混合，并在室温下搅拌22小时。将混合物用DCM稀释，并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。将有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(己烷/乙酸乙酯4∶1)。得到5.50g(12.9mmol；收率：89％)的非对映体混合物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.75(s，1H)，8.74(s，1H)，5.15(m，2H)，4.91(m，2H)，3.70(m，2H)，3.30(m，2H)，1.31(m，30H)。

化合物3.4

2-氯-4-[(R)-1，2-二甲基-2-(四氢吡喃-2-基氧基)丙氧基]-5-三氟甲基嘧啶

在室温下将1.00g(2.34mmol)2-氯-4-[(R)-1，2-二甲基-2-(四氢吡喃-2-基氧基)丙氧基]-5-碘嘧啶在3.3ml NMP和3.3ml THF中的溶液与1.61g(8.44mmol)碘化亚铜、0.41g(7.03mmol)氟化钾和1.04ml(7.03mmol)(三氟甲基)三甲基甲硅烷混合。将混合物在90℃下搅拌2小时。将混合物冷却，然后加入到稀氯化钠溶液中，并用乙酸乙酯萃取(3次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(己烷/乙酸乙酯4∶1)。得到0.53g(1.43mmol；收率：61％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.84(s，1H)，5.32(m，1H)，4.85(m，1H)，3.68(m，1H)，3.30(m，1H)，1.31(m，15H)。

b)终产物的制备

在70℃下将2.5ml乙醇中的100mg(0.27mmol)2-氯-4-[(R)-1，2-二甲基-2-(四氢吡喃-2-基氧基)丙氧基]-5-三氟甲基嘧啶和37mg(0.22mmol)4-甲磺酰基苯胺搅拌150分钟。将混合物蒸发至干燥，溶于3.1ml乙醇中，并与12mg(0.05mmol)吡啶甲苯磺酸盐混合。将混合物在45℃下搅拌4小时。将混合物冷却，然后与稀碳酸氢钠溶液混合，并用乙酸乙酯萃取(3次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(DCM/乙醇95∶5)。得到42mg(0.10mmol；收率：45％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.55(s，1H)，8.57(s，1H)，7.96(m，2H)，7.84(m，2H)，5.14(q，1H)，4.66(s，1H)，3.14(s，3H)，1.28(d，3H)，1.12(s，6H)。

MS：419(EI+)

实施例4

(R)-3-[2-(4-环丙烷磺酰基苯基氨基)-5-三氟甲基嘧啶-4-基氧基]-2-甲基丁-2-醇

终产物的制备

在70℃下将5.0ml乙醇中的200mg(0.54mmol)2-氯-4-[(R)-1，2-二甲基-2-(四氢吡喃-2-基氧基)丙氧基]-5-三氟甲基嘧啶和64mg(0.33mmol)4-环丙烷磺酰基苯胺搅拌210分钟。再次将混合物与100mg(0.27mmol)2-氯-4-[(R)-1，2-二甲基-2-(四氢吡喃-2-基氧基)丙氧基]-5-三氟甲基嘧啶混合，并在70℃下再搅拌210分钟。将混合物蒸发至于燥，并将生成的残余物通过HPLC纯化。得到91mg(0.20mmol；收率：61％)的产物。

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.2％NH₃

洗脱剂B：乙腈

梯度：

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

保留时间：4.6-5.5min

¹H NMR(400MHz，DMSO)：10.56(br，1H)，8.57(s，1H)，7.96(m，2H)，7.80(m，2H)，5.14(q，1H)，4.66(s，1H)，2.77(m，1H)，1.28(d，3H)，1.12(m，6H)，1.07(m，2H)，0.97(m，2H)。

MS：445(EI+)

实施例5

(2R，3R)-3-[2-(4-苯磺酰基苯基氨基)-5-三氟甲基嘧啶-4-基氧基]丁-2-醇

5a)中间体的制备

化合物5.1

(4-苯磺酰基苯基)[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基]胺

将1.5ml乙腈中的110mg(0.30mmol)4-((1R，2R)-苄氧基-1-甲基丙氧基)-2-氯-5-三氟甲基嘧啶和85mg(0.37mmol)4-苯磺酰基苯胺与0.08ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在80℃下搅拌5小时。将混合物在旋转蒸发仪中浓缩，并将生成的残余物通过HPLC纯化。得到121mg(0.22mmol，收率：71％)的产物。

系统：Waters Autopurification

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.1％HCOOH

洗脱剂B：乙腈

梯度：0min        99％A    1％B

1.00min     99％A    1％B

7.50min     1％A     99％B

10.00min    1％A     99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.56(s，1H)，8.56(s，1H)，7.89(m，6H)，7.58(m，3H)，7.22(m，5H)，5.44(m，1H)，4.55(d，1H)，4.44(d，1H)，3.71(m，1H)，1.29(d，3H)，1.14(d，3H)。

b)终产物的制备

在室温下将116mg(0.21mmol)(4-苯磺酰基苯基)[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基]胺的5ml乙醇溶液在氢气气氛中氢化2.5小时。此时，将混合物与钯碳(10％)分6批混合，每批50mg钯碳。将混合物过滤并通过蒸发浓缩。得到63mg(0.13mmol；收率：65％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.55(s，1H)，8.55(s，1H)，7.89(m，6H)，7.59(m，3H)，5.25(m，1H)，4.86(d，1H)，3.80(m，1H)，1.24(d，3H)，1.06(d，3H)。

MS：468(ESI+)

实施例6

(2R，3R)-3-{2-[4-(二氟甲磺酰基)苯基氨基]-5-三氟甲基嘧啶-4-基氧基}丁-2-醇

6a)中间体的制备

化合物6.1

[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基][4-(二氟甲磺酰基)苯基]胺

将1.4ml乙腈中的100mg(0.28mmol)4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-2-氯-5-三氟甲基嘧啶和69mg(0.33mmol)4-(二氟甲磺酰基)苯胺与0.07ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在80℃下搅拌3小时。将混合物在旋转蒸发仪中浓缩，并将生成的残余物通过HPLC纯化。得到104mg(0.20mmol；收率：71％)的产物。

系统：Waters Autopurification

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.1％HCOOH

洗脱剂B：乙腈

梯度：0min        99％A    1％B

1.00min     99％A    1％B

7.50min     1％A     99％B

10.00min    1％A     99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.77(s，1H)，8.62(s，1H)，8.07(m，2H)，7.88(m，2H)，7.22(m，6H)，5.47(m，1H)，4.57(d，1H)，4.45(d，1H)，3.72(m，1H)，1.31(d，3H)，1.15(d，3H)。

b)终产物的制备

在室温下将100mg(0.19mmol)[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基][4-(二氟甲磺酰基)苯基]胺的5ml乙醇溶液在氢气气氛中氢化1.5小时。此时，将混合物与钯碳(10％)分3批混合，每批100mg钯碳。将混合物过滤并通过蒸发浓缩。得到45mg(0.10mmol；收率：54％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.77(s，1H)，8.61(s，1H)，8.08(m，2H)，7.88(m，2H)，7.20(tr，1H)，5.29(m，1H)，4.88(d，1H)，3.84(m，1H)，1.26(d，3H)，1.07(d，3H)。

MS：442(ESI+)

实施例7

(2R，3R)-3-[2-(4-环戊磺酰基苯基氨基)-5-三氟甲基嘧啶-4-基氧基]丁-2-醇

7a)中间体的制备

化合物7.1

[4]-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基]-(4-环戊磺酰基苯基)胺

将1.4ml乙腈中的100mg(0.28mmol)4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-2-氯-5-三氟甲基嘧啶和75mg(0.33mmol)4-环戊磺酰基苯胺与0.07ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在80℃下搅拌5小时。将混合物在旋转蒸发仪中浓缩，并将生成的残余物通过HPLC纯化。得到118mg(0.21mmol，收率：77％)的产物。

系统：Waters Autopurification

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.1％HCOOH

洗脱剂B：乙腈

梯度：0min        99％A    1％B

1.00min     99％A    1％B

7.50min     1％A     99％B

10.00min    1％A     99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.57(s，1H)，8.58(s，1H)，7.96(m，2H)，7.77(m，2H)，7.22(m，5H)，5.48(m，1H)，4.56(d，1H)，4.46(d，1H)，3.72(m，1H)，3.63(m，1H)，1.76(m，4H)，1.51(m，4H)，1.30(d，3H)，1.14(d，3H)。

b)终产物的制备

在室温下将112mg(0.20mmol)[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基](4-环戊磺酰基苯基)胺的5ml乙醇溶液在氢气气氛中氢化2.5小时。此时，将混合物与钯碳(10％)分5批混合，每批100mg钯碳。将混合物过滤并通过蒸发浓缩。得到75mg(0.16mmol；收率：80％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.58(s，1H)，8.57(s，1H)，7.97(m，2H)，7.78(m，2H)，5.28(m，1H)，4.88(d，1H)，3.83(m，1H)，3.68(m，1H)，1.76(m，4H)，1.55(m，4H)，1.25(d，3H)，1.07(d，3H)。

MS：460(ESI+)

实施例8

(R)-2-甲基-3-{2-[4-(丙-2-烯-1-磺酰基)苯基氨基]-5-三氟甲基嘧啶-4-基氧基}丁-2-醇

终产物的制备

在70℃下将2.6ml乙醇中的104mg(0.28mmol)2-氯-4-[(R)-1，2-二甲基-2-(四氢吡喃-2-基氧基)丙氧基]-5-三氟甲基嘧啶和33mg(0.17mmol)4-(丙-2-烯-1-磺酰基)苯胺搅拌10小时。将混合物蒸发至于燥，并将残余物通过HPLC纯化。得到12mg(0.03mmol；收率：10％)的产物。

系统：Waters Autopurification

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.1％HCOOH

洗脱剂B：乙腈

梯度：0min        99％A    1％B

1.00min     99％A    1％B

7.50min     1％A     99％B

10.00min    1％A     99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.57(s，1H)，8.58(s，1H)，7.95(m，2H)，7.76(m，2H)，5.64(m，1H)，5.25(m，1H)，5.17(m，2H)，4.67(s，1H)，4.04(d，2H)，1.28(d，3H)，1.12(s，6H)。

实施例9

(2R，3R)-3-{2-[4-(丙烷-2-磺酰基)苯基氨基]-5-三氟甲基嘧啶-4-基氧基}丁-2-醇

9a)中间体的制备

化合物9.1

[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基][4-(丙烷-2-磺酰基)苯基]胺

将1.4ml乙腈中的103mg(0.29mmol)4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-2-氯-5-三氟甲基嘧啶和68mg(0.34mmol)4-(丙烷-2-磺酰基)苯胺与0.07ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在80℃下搅拌5小时。将混合物在旋转蒸发仪中浓缩，并将生成的残余物通过HPLC纯化。得到123mg(0.22mmol，收率：82％)的产物。

系统：Waters Autopurification

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.1％HCOOH

洗脱剂B：乙腈

梯度：0min        99％A    1％B

1.00min     99％A    1％B

7.50min     1％A     99％B

10.00min    1％A     99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.59(S，1H)，8.58(s，1H)，7.96(m，2H)，7.75(m，2H)，7.22(m，5H)，5.48(m，1H)，4.55(d，1H)，4.45(d，1H)，3.72(m，1H)，3.27(m，1H)，1.30(d，3H)，1.14(d，3H)，1.09(d，6H)。

b)终产物的制备

在室温下将118mg(0.23mmol)[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基][4-(丙烷-2-磺酰基)苯基]胺的5ml乙醇溶液在氢气气氛中氢化1.5小时。此时，将混合物与钯碳(10％)分4批混合，每批50mg钯碳。将混合物过滤并通过蒸发浓缩。得到43mg(0.10mmol；收率：44％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.58(s，1H)，8.57(s，1H)，7.98(m，2H)，7.76(m，2H)，5.27(m，1H)，4.87(d，1H)，3.81(m，1H)，3.31(m，1H)，1.25(d，3H)，1.11(d，6H)，1.06(d，3H)。

MS：434(ESI+)

实施例10

(R)-2-甲基-3-{2-[4-(丙-2-炔-1-磺酰基)苯基氨基]-5-三氟甲基嘧啶-4-基氧基}丁-2-醇

终产物的制备

在70℃下将3.6ml乙醇中的150mg(0.41mmol)2-氯-4-[(R)-1，2-二甲基-2-(四氢吡喃-2-基氧基)丙氧基]-5-三氟甲基嘧啶和47mg(0.24mmol)4-(丙-2-炔-1-磺酰基)苯胺搅拌200分钟。将混合物蒸发至干燥。得到约147mg的粗产物，将其中60mg通过HPLC纯化。得到31mg(0.07mmol)的产物。

系统：Waters Autopurification

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.1％HCOOH

洗脱剂B：乙腈

梯度：0min        99％A    1％B

1.00min     99％A    1％B

7.50min     1％A     99％B

10.00min    1％A     99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.60(s，1H)，8.58(s，1H)，7.98(m，2H)，7.83(m，2H)，5.14(q，1H)，4.67(s，1H)，4.45(d，2H)，3.38(tr，1H)，1.28(d，3H)，1.10(m，6H)。

MS：444(ESI+)

实施例11

(2R，3R)-3-{2-[4-(2-羟基乙磺酰基)苯基氨基]-5-三氟甲基嘧啶-4-基氧基}丁-2-醇

11a)中间体的制备

化合物11.1

2-{4-[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基氨基]苯磺酰基}乙醇

将1.4ml乙腈中的102mg(0.28mmol)4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-2-氯-5-三氟甲基嘧啶和68mg(0.34mmol)2-(4-氨基苯磺酰基)乙醇与0.07ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在80℃下搅拌4小时。将混合物在旋转蒸发仪中浓缩，并将生成的残余物通过HPLC纯化。得到72mg(0.14mmol，收率：48％)的产物。

系统：Waters Autopurification

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.1％HCOOH

洗脱剂B：乙腈

梯度：0min        99％A    1％B

1.00min     99％A    1％B

7.50min     1％A     99％B

10.00min    1％A     99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.56(s，1H)，8.58(s，1H)，7.94(m，2H)，7.79(m，2H)，7.22(m，5H)，5.46(m，1H)，4.83(tr，1H)，4.56(d，1H)，4.46(d，1H)，3.72(m，1H)，3.62(m，2H)，3.35(m，2H)，1.30(d，3H)，1.15(d，3H)。

b)终产物的制备

在室温下将68mg(0.13mmol)(2-{4-[4-((1R，2R)-2-苄氧基-1-甲基丙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基氨基]苯磺酰基}乙醇的5ml乙醇溶液在氢气气氛中氢化1小时。此时，将混合物与钯碳(10％)(在每种情况中68mg)混合。将混合物过滤并通过蒸发浓缩。得到28mg(0.06mmol；收率：50％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.55(s，1H)，8.57(s，1H)，7.95(m，2H)，7.79(m，2H)，5.27(m，1H)，4.87(d，1H)，4.84(tr，1H)，3.82(m，1H)，3.63(m，2H)，3.36(m，2H)，1.25(d，3H)，1.07(d，3H)。

MS：436(ESI+)

实施例12

(4-甲磺酰基苯基)[4-((R)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基)-5-三氟甲基嘧啶-2-基]胺

a)中间体的制备

化合物12.1

2-氯-4-((R)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基)-5-三氟甲基嘧啶

在0℃下将2.00g(9.2mmol)2，4-二氯-5-三氟甲基嘧啶和1.08g(12.0mmol)(R)-1-甲氧基丙-2-醇在24.4ml乙醚和24.4ml乙腈中的溶液在搅拌下分批与0.48g氢化钠(55％)混合。在冰浴中将混合物缓慢升温至室温。3.5小时后将混合物与冰和稀氯化钠溶液混合。用乙酸乙酯萃取(2次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物色谱纯化(己烷/乙酸乙酯7∶3)。得到0.59g(2.2mmol；收率：24％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.83(s，1H)，5.50(m，1H)，3.50(d，2H)，3.24(s，3H)，1.26(d，3H)。

b)终产物的制备

将2.6ml乙腈中的100mg(0.37mmol)2-氯-4-((R)-2-甲氧基-1-甲基乙氧基)-5-三氟甲基嘧啶和63mg(0.37mmol)4-甲磺酰基苯胺与0.13ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在60℃下搅拌18小时。将混合物冷却，然后与几滴碳酸氢钠溶液混合，并在旋转蒸发仪中浓缩。将生成的残余物通过HPLC纯化。得到65mg(0.16mmol；收率：43％)的产物。

系统：Waters Autopurification

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.1％HCOOH

洗脱剂B：乙腈

梯度：0min        99％A    1％B

1.00min     99％A    1％B

7.50min     1％A     99％B

10.00min    1％A     99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.57(s，1H)，8.58(s，1H)，7.93(m，2H)，7.82(m，2H)，5.51(m，1H)，3.52(m，2H)，3.26(s，3H)，3.14(s，3H)，1.30(d，3H)。

实施例13

(4-甲磺酰基苯基)(4-丙-2-炔基氧基-5-三氟甲基嘧啶-2-基)胺

a)中间体的制备

化合物13.1

2-氯-4-丙-2-炔基氧基-5-三氟甲基嘧啶

在0℃下将2.00g(9.2mmol)2，4-二氯-5-三氟甲基嘧啶和0.71ml(12.0mmol)丙-2-炔-1-醇在24.4ml乙醚和24.4ml乙腈中的溶液在搅拌下分批与0.48g氢化钠(55％)混合。在冰浴中将混合物缓慢升温至室温。3.5小时后，将混合物与冰和稀氯化钠溶液混合。用乙酸乙酯萃取(2次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物通过HPLC纯化。得到0.29g(1.2mmol；收率：13％)的产物。

柱：Chiralpak IA 5μ250×30mm

洗脱剂：己烷/乙醇95∶5

流速：40.0ml/min

检测器：DAD 210nm

温度：室温

保留时间：4.8-5.3min

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.91(s，1H)，5.18(d，2H)，3.71(tr，1H)。

b)终产物的制备

将1.8ml乙腈中的60mg(0.25mmol)2-氯-4-丙-2-炔基氧基-5-三氟甲基嘧啶和43mg(0.25mmol)4-甲磺酰基苯胺与0.06ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在60℃下搅拌18小时。将混合物在旋转蒸发仪中浓缩，并将生成的残余物通过HPLC纯化。得到29mg(0.08mmol，收率：31％)的产物。

系统：Waters Autopurification

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.1％HCOOH

洗脱剂B：乙腈

梯度：0min        99％A    1％B

1.00min     99％A    1％B

7.50min     1％A     99％B

10.00min    1％A     99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.71(s，1H)，8.64(s，1H)，7.98(m，2H)，7.82(m，2H)，5.16(d，2H)，3.68(tr，1H)，3.14(s，3H)。

实施例14

(4-甲磺酰基苯基)[5-三氟甲基-4-(3，3，3-三氟丙氧基)嘧啶-2-基]胺

在0℃下将1.00g(4.63mmol)2，4-二氯-5-三氟甲基嘧啶和0.68g(5.99mmol)3，3，3-三氟-1-丙醇在12.2ml乙醚和12.2ml乙腈中的溶液在搅拌下分批与0.24g氢化钠(55％)混合。将混合物在冰浴中缓慢升温至室温，持续过夜。将混合物与冰和稀氯化钠溶液混合。用乙酸乙酯萃取(2次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。得到1.50g的粗产物。将24.1ml乙腈中的1.03g粗产物和0.59g(3.48mmol)4-甲磺酰基苯胺与0.87ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在60℃下搅拌24小时。将混合物与少量碳酸氢钠溶液混合，并在旋转蒸发仪中浓缩。将生成的残余物通过HPLC纯化。得到0.07g(0.15mmol)产物。

系统：Waters Autopurification

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.1％HCOOH

洗脱剂B：乙腈

梯度：0-1min         30％B

1-7.5min       30-80％B

7.5-7.6min     80-99％B

7.6-10min      99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

保留时间：6.3-6.7min

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.66(s，1H)，8.65(s，1H)，7.99(m，2H)，7.88(m，2H)，4.72(tr，2H)，3.17(s，3H)，2.68(m，2H)。

实施例15

(4-烯丙基氧基-5-三氟甲基嘧啶-2-基)(4-甲磺酰基苯基)胺

在0℃下将1.00g(4.63mmol)2，4-二氯-5-三氟甲基嘧啶和0.41ml(5.99mmol)2-丙烯-1-醇在12.2ml乙醚和12.2ml乙腈中的溶液在搅拌下分批与0.24g氢化钠(55％)混合。将混合物在冰浴中缓慢升温至室温，持续过夜。将混合物与冰和稀氯化钠溶液混合。用乙酸乙酯萃取(2次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。得到1.14g的粗产物。

将22.0ml乙腈中的0.76g粗产物和0.55g(3.19mmol)4-甲磺酰基苯胺与0.80ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在60℃下搅拌24小时。将混合物与少量碳酸氢钠溶液混合，并在旋转蒸发仪中浓缩。将生成的残余物通过HPLC纯化。得到32mg(0.09mmol)的产物。

系统：Waters Autopurification

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.1％HCOOH

洗脱剂B：乙腈

梯度：0-1min         30％B

1-7.5min       30-80％B

7.5-7.6min     80-99％B

7.6-10min      99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

保留时间：6.1-6.3min

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.61(s，1H)，8.61(s，1H)，7.95(m，2H)，7.83(m，2H)，6.04(m，1H)，5.38(m，1H)，5.27(m，1H)，5.02(m，2H)，3.14(s，3H)。

实施例16

(4-环己氧基-5-三氟甲基嘧啶-2-基)(4-甲磺酰基苯基)胺

在0℃下将1.00g(4.63mmol)2，4-二氯-5-三氟甲基嘧啶和0.64ml(5.99mmol)环己醇在12.2ml乙醚和12.2ml乙腈中的溶液在搅拌下分批与0.24g氢化钠(55％)混合。将混合物在冰浴中缓慢升温至室温，持续过夜。将混合物与冰和稀氯化钠溶液混合。用乙酸乙酯萃取(2次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。得到1.30g的粗产物。

将16.0ml乙腈中的0.65g粗产物和0.40g(2.3mmol)4-甲磺酰基苯胺与0.80ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在60℃下搅拌24小时。将混合物与少量碳酸氢钠溶液混合，并在旋转蒸发仪中浓缩。将生成的残余物通过HPLC纯化。得到0.05g(0.12mmol)的产物。

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂A：H₂O

洗脱剂B：乙腈

梯度：

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围210-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围160-1000m/z

温度：室温

保留时间：6.2-6.5min

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.56(s，1H)，8.57(s，1H)，7.95(m，2H)，7.82(m，2H)，5.24(m，1H)，3.14(s，3H)，1.91(m，2H)，1.53(m，8H)。

比较化合物的制备

实施例C1

(2R，3R)-3-[2-(4-环丙磺酰基苯基氨基)-5-三氟甲基嘧啶-4-基氨基]丁-2-醇

终产物的制备

将10.2ml乙腈中的566mg(2.10mmol)(2R，3R)-3-(2-氯-5-三氟甲基嘧啶-4-基氨基)丁-2-醇和414mg(2.10mmol)4-甲磺酰基苯胺与0.52ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在60℃下搅拌17小时。将混合物在旋转蒸发仪中浓缩，并将生成的残余物色谱纯化(DCM/乙醇95∶5)。得到670mg(1.56mmol，收率：74％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.13(s，1H)，8.27(s，1H)，7.97(m，2H)，7.75(m，2H)，6.08(d，1H)，5.07(d，1H)，4.14(m，1H)，3.77(m，1H)，2.74(m，1H)，1.20(d，3H)，1.00(m，7H)。

MS：431(ESI+)

实施例C2

(2R，3R)-3-[2-(4-甲磺酰基苯基氨基)-5-三氟甲基嘧啶-4-基氨基]丁-2-醇

a)中间体的制备

实施例C2.1

(2R，3R)-3-(2-氯-5-三氟甲基嘧啶-4-基氨基)丁-2-醇三氟乙酸盐

在0℃下将139ml乙腈中的7.60g(35.0ml)2，4-二氯-5-三氟甲基嘧啶和4.40g(35.0mmol)(2R，3R)-3-氨基丁-2-醇盐酸盐在搅拌下与9.71ml(70.0mmol)三乙胺逐滴混合。将混合物在冰浴中缓慢升温至室温。3天后，将混合物加入到半浓缩的氯化钠溶液中。用乙酸乙酯萃取(2次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物通过HPLC纯化。得到2.49g(6.5mmol；收率：19％)的产物。

柱：XBridge C18 5μ100×30mm

洗脱剂：A：H₂O；B：MeCN

缓冲液：A/0.1％TFA

梯度：60％A+40％B(2’)_40→70％B(5，5’)→99％B(0.1’)

流速：50.0ml/min

检测器：DAD(200-400nm)TAC；MS-ESI+(125-925m/z)TIC

温度：室温

保留时间：3.1-3.8min

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.38(s，1H)，6.73(d，1H)，4.07(m，1H)，3.71(m，1H)，1.12(d，3H)，1.01(d，3H)。

b)终产物的制备

将1.4ml乙腈中的84mg(0.22mmol)(2R，3R)-3-(2-氯-5-三氟甲基嘧啶-4-基氨基)丁-2-醇三氟乙酸盐和46mg(0.22mmol)4-甲磺酰基苯胺盐酸盐与0.06ml 4N的氯化氢的二氧六环溶液混合，并在50℃下搅拌。19小时后，再次加入21mg(0.06mmol)(2R，3R)-3-(2-氯-5-三氟甲基嘧啶-4-基氨基)丁-2-醇三氟乙酸盐，并在50℃下将混合物再次搅拌24小时。将混合物在旋转蒸发仪中浓缩，并将生成的残余物色谱纯化(DCM/乙醇95∶5)。得到42mg(0.10mmol，收率：45％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.13(s，1H)，8.26(s，1H)，7.96(m，2H)，7.78(m，2H)，6.08(d，1H)，5.07(br，1H)，4.14(m，1H)，3.76(m，1H)，3.12(s，3H)，1.20(d，3H)，1.05(d，3H)。

MS：405(ESI+)

实施例C3

(R)-3-[2-(4-甲磺酰基苯基氨基)-5-三氟甲基嘧啶-4-基氨基]-2-甲基丁-2-醇

a)中间体的制备

化合物C3.1

(R)-3-(2-氯-5-三氟甲基嘧啶-4-基氨基)-2-甲基丁-2-醇

在0℃下将227ml乙腈中的12.4g(57.4mmol)2，4-二氯-5-三氟甲基嘧啶和5.90g(57.3mmol)(R)-3-氨基-2-甲基丁-2-醇在搅拌下与15.85ml(114.4mmol)三乙胺逐滴混合。将混合物在冰浴中缓慢升温至室温。18小时后，将混合物加入到半浓缩的氯化钠溶液中。用乙酸乙酯萃取(2次)。将合并的有机相干燥(Na₂SO₄)，过滤并通过蒸发浓缩。将生成的残余物通过HPLC纯化。得到6.39g(22.5mmol；收率：39％)的产物。

柱：XBridge C18 5μ105×30mm

洗脱剂A：H₂O/0.2％NH₃

洗脱剂B：乙腈

梯度：0min        99％A    1％B

1.00min     99％A    1％B

7.50min     1％A     99％B

10.00min    1％A     99％B

流速：50.0ml/min

检测器：DAD扫描范围200-400nm

MS ESI+，ESI-，扫描范围120-1000m/z

温度：室温

保留时间：6.9-8.3min

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.45(s，1H)，6.55(d，1H)，5.00(s，1H)，4.11(m，1H)，1.14(m，9H)。

b)终产物的制备

在60℃下将3.4ml乙腈中的199mg(0.70mmol)(R)-3-(2-氯-5-三氟甲基嘧啶-4-基氨基)-2-甲基丁-2-醇和146mg(0.70mmol)4-甲磺酰基苯胺盐酸盐搅拌16小时。将混合物在旋转蒸发仪中浓缩，并将生成的残余物色谱纯化(DCM/乙醇95∶5)。得到151mg(0.36mmol，收率：51％)的产物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.14(s，1H)，8.27(s，1H)，7.96(m，2H)，7.78(m，2H)，6.06(d，1H)，4.91(br，1H)，4.11(m，1H)，3.12(s，3H)，1.11(m，9H)。

MS：419(ESI+)

实施例17

检测1：CDK1/CycB激酶检测

从ProQinase GmbH，Freiburg购得由杆状病毒感染的昆虫细胞(Sf9)纯制的重组CDK1和CycB-GST融合蛋白。用作激酶底物的组蛋白IIIS商购自Sigma。

在各种浓度的测试物质(0μM，以及0.001-10μM的范围内)的存在下，在22℃下将CDK1/CycB(200ng/测量点)在检测缓冲液[50mM的Tris/HCl pH 8.0；10mM的MgCl₂；0.1mM的原钒酸钠；1.0mM的二硫苏糖醇、0.5μM的三磷酸腺苷(ATP)；10μg/测量点的组蛋白IIIS；0.2μCi/测量点的³³P-γATP；0.05％NP40；1.25％二甲亚砜]中温育10分钟。通过加入EDTA溶液(250mM；pH 8.0；15μl/测量点)使反应停止。

对于每个反应混合物，取15μl施加到P30滤纸条(来自Wallac)上，并通过将滤纸条在0.5％磷酸中洗涤三次(每次10分钟)来除去未掺入的³³P-ATP。将滤纸条在70℃下干燥1小时，然后用闪烁剂条(scintillator strip)(MeltiLex^TM A，Wallac)将其覆盖，并在90℃下烘烤1小时。在γ-射线测量仪(Wallac)中通过闪烁测量测定所掺入的³³P的量(底物磷酸化)。将测量的数据标准化至0％抑制(无抑制剂的酶反应)和100％抑制(除了酶之外的全部检测组分)。使用该公司的自带软件通过四参数拟合(4-parameter fit)来测定IC₅₀值。

检测2：CDK2/CycE激酶检测

从ProQinase GmbH，Freiburg购得由杆状病毒感染的昆虫细胞(Sf9)纯制的重组CDK2和CycE-GST融合蛋白。用作激酶底物的组蛋白IIIS商购自Sigma。

在各种浓度的测试物质(0μM，以及0.001-10μM的范围内)的存在下，在22℃下将CDK2/CycE(50ng/测量点)在检测缓冲液[50mM的Tris/HCl pH 8.0；10mM的MgCl₂；0.1mM的原钒酸钠；1.0mM的二硫苏糖醇；0.5μM的三磷酸腺苷(ATP)；10μg/测量点的组蛋白IIIS；0.2μCi/测量点的³³P-γATP；0.05％NP40；1.25％二甲亚砜]中温育10分钟。通过加入EDTA溶液(250mM；pH 8.0；15μl/测量点)使反应停止。

对于每个反应混合物，取15μl施加到P30滤纸条(来自Wallac)上，并通过将滤纸条在0.5％磷酸中洗涤三次(每次10分钟)来除去未掺入的³³P-ATP。将滤纸条在70℃下干燥1小时，然后用闪烁剂条(MeltiLex^TM A，Wallac)将其覆盖，并在90℃下烘烤1小时。在γ-射线测量仪(Wallac)中通过闪烁测量测定所掺入的³³P的量(底物磷酸化)。将测量的数据标准化至0％抑制(无抑制剂的酶反应)和100％抑制(除了酶之外的全部检测组分)。使用该公司的自带软件通过四参数拟合来测定IC₅₀值。

检测3：CDK4/CycD激酶检测

从ProQinase GmbH，Freiburg购得由杆状病毒感染的昆虫细胞(Sf9)纯制的重组CDK4和CycD1-GST融合蛋白。在各种浓度的测试物质(0μM，以及0.001-10μM的范围内)的存在下，在22℃下将CDK4/CycD1(250ng/测量点)在31μl检测缓冲液[50mM Hepes pH 7.0；2.5mM MnCl；0.05mM原钒酸钠；1.0mM二硫苏糖醇；0.25μM三磷酸腺苷(ATP)；0.5μM生物素化的髓磷脂碱蛋白(bio-MPB，GE Healthcare)；0.05μCi/测量点的³³P-γATP；0.005％NP40；0.025％牛血清蛋白；3％二甲亚砜]中温育3小时。通过加入50μl终止混合物(stop-mix)[100μM ATP；10mM EDTA pH 8.0；0.2％Triton X100；0.125mg抗生蛋白链菌素-SPA珠(GE Healthcare)]使反应停止。在室温下孵化10分钟，然后通过离心(10min；1500g)将SPA珠造粒。在β-射线测量仪(Microbeta，Perkin Elmer)中通过闪烁测量测定所掺入的³³P的量(底物磷酸化)。将测量的数据标准化至0％抑制(无抑制剂的酶反应)和100％抑制(除了酶之外的全部检测组分)。使用该公司的自带软件通过四参数拟合来测定IC₅₀值。

检测4：VEGF受体-2激酶检测

由杆状病毒感染的昆虫细胞(Sf9)纯制作为GST融合蛋白的重组VEGF受体酪氨酸激酶-2。用作激酶底物的聚-(Glu4Tyr)(poly-(Glu4Tyr))商购自Sigma。

在各种浓度的测试物质(0μM，以及0.001-10μM的范围内)的存在下，在22℃下将VEGF受体酪氨酸激酶(90ng/测量点)在30μl检测缓冲液[40mM的Tris/HCl pH 5.5；10mM的MgCl₂；1mM的MnCl₂；3μM的原钒酸钠；1.0mM的二硫苏糖醇；8μM的三磷酸腺苷(ATP)；0.96μg/测量点的聚-(Glu4Tyr)；0.2μCi/测量点的³³P-γATP；1.4％二甲亚砜]中温育10分钟。通过加入EDTA溶液(250mM；pH 8.0；15μl/测量点)使反应停止。

对于每个反应混合物，取15μl施加到P30滤纸条(来自Wallac)上，并通过将滤纸条在0.5％磷酸中洗涤三次(每次10分钟)来除去未掺入的³³P-ATP。将滤纸条在70℃下干燥1小时，然后用闪烁剂条(MeltiLex^TM A，Wallac)将其覆盖，并在90℃下烘烤1小时。在γ-射线测量仪(Wallac)中通过闪烁测量测定所掺入的³³P的量(底物磷酸化)。将测量的数据标准化至0％抑制(无抑制剂的酶反应)和100％抑制(除了酶之外的全部检测组分)。使用该公司的自带软件通过四参数拟合来测定IC₅₀值。

检测5：增殖检测

在200μl的相应生长培养基中，将培养的人肿瘤细胞(MCF7，激素依赖性人乳腺癌细胞，获自ATCC HTB22；NCI-H460，人非小细胞肺癌细胞，ATCC HTB-177；DU 145，激素依赖性人前列腺癌细胞，ATCC HTB-81；HeLa-MaTu，人宫颈癌细胞，EPO-GmbH，Berlin；HeLa-MaTu-MDR，耐多药人宫颈癌细胞，EPO-GmbH，Berlin；Caco-2，人结肠癌细胞，ATCC HTB-37；B16F10，小鼠黑色素瘤细胞，ATCC CRL-6475)以约1000-5000个细胞/测量点的密度(取决于具体细胞的生长速率)铺在96孔多滴定板(multititer plate)上。24小时后，将一个板(0点板(zero-point plate))的细胞用结晶紫染色(如下所述)，而将其它板的培养基替换为新的培养基(200μl)，在所述新的培养基中添加有各种浓度的测试物质(0μM，以及0.003-3μM的范围；溶剂二甲亚砜的最终浓度为0.5％)。在测试物质的存在下将细胞温育4天。通过用结晶紫染色细胞来测定细胞增殖：通过在室温下经15分钟加入20μl/测量点的11％的戊二醛溶液来固定细胞。将固定的细胞用水洗涤3次，然后在室温下干燥该板。通过加入100μl/测量点的0.1％结晶紫溶液(通过加入乙酸将pH调节至3)来将细胞染色。将染色细胞用水洗涤3次，然后在室温下干燥该板。通过加入100μl/测量点的10％乙酸溶液来溶解染料。在595nm的波长下通过光度测定来测定消光。将测量的数据标准化至0％抑制[未处理(0μM)的细胞]和100％抑制(0点板的消光值)。使用该公司的自带软件通过四参数拟合来测定IC₅₀值。

检测6：渗透性检测

Caco-2单层细胞是两隔室之间的屏障。此处的细胞与小肠细胞行为相似。可以通过细胞旁或跨细胞转运活性成分。此时，转运在大部分情况下发生在从顶端(apical)(腔(luminal))到底外侧(basolateral)(浆膜(serosal))。在p-糖蛋白底物情况下，通常还观察到从底外侧到顶端的反向转运。

实验操作：从顶端到底外侧和从底外侧到顶端进行渗透性测试。为此，对每种物质使用两个过滤器；在水浴中在37℃下温育90分钟。除了测试物和对照物的双向渗透性以外(对照：低渗透性：PEG 4000；高渗透性：可乐定；定向渗透性(directional permeability)：地高辛)，通过测定跨上皮细胞电阻(transepithelial resistance，TEER)来确定单层细胞的完整性。作为对照物质，(i)PEG 4000用作亲水标记物。由于它的高分子量，其不能渗入细胞膜或渗入紧密连接处的孔中。因此PEG 4000为单层细胞完整性以及紧密连接严密性(narrowness)的标记物。PEG 4000不被人所吸收。(ii)可乐定已知为在人体内完全吸收(100％)的物质。它们充当Papp值超过100nm/s的非常高渗透性物质的标记物。(iii)地高辛是已知的Pgp物质。其表现出从顶端到底外侧的低渗透性。在逆转实验(reverse experiment)中(从底外侧到顶端)，作为主动定向转运至顶端隔室的结果，Papp值应当更高约为10的因子。

评价：通过供体侧(donor side)和受体侧(receptor side)的物质浓度，根据以下公式计算渗透系数(Papp)：

Papp＝(Vc res/A*Co_t0，don)*(δC_res/δT)，

其中

Vres：受体侧的缓冲液体积，

A：过滤面积＝1cm²，

C_t0，don)：在时间点0的供体侧的物质浓度，

δC_res/δT：受体侧随时间的物质浓度变化。

根据以下图表，渗透系数Papp用于评估人的吸收：

酶检测及细胞检测结果

表1：酶检测结果

表2：增殖检测结果(检测5)

表3：渗透性检测结果(检测6)

酶检测及细胞检测结论

与WO 2003/032997的实施例1的结构692相比，本发明实施例1-3的化合物表现出2至6倍高的细胞周期蛋白依赖激酶CDK1活性抑制以及3至7倍高的CDK2高的抑制(表1)。实施例1-3的化合物表现出那摩尔浓度的CDK4强效抑制，而WO 2003/032997的实施例1的结构692在浓度1000nM依然未达到CDK4活性的半最大抑制。同时，与对VEGF受体激酶-2(VEGF-R2)的抑制相比，实施例1-3对CDK抑制的选择性明显增加(CDK抑制的15至50倍高)，而WO 2003/032997的实施例1的结构692仅具有约2倍的选择性。在细胞增殖检测中，实施例1-3的化合物在比WO 2003/032997的实施例1的结构692低得多的浓度下表现出50％增殖抑制(表2，例外：实施例2对MCF7细胞)。令人惊讶的是，这种效果对细胞系DU145、Caco-2、HeLa-MaTu-ADR以及B16F10(与WO 2003/032997的实施例1的结构692相比，实施例1-3的化合物具有高达130倍的更好的抗增殖活性)特别显著。渗透性检测(表3)表明，实施例1-2的化合物具有通过闭合Caco-2细胞层的良好及自由的渗透。WO 2003/032997的实施例1的结构692的特征是在于其在吸收方向具有非常弱的渗透以及在流出方向具有高的渗透。

实施例1-3与类似的4-N化合物(比较例C1-C3)的直接对比揭示，与VEGF受体激酶-2相比，实施例1-3的化合物以至少为2的因子具有激酶选择性的改善。与比较例相比，实施例1-2的化合物表现出CDK4抑制的改善，并且对细胞系DU145和HeLa-MaTu-ADR表现出以大于2的因子增强的抗增殖效果。

此数据证明本发明化合物(实施例1-3)相比于最接近的现有技术(WO 2003/032997)的优势。通过参考实施例化合物在已知耐化学疗法的细胞系DU145、HeLa-MaTu-ADR和Caco-2中的增强的抗增殖活性可以清楚地表明这一点。