荷花植物络合素合酶基因NnPCS1及其植物表达载体和构建方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，公开了荷花植物络合素合酶基因NnPCS1及其植物表达载体和构建方法。荷花植物络合素合酶基因NnPCS1，序列为SEQ ID NO.1。NnPCS1是一个新的耐重金属基因，该基因可提高植物耐重金属性。荷花植物络合素合酶基因NnPCS1的植物表达载体，由所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1与植物表达载体构成。本发明NnPCS1的植物表达载体载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创造耐重金属新种质，提高植物的耐重金属性，可用于进行植物品种改良。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及荷花植物络合素合酶基因NnPCS1及其植物表达载体和构建方法。

背景技术

重金属污染是环境污染的主要方面。据统计，我国受Cd、As、Cr、Pb等重金属污染的耕地面积近2000万hm2，约占耕地总面积的1/5；其中工业“三废”污染耕地1000万hm2，污水灌溉的农田面积已达330多万hm^2[1]。因此重金属在环境中的分布、迁移、转化一直是环境科学领域的研究热点之一^[2]。近年来利用植物修复重金属污染的土壤和水体的提出，使绿色植物的应用超越了过去只是作为金属矿藏指示植物或重金属超富集植物的使用范围。相对于传统的物理化学技术及微生物处理技术而言，植物修复技术以其成本低廉、不破坏土壤和河流生态环境、不引起二次污染等独特优势，备受国内外学术界和产业界的密切关注。荷花(Nelumbo nucifera)，又称中国莲，属睡莲科莲属大型多年生挺水植物，是中国十大传统名花之一，具有极高的观赏价值和经济价值，多分布于淡水湖泊地区，耐水淹、抗性强，深受各国人民喜爱。

植物络合素(phytochelatin，PC)是一类被广泛研究的配体。PC是一类富含巯基的螯合多肽，在植物界广泛存在，可与金属离子螯合成稳定的硫肽复合物，这些复合物通过转运蛋白能够被运输到胞外，或将其储存在液泡内，降低对植物的毒害，使植物能够吸收和累积更多的污染物，提高修复效率^[3]。植物络合素基因(PCS)是一类由重金属离子诱导的基因，在解除重金属离子的毒害、维持组织中金属离子的稳态以及调节金属离子向特定组织的运输等方面起重要作用^[4]。

PCS1基因最早在两个植物中克隆出来，即拟南芥和小麦，然后依次从印度芥菜和Ni超积累植株天蓝遏蓝菜克隆出来^[5，6]，拟南芥AtPCS1基因的功能和耐重金属机理进行了较为深入的研究^[7，8]。

在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将植物络合素合酶基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有耐重金属的新种质。对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一个新的植物络合素合酶基因NnPCS1，解决提高大型观赏水生花卉荷花耐重金属性，修复水体污染的问题，

本发明还提供该植物络合素合酶基因NnPCS1的植物表达载体及其构建方法。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化，创制耐重金属新种质，可用于植物品种改良。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

荷花植物络合素合酶基因NnPCS1，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

荷花植物络合素合酶基因NnPCS1的植物表达载体，由所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1与植物表达载体构成。

所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1的植物表达载体优选将经Bam I和Sac I双酶切的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1插入到植物表达载体pCAMBIA1301-220得到的。

所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)设计引物NnPCS1-ZF和NnPCS1-ZR，以冬荷cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，扩增上游和下游分别引入Bam I和Sac I酶切位点的NnPCS1基因，其中上游引物NnPCS1-ZF序列为SEQ ID NO.2，下游引物NnPCS1-ZR序列为SEQ ID NO.3；

(2)将步骤(1)的PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-T Simple-NnPCS1；

(3)利用Bam I和Sac I对pMD19-T Simple-NnPCS1和植物表达载体pCAMBIA1301-220分别进行双酶切，连接Bam I和Sac I双酶切pMD19-T Simple-NnPCS1得到的NnPCS1片段与Bam I和Sac I双酶切pCAMBIA1301-220得到的大片段，转化TOP10感受态细胞，阳性质粒即为荷花植物络合素合酶基因NnPCS1植物表达载体pCAMBIA1301-220-NnPCS1。

所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1在提高植物的耐重金属性中的应用。

所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1的植物表达载体在提高植物的耐重金属性中的应用。

其中，所述的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1的植物表达载体优选将经Bam I和Sac I双酶切的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1插入到植物表达载体pCAMBIA1301-220得到的。

本发明的有益效果：

1.本发明提供的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1是一个新的耐重金属基因，该基因可提高植物耐重金属性。

2.本发明构建的荷花植物络合素合酶基因NnPCS1植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创造耐重金属新种质，提高植物的耐重金属性，可用于进行植物品种改良。

附图说明

图1 NnPCS1琼脂糖凝胶电泳分析

M：DNA Marker；1：NnPCS1；2：pMD 19-T Simple-NnPCS1质粒BamH I和Sac I双酶切；

3：pCAMBIA1301-220-NnPCS1表达载体质粒BamH I和Sac I双酶切电泳检测图。

图2植物表达载体pCAMBIA1301-220-NnPCS1构建方案图

图3野生型与转基因拟南芥PCR鉴定结果，WT代表野生型拟南芥，pcs1～pcs8代表八个转基因拟南芥株系。

图4野生型与转基因拟南芥qRT-PCR鉴定结果，WT代表野生型拟南芥，pcs1～pcs8代表八个转基因拟南芥株系。

图5野生型与转基因拟南芥重金属镉含量测定。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

实施例1 NnPCS1的克隆

选用荷花品种‘冬荷’(Nelumbo nucifera Gaertn.‘Donghe’)作为材料，用400μMCdCl₂处理生长至6到8片叶片期的‘冬荷’，3小时后取其嫩叶，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书方法，提取叶片总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取1μg总RNA反转录成cDNA。

以提取的叶片cDNA为模板，设计引物NnPCS1-F和NnPCS1-R进行PCR反应：

上游引物NnPCS1-F：ATGGCGATGGCAGGTCTATACAGGC(SEQ ID NO.4)

下游引物NnPCS1-R：AGAGACTGAAGGTGTGCTGAGGCCA(SEQ ID NO.5)

50μL反应体系：10×RCR Buffer 5.0μL，NnPCS1-F、NnPCS1-R引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，Taq DNA Polymerase 0.2μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 37.8μL；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，反应32个循环，72℃延伸7min；PCR结束后进行琼脂糖电泳(图1)，产物用凝胶回收试剂盒(TAKARA)回收纯化，用T₄DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T Simple载体(TaKaRa)，转化TOP10感受态细胞，序列测定为SEQ ID NO.1。

实施例2.植物表达载体pCAMBIA1301-220-NnPCS1的构建

设计引物NnPCS1-ZF、NnPCS1-ZR进行PCR反应，在目的基因NnPCS1的上游和下游分别引入酶切位点Bam I和Sac I，PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，Bam I和Sac I双酶切的NnPCS1片段与Bam I和Sac I双酶切的pCAMBIA1301-220连接，转化，提取的阳性质，电泳检测并测序验证为SEQ ID NO.1，具体步骤如下：

上游引物NnPCS1-ZF：CGCGGATCCATGGCGATGGCAGGTCTATACAGGC(SEQ ID NO.2)

下游引物NnPCS 1-ZR：CGAGCTCAGAGACTGAAGGTGTGCTGAGGCCA(SEQ ID NO.3)

①以荷花叶片cDNA作为模板，用高保真酶(PrimeSTAR^TM HS DNAPolymerase，TaKaRa)进行PCR反应，50μL反应体系：10×HS RCR Buffer 5.0μL，NnPCS1-ZF、NnPCS1-ZR引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 0.4μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 37.6μL；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，反应32个循环，72℃延伸7min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(TAKARA)回收，连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，PCR鉴定并提取阳性质粒pMD 19-T Simple-NnPCS1；

②取表达载体pCAMBIA1301-220和pMD19-T Simple-NnPCS1分别用Bam I和Sac I双酶切，双酶切体系(50μL)：10×K Buffer 2.5μL，质粒pCAMBIA1301-220或pMD19-TSimple-NnPCS1 10μL，BamH I 2μL，Sac I 2μL，ddH₂O 33.5μL；37℃反应3h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析(图1)，用凝胶回收试剂盒(TAKARA)回收质粒pCAMBIA1301-220大片段和pMD19-T Simple-NnPCS1小片段。用T₄DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应体系(10μL)：10×T₄ ligase Buffer 1μL，pCAMBIA1301-220大片段2μL，pMD19-T Simple-NnPCS1小片段6μL，T₄ DNA连接酶1μL；16℃过夜连接反应，取5μL连接产物转化TOP10感受态细胞。37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pCAMBIA1301-220-NnPCS1，电泳(图1)和测序验证为SEQ ID NO.1。植物表达载体pCAMBIA1301-220-NnPCS1的构建成功，质粒谱图及构建方案图见图2。

实施例3植物表达载体pCAMBIA1301-220-NnPCS1遗传转化拟南芥及其抗重金属性鉴定

①农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化

从YEB(50ug/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50ug/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的100mM CaCl₂(20％甘油)溶液中，200uL/管分装，待用。

取10uL pCAMBIA1301-220-NnPCS1载体质粒，加入200uL EHA105感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800uL YEB液体培养基，28℃ 200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆PCR检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。

②拟南芥花序浸染及种子筛选

将阳性单克隆接到50mL的YEB(50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)液体培养基中，培养24小时，5000rpm离心20分钟，然后用转化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，调pH为5.8，然后加200uL/L的Silwet L-77混合)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养12小时，打开保鲜膜，待种子成熟时采收。

种子消毒与播种：将种子放入1.5mL的离心管中，加入1mL 75％酒精，添加0.1％的TritonX-100摇晃15分钟，然后在超净台中用95％的酒精洗两次，而后直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上，以吹干种子(放置30分钟)，轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基(MS+20mg/L潮霉素+25mg/L氨苄青霉素)筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗1周以保湿。

③PCR鉴定及抗重金属性鉴定

待抗性苗7～8片叶，提取拟南芥叶片DNA，PCR(引物NnPCS1-F和NnPCS1-R)鉴定，结果见图3。。经PCR鉴定的T₁代转基因苗继续生长，采收T₂代种子。对野生型和T₂代抗性转基因拟南芥进行qRT-PCR鉴定，结果见图4。

选取经qRT-PCR鉴定目的基因相对表达量最高的三株拟南芥进行重金属处理：拟南芥播于MS培养基上，一周后移苗，三周后用50μMCdCl₂，100μMCdCl₂处理野生型拟南芥和转基因株系，培养介质为1/2 Hoagland大量营养液加Arnon微量营养液，1周后收获地上部，测Cd²⁺离子含量，发现转基因拟南芥较野生型积累更多的镉离子(图5)。

综上所述，本发明构建了含有荷花植物络合素合酶基因的植物表达载体pCAMBIA1301-220-NnPCS1，其中NnPCS1首次报道。所构建的载体可导入植物中，提高植物的吸收重金属Cd的能力。

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