利用非水系统的活性炭柱色谱法分离纯化青蒿素的方法

摘要

本发明涉及天然药物领域，具体涉及利用非水系统的活性炭柱色谱法分离纯化青蒿素的方法，其特征是：将青蒿叶用乙醇提取，提取液浓缩成浸膏，浸膏溶解后上色谱柱，洗脱，收集流份，即得，其中用活性炭为色谱柱固定相，用非水溶剂为流动相洗脱。本发明分离方法简单快速，具有分离效率高、产品纯度好的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及青蒿素分离纯化技术领域，即利用非水系统为洗脱剂的活性炭柱色谱法从黄花蒿中分离纯化高纯度的青蒿素的方法。

背景技术

黄花蒿(Artemsia annua L.)为菊科蒿属一年生草本植物，又称青蒿，广泛分布于我国各地。青蒿素为从其中分离得到的一具有较强抗疟活性的倍半萜内酯类单体化合物。青蒿素(artemisinin)是一种无色针状结晶，由于其具有特殊的过氧基团，它对热不稳定，易受湿、热和还原物质的影响而分解。青蒿素类药物能够对抗氯喹耐药的恶性疟原虫，其联合用药被世界卫生组织推荐为治疗疟疾的最好选择。但是青蒿素的分离纯化方法仍是以重结晶的方法为主，这种方法需要反复结晶，比较耗时，损失较大，因此，由于其较大的需求量及特殊的化学性质，如何快速、高效地从生药材粗提物中分离并纯化得到青蒿素是大家比较关心的课题。

在上述背景的推动下，近年来青蒿的种植、提取加工业都发展很快，对于青蒿素的分离纯化，纵观其技术方法，可分为以下几类：

(1)重结晶，这种技术方法现占主导地位。其工艺流程主要是将得到的提取液，通过一些除杂手段得到目标段，再利用特定的溶剂反复重结晶得到精品。如中国专利(CN200510017340.6)通过调节PH值沉淀除杂后再用70％乙醇结晶，然后用石油醚重结晶得到青蒿素精品，总收率在0.4％。

此法的优点是：操作简单，不需要很昂贵的仪器，可以批量生产。缺点是步骤比较繁琐，得到较高纯度的青蒿素产品需要反复重结晶，而青蒿素是容易分解变质的，因此，反复的重结晶将会导致其产量的下降。此外，反复的重结晶损失也会加大。

(2)硅胶柱色谱法：这种方法利用正相柱色谱的分离原理，用不同梯度的溶剂系统洗脱以得到目标物。例如Tzu-Ching Tzeng用正己烷-乙酸乙酯＝9∶1作为洗脱溶剂进行硅胶柱层析，所得产品纯度为98.2％，但回收率只有54.4％。(Separation and Purification Technology，2007，56：18-24)。

此法的优点是所得产品纯度较高，但是要得到纯度较高的产品所使用的硅胶量较大，回收率会下降，成本也会加大。

(3)逆流色谱法：Weiss E用逆流色谱分离青蒿素(J Liq Chromatogr Related Technol2000，23：909-913)，这种方法对仪器要求较高，仪器昂贵，操作也较复杂。

目前，活性炭多被用于脱色，在分离过程中，由于其极性小，多被用于分离极性较大的化合物(N Biotechnol 2010，27：862-869；Afr J Trad CAM 2009，6：118-122)。而青蒿素的极性较小，因此，在青蒿素的分离纯化中，考虑到该材料的死吸附较严重，活性炭都是被用于脱色，而未用于分离中。

发明内容

本发明旨在克服以上工艺中存在的一些问题，以得到一个简便、快速、高效的分离青蒿素的方法。

本发明公开了一种利用非水溶剂为洗脱溶剂的活性炭柱色谱法一步分离纯化得到高纯度青蒿素的方法，该方法高效、快速、工艺简单，可在利用简单的设备和经济的分离材料的基础上达到显著的分离效果，产品纯度可达95％左右，并且利用非水系统代替传统的醇-水系统解决了该材料的死吸附问题，使得回收率可达到70％左右。

本发明方法包括：将青蒿叶用乙醇提取，提取液浓缩成浸膏，浸膏溶解后上色谱柱，洗脱，收集流份，即得，本发明采用活性炭为色谱柱固定相，用非水溶剂为流动相洗脱。

发明人在采用活性炭柱层析过程中，曾尝试了传统的甲醇-水系统，选择了60％、80％、100％三个梯度，利用高效液相分析所得样品，均未检测到青蒿素，将柱材卸下来用纯甲醇超声半个小时，检测到了青蒿素，据此可得出结论，传统的醇水系统对于青蒿素的洗脱能力太差，因此舍去。在尝试了多种溶剂系统后，发现二氯甲烷-甲醇系统对于分离纯化青蒿素效果最好。

利用二氯甲烷-甲醇系统作为洗脱剂，在保证纯度和回收率的前提下，考察了上样量和洗脱剂的比例。在其他条件不变的前提下，对于上样量考察了1∶7(浸膏量/活性炭量；g/g)；1∶5；1∶3三个条件，当上样量为1∶7时，纯度为95.6％，回收率为57.3％；当上样量为1∶5时纯度为95.2％，回收率为72.3％；当上样量为1∶3时，纯度为91.3％，回收率为72.1％。因此，综合考虑纯度和回收率，上样量(浸膏量/活性炭量；g/g)优选1∶4.5-1∶5.5之间。对于洗脱过程，洗脱剂选用两个梯度段，第一个梯度段用于除杂，第二个梯度段为目标梯度段，用于洗脱青蒿素，第一个梯度段用二氯甲烷-甲醇(1∶8～1∶15，v/v，本发明中混合溶剂的比例均为体积比)洗脱5～10BV(柱体积)除杂，对于洗脱剂的比例的优选主要是优选第二个梯度段，因此选用了1∶5；2∶5；1∶1三个梯度对洗脱青蒿素的目标梯度进行优选。当洗脱剂比例为1∶5时，纯度为95.5％，回收率为59.5％；当洗脱剂比例为2∶5时，纯度为95.2％，回收率为72.3％；当比例为1∶1时，纯度为92.1％，回收率为72.5％。综合考虑纯度和回收率，目标梯度最优选在1∶2-1∶3之间。

活性炭色谱柱优选湿法装柱，所用溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，两者体积比为：1∶10～1∶20。色谱柱中活性炭的重量为浸膏重量的4～8倍。

本方法所用材料经济、所用方法简单、所用溶剂也易回收避免了青蒿素分解变质，此外，应用此方法只需一步即可得到纯度达95％左右的青蒿素，避免了反复重结晶的繁琐以及带来的产品损失。因此，该方法简单快速，具有分离效率高、产品纯度好的优点。

具体实施方式

实施例1

取400g青蒿叶，用10倍量的工业乙醇在40℃，频率为80KHZ下超声提取三次，每次40min，合并所得药液，过滤，减压回收溶剂并蒸干得52g浸膏。取5g活性炭(200目)用初始溶剂系统(二氯甲烷∶甲醇＝1∶10)拌匀，湿法装柱，所用柱内径为1.6cm，柱长25cm；取1g浸膏，用10ml初始溶剂溶解过滤，所得滤液常压上样，待上样完毕，在4BV/h的流速下，用初始溶剂系统洗脱5BV以除去一些极性较大的油状物，再用目标梯度的溶剂系统(二氯甲烷∶甲醇＝2∶5)洗脱4BV得到纯度达95.2％的青蒿素产品，其回收率达72.5％。

实施例2

取400g青蒿叶，用8倍量的95％乙醇在35℃，频率为100KHZ下超声提取三次，每次30min，合并所得药液，过滤，减压回收溶剂并蒸干得50g浸膏。取6g活性炭(200目)用初始溶剂系统(二氯甲烷∶甲醇＝1∶10)拌匀，湿法装柱，所用柱内径为1.6cm，柱长25cm；取1g浸膏，用10ml初始溶剂溶解过滤，所得滤液常压上样，待上样完毕，在4BV/h的流速下，用初始溶剂系统洗脱5BV以除去一些极性较大的油状物，再用目标梯度的溶剂系统(二氯甲烷∶甲醇＝1∶3)洗脱5BV得到纯度96.5％的青蒿素产品，其回收率达70％。