一种猪源链球菌的高密度培养方法

摘要

本发明公开了一种猪源链球菌的高密度培养方法，其步骤：（1）制备平板种子：将冻干保存的猪源链球菌野生种在TSA平皿上划线，培养，待长出单菌落后，再接种TSA平板，保存；（2）制备一级种子液：用接种环取一环的一级种子的单菌落，接种于TSB液体培养基中，培养，得到一级种子液；（3）制备二级种子液：取一级种子液接种量接入装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养，得到猪链球菌二级种子液；（4）上罐发酵；A、发酵液配制；B、接种及补料；C、发酵控制；D、发酵终点判断：当DO值重新由较低值回升到80%，放罐收菌。原料来源广泛、低廉，发酵快、产量高，提高猪链球菌菌体抗原的发酵水平，带来优质、价廉的猪链球菌疫苗产品。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高密度培养猪源链球菌的方法。

背景技术

链球菌病(streptococosis)主要是由β溶血性链球菌引起的多种人兽共患病的总称，临床症状多种多样，可引起各种化脓创和败血症及局部感染，曾多次在国内外出现爆发流行，不仅给世界畜牧业造成巨大损失，而且危及公共卫生安全。动物中以猪、马、牛、羊、鸡较多见。链球菌的形态特征为：球状细菌、呈链状排列，菌链长短不一，G⁺。在血液、腹水、组织涂片中可见有荚膜的链球菌，对培养要求较严格，需用血液培养基。在菌落周围形成β(完全溶血)或α型(草绿色溶血环)。根据兰氏分类可分为20个群，使猪致病者，主要是C、D(R、S)、E、L群，常见分离种有C群的马链球菌群兽疫亚种，R群的猪链球菌2型，S群的猪链球菌1型，还有猪链球菌7、1/2、9、3型等。

接种疫苗作为人类防治链球菌感染和大规模扩散的最强有力手段，已经在很多国家对链球菌的有效控制中发挥了重要作用。虽然不少国家的科研人员都在大力开发基因工程活载体疫苗和亚单位疫苗等第二代链球菌疫苗产品，但目前还没有较成熟的此类产品面市，传统的全菌体灭活疫苗和减毒活疫苗任占领着全部的链球菌疫苗市场。

在目前我国链球菌全菌体疫苗的关键生产技术中，菌体高密度培养技术的滞后，严重阻碍了疫苗生产效率的提高、企业的发展及对动物疫病的有效防止。本发明通过应用高密度发酵技术，对猪源链球菌进行大规模培养，着重研究其发酵过程中菌体生长、基质消耗、中间产物的生成和转化、产物生成的动态平衡及其内在规律等，确定控制发酵代谢的限制因子，实现对其发酵代谢过程的调节和控制，优化发酵培养基成分、菌体培养条件和发酵罐发酵工艺，并进行中试放大及产业化放大研究，实现链球菌菌体抗原的高密度培养。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种高密度培养猪源链球菌的方法，本方法原料来源广泛、成本低廉，并较常规的发酵方法生长快、菌数高，且易于实现猪源链球菌菌体抗原的大规模高密度培养。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

通过应用高密度发酵技术，对猪源链球菌进行大规模培养，实现对其发酵代谢过程的调节和控制，优化发酵培养基成分、菌体培养条件和发酵罐发酵工艺，并进行中试放大及产业化放大研究，实现链球菌菌体抗原的高密度培养。

一种猪源链球菌的高密度培养方法，其步骤是：

(1)制备平板种子：将冻干保存的猪源链球菌在TSA平皿上划线，置37℃培养16～24小时，待长出单菌落后，再接种TSA平板若干个(3-8个)，置37℃培养14～16小时，2～8℃保存。

上述猪源链球菌，具体涉及：常见至病猪分离的各种血清型链球菌，所述的猪链球菌为1型(SS1)、2型(SS2)、7型(SS7)、9型(SS9)或C群马链球菌兽疫亚种中的任意一种。所涉及到的猪链球菌1型(SS1)、2型(SS2)由华中农业大学(赵战勤，胡睿铭，吴斌等.猪源链球菌的分离鉴定及生物学特性研究.畜牧兽医学报，2007，38(4)：367～381.)提供；所涉及到的7型菌为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏菌株，其保藏号CCTCC NO：M2011160；所涉及到的9型(SS9)22083株为从加拿大引进，由中国动物卫生与流行病学中心提供；所涉及到的C群马链球菌兽疫亚种为ATCC35246株，分离于中国四川，或购自美国菌种保藏中心(ATCC)。

(2)制备一级种子液：用接种环取一环步骤(1)的一级种子的单菌落(挑3-5个)，接种于TSB液体培养基(TSB+7％体积浓度的牛血清)中，置37℃摇床170rpm/min，培养5-7小时，OD₆₀₀达到0.4～0.6，得到一级种子液。

(3)制备二级种子液：取步骤(2)的一级种子液以V/V计为1.5％的接种量接入装有200mL发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，控制摇床温度为37℃，转速为170rpm，起始pH为6.8-7.5，发酵周期为4-6小时，得到猪链球菌二级种子液；

二级种子液配方：酵母粉(25g/L)、胰蛋白胨(25g/L)、硫酸镁(0.3g/L)、醋酸铵(3g/L)调pH值达到7.1-7.5，121℃灭菌20min，加入牛血清5％(V/V)，(300g/L浓度的)葡萄糖1％、1M磷酸缓冲液5％(V/V)。

(4)上罐发酵：

1.发酵液配制：酵母粉(25g/L)、胰蛋白胨(25g/L)、硫酸镁(1.5g/L)、醋酸铵(3g/L)，按50％～70％的装液量配制，加入约0.01％体积的泡敌，用NaOH调pH至7.2-7.6，121℃灭菌20min

2.接种及补料：按1％～3％(V/V)的接种量和5％～7％(V/V)的血清量将种子液和血清混合后，用补料泵打入发酵罐中。于接种后补一定体积的(600g/L浓度)葡萄糖溶液，其流加手段包括：对数期一次流加发酵液终浓度为0.7％(m/V)葡萄糖、对数期分次流加终浓度为0.25％(m/V)葡萄糖、对数期连续流加葡萄糖溶液(维持糖质量浓度在0.05％～0.1％)，其最优流加手段为对数期连续流加葡萄糖溶液(维持糖浓度在0.05％～0.1％)。

3.发酵控制：通过pH控制和DO控制维持菌体的对数生长。其pH控制手段有：初始磷酸缓冲液控pH值、在线流加NaOH溶液控pH值在6.7～7.3、在线流加氨水溶液控pH值在6.7～7.3，其中最优控制手段为在线流加氨水溶液控pH值在6.7～7.3；其DO控制手段：在对数生长期通过加速搅拌和提高通气量维持DO值在10％～30％。

4.发酵终点判断：当DO值重新由较低值回升到较高时(80％以上)，即可放罐收菌。

本发明通过对猪源链球菌的高密度培养，在3L罐中的活菌量可达120亿/毫升，总菌量OD₆₀₀值达到4.854；在100L罐中的活菌量可达71亿/毫升，总菌量OD₆₀₀值达到6.752，远远高于目前国内外较多应用商品化TSB培养基的常规培养。本发明的原料来源广泛、低廉，工艺控制和放大简单易行，发酵快、产量高，将会极大提高我国猪链球菌菌体抗原的发酵水平，带来足以满足国内需求的优质、价廉的猪链球菌疫苗产品。

附图说明

图1为一种在常规TSB培养条件下和本发明优化培养条件下，猪链球菌7型在3L罐中的菌体生长曲线的比较。

图2为一种在常规TSB培养条件下和本发明优化培养条件下，C群马疫链球菌兽疫亚种在3L罐中的菌体生长曲线的比较。

具体实施方式

实施例1：磷酸缓冲液控pH发酵

菌种来源：猪链球菌2型，于2004年9月分离于湖北罗田某猪场(猪链球菌2型请见赵战勤，胡睿铭，吴斌等.猪源链球菌的分离鉴定及生物学特性研究.畜牧兽医学报，2007，38(4)：367～381)。

一种猪源链球菌的高密度培养方法，其步骤是：

(1)制备平板种子：将冻干保存的猪链球菌2型种子菌在TSA平皿上划线，置37℃培养16或18或20或22或24小时，待长出单菌落后，再接种TSA平板若干个(3或5或6或7或8个)，置37℃培养14或15或16小时，2或4或6或8℃保存。

(2)制备一级种子液：用接种环取一环步骤(1)的一级种子的单菌落(挑3或4或5个)，接种于TSB液体培养基(TSB+7％体积浓度的牛血清)中，置37℃摇床170rpm/min，培养5或6或7小时，OD₆₀₀达到0.4或0.5或0.6，得到一级种子液。

(3)制备二级种子液：取步骤(2)的一级种子液以V/V计为1.5％的接种量接入装有200mL发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，控制摇床温度为37℃，转速为170rpm，起始pH为6.8或7或7.2或7.4或7.5，发酵周期为4或5或6小时，得到猪链球菌二级种子液；

二级种子液配方：酵母粉(25g/L)、胰蛋白胨(25g/L)、硫酸镁(0.3g/L)、醋酸铵(3g/L)调pH值达到7.1-7.5，121℃灭菌20min，加入牛血清5％(V/V)，(300g/L浓度的)葡萄糖1％、1M磷酸缓冲液5％(V/V)。

(4)上罐发酵：

1.发酵液配制：酵母粉(25g/L)、胰蛋白胨(25g/L)、硫酸镁(1.5g/L)、醋酸铵(3g/L)，按50％～70％的装液量配制，加入约0.01％体积的泡敌，用NaOH调pH至7.2或7.3或7.4或7.5或7.6，121℃灭菌20min

2.接种及补料：按1％或2％或3％(V/V)的接种量和5％或6％或7％(V/V)的血清量将种子液和血清混合后，用补料泵打入发酵罐中。于接种后补一定体积的(600g/L浓度)葡萄糖溶液，其流加手段包括：对数期一次流加发酵液终浓度为0.7％(m/V)葡萄糖、对数期分次(3次)流加终浓度为0.25％(m/V)葡萄糖、对数期连续流加葡萄糖溶液(维持糖质量浓度在0.05％～0.1％)，其最优流加手段为对数期连续流加葡萄糖溶液(维持糖浓度在0.05％～0.1％)。

3.发酵控制：通过pH控制和DO控制维持菌体的对数生长。其pH控制手段有：初始磷酸缓冲液控pH值、在线流加NaOH溶液控pH值在6.7或6.9或7.1或7.3、在线流加氨水溶液控pH值在6.7或6.9或7.1或7.3，其中最优控制手段为在线流加氨水溶液控pH值在6.7或6.9或7.1或7.3；其DO控制手段：在对数生长期通过加速搅拌和提高通气量维持DO值在10％～30％。

4.发酵终点判断：当DO值重新由较低值回升到较高时(80％以上)，即可放罐收菌。

结果如表1，可知菌体在对数生长初期就已将葡萄糖耗尽，后期有可能是利用葡萄糖再生途径为自身提供葡萄糖，因此可以考虑在对数生长期补加适当浓度的葡萄糖满足菌体生长需要。

表1

  OD₆₀₀  CFU/ml(＊10⁸)  Glc(＊10^-5)  Glu(＊10^-5)  1-3H  1.407  35.1  10  86  1-5H  2.969  60  13  86  1-7H  3.855  83  13.5  87  1-9H  4.290  62.3  12  1-10H  4.080  11  1-18H  4.008

实施例2：在线流加NaOH或NH₃控pH值发酵

菌种来源：同实施例1

培养基配方：葡萄糖(3g/L)、酵母粉(25g/L)、胰蛋白胨(25g/L)、硫酸镁(1.5g/L)、醋酸铵(3g/L)、牛血清6％(V/V)

种子液：1.5％(V/V)接种量，OD₆₀₀值0.75

发酵罐：装液量1.5L(50％装液体积)；搅拌180rpm，通气1L/min；1#罐：在线流加NaOH控pH 6.8～7.0。2#罐：在线流加NH₃控pH6.8～7.0。

结果如表2，而由取样过程中样品的活菌数和总菌量的变化，可知用NH₃在线控制pH值6.8～7.0，较用NaOH在线控制pH 6.8～7.0值更有利于菌体的持续生长。

表2

其它步骤与实施例1相同。

实施例3：在线葡萄糖流加培养

菌种来源：同实施例1

培养基配方：葡萄糖(3g/L)、酵母粉(25g/L)、胰蛋白胨(25g/L)、硫酸镁(1.5g/L)、醋酸铵(3g/L)、牛血清6％(V/V)。

种子液：1.5％(V/V)接种量，OD₆₀₀值0.561。

发酵罐：装液量1.5L(50％装液体积)；搅拌180rpm，通气1L/min；1∶4NH₃控pH 7.0左右；于发酵后3h、5h、7h补加发酵液2.5‰，2.5‰，2.5‰(m/V)的葡萄糖(配成15％(m/V)浓度的溶液加入)。

结果如表3，由数据可知，NH₃在线控pH7.0左右发酵时，在对数生长期流加葡萄糖有利于高密度发酵。

表3

  OD₆₀₀  CFU/ml(＊10⁸)  Glc(＊10^-5)  3h  0.406  4.4  142.5  5h  2.115  61.0  16  7h  2.826  76.3  11  8h  3.528  98.0  7  18h  3.060  4

其它步骤与实施例1相同。

实施例4：溶氧控制发酵

菌种来源：同实施例1

培养基配方：酵母粉(25g/L)、胰蛋白胨(25g/L)、硫酸镁(1.5g/L)、醋酸铵(3g/L)，121℃灭菌20min，冷却后加5％(V/V)的牛血清

种子液：接种量1.5％(V/V)，OD₆₀₀值0.816

发酵罐：装液量1.5L(50％装液体积)；1∶4(V/V)稀释NH₃水控pH 6.8左右；葡萄糖补加策略：初始不加葡萄糖，从发酵2h～7h连续补加恒速葡萄糖，共消耗15％(m/V)的葡萄糖70ml；对数期通过调整转速及通气控制DO值在10％～30％。

结果如表四，由数据可知，在对数期对溶氧进行控制(DO为10％～30％)有利于高密度发酵。

表4

  CFU/ml  OD₆₀₀  3h  1.484

  5h  83.7  4.56  6h  120.0  4.854  7h  94.7  4.752

其它步骤与实施例1相同。

实施例5：100L发酵罐发酵

菌种来源：同实施例1

培养基配方：酵母粉(25g/L)、胰蛋白胨(25g/L)、硫酸镁(1.5g/L)、醋酸铵(3g/L)，121℃灭菌20min，冷却后加5％牛血清

一级种子液：OD₆₀₀值0.736，接种量1.5％(V/V)。

二级种子液：OD₆₀₀值2.136，接种量1％(V/V)。

发酵罐：装液量70L(70％装液体积)；浓NH₃水控pH 6.8～7.3左右；葡萄糖补加策略：初始不加葡萄糖，从发酵2h～5h连续补加葡萄糖，共消耗60％(m/V)的葡萄糖800ml；对数期通过调整转速及通气控制DO值在10％～30％。

发酵结果，6h左右活菌量达到最大值约71亿/毫升，OD值为6.752。

实施例6：猪链球菌7型发酵

菌种：猪链球菌7型，为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏菌株，其保藏号CCTCCNO：M2011160

对照培养基：TSB培养基(美国BD公司)，加5％(V/V)牛血清

优化培养基配方：酵母粉(25g/L)、胰蛋白胨(25g/L)、硫酸镁(1.5g/L)、醋酸铵(3g/L)，121℃灭菌20min，冷却后加5％(V/V)牛血清

种子液：接种量1.5％(V/V)，OD₆₀₀值1.108

发酵罐：装液量1.5L(50％装液体积)；1∶4(V/V)稀释NH₃水控pH 7.0左右；葡萄糖补加策略：初始不加葡萄糖，从发酵2h～7h连续补加恒速流加葡萄糖，共消耗15％(m/V)的葡萄糖70ml。对数期通过调整转速及通气控制DO值在10％～30％。

发酵过程生长曲线结果见附图1，自配优化培养(本发明)在7h左右达到最大活菌量约97亿左右(OD₆₀₀值为4.268)，远高于对照TSB常规发酵20亿左右(OD₆₀₀值为1.59)的水平。

实施例7：C群马疫链球菌兽疫亚种发酵

菌种来源：C群马疫链球菌兽疫亚种ATCC35246株，分离于中国四川，或购自美国菌种保藏中心(ATCC)。

对照培养基：TSB培养基(美国BD公司)，加5％(V/V)牛血清

优化培养基配方：酵母粉(25g/L)、胰蛋白胨(25g/L)、硫酸镁(1.5g/L)、醋酸铵(3g/L)，121℃灭菌20min，冷却后加5％(V/V)牛血清。

种子液：接种量3％(V/V)，OD₆₀₀值0.564

发酵罐：装液量1.5L(50％装液体积)；1∶4(V/V)稀释NH₃水控pH 7.2左右；葡萄糖补加策略：初始不加葡萄糖，从发酵3h～8h连续恒速补加葡萄糖，共消耗15％(m/V)的葡萄糖70ml。对数期通过调整转速及通气控制DO值在10％～30％。

发酵过程生长曲线结果见附图2，自配优化培养(本发明)在8h左右达到最大活菌量约85亿左右(OD₆₀₀值为4.098)，远高于对照TSB常规发酵15亿左右(OD₆₀₀值为1.394)的水平。