一种利用LDR技术检测中国荷斯垣牛乳脂率分子标记的方法

摘要

本发明公开了一种利用LDR技术检测中国荷斯垣牛乳脂率分子标记的方法，其特征在于，步骤如下：(1)扩增用于LDR反应包含A8398G位点的片段：以中国荷斯垣牛A8398G基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用LDR技术检测中国荷斯垣牛乳脂率分子标记的方法，属于分子遗传学领域。

技术背景

产奶性状是奶牛业中的重要经济性状。传统的数量遗传学观点认为奶牛的产奶性状(包括产乳量、乳脂量、蛋白含量、乳脂率、乳蛋白率等)为数量性状，由微效多基因决定，并受到环境因素的影响。由于不能对单个微效基因的效应直接进行观察和测定，因而只能借助统计遗传学来描述数量性状的遗传性质。这种研究方法在动物的遗传改良中发挥了巨大的作用，但它不可能将环境因素完全剔除，有一定偏差。

分子遗传学和DNA分析技术的飞速发展，使DNA分子遗传标记如单核普酸多态性(singlenueleotidepolymo印hisms，SNps)被广泛应用于遗传育种研究的各个领域。在奶牛的产奶性状上，把灵敏度极高的一些DNA分析手段应用于奶牛育种中，其主要目的是在DNA分子水平上寻找与奶牛产奶性状密切相关的遗传标记，用于奶牛的标记辅助选择(markerassistantseleetion，MAS)，实现早期选择，加快育种速度。奶牛分子育种是未来奶牛品种改良的主要手段

催乳素(Prolactin，PRL)作为垂体前叶分泌的一种可促进乳腺泌乳的肽类激素，具有广泛而多样的生理作用，如繁殖、泌乳、生长、代谢、维持渗透压及免疫调节等。对奶牛的乳腺发育、泌乳及乳蛋白基因的表达方面具有重要的调节作用。大量研究表明PRL基因第4外显子A8398G突变位点对中国荷斯垣牛的产奶性状相关，把其做为分子标记应用于奶牛的育种具有重要的意义。

目前检测DNA突变位点的方法一般常用限制性片段长度多态性(Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP)技术和单链构象多态性(Single-StrandCon-formationalPolymorphism，SSCP)技术，这两种方法依靠肉眼进行结果的观察，有时会出现判断错误，从而影响检测结果的可靠性。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种利用LDR技术检测中国荷斯垣牛乳脂率分子标记的方法，是利用LDR技术检测中国荷斯垣牛PRL基因GenBank：AF426315中的自5‘端第8398处脱氧核糖核酸是A还是G，确定中国荷斯垣牛的基因型，根据基因型可以判断其产乳性能。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用LDR技术检测中国荷斯垣牛乳脂率的方法，步骤如下：

(1)扩增用于LDR反应包含A8398G位点的片段：以中国荷斯垣牛A8398G基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，用引物在PCR条件下进行扩增，PCR产物大小为156bp，用于LDR反应；

所述引物的序列如下(根据GenBank：AF426315序列设计的，包含A8398G位点)：

上游引物：GAGCTTGATTCTTGGGTTGC；

下游引物：ATCATCTCCATGCCTTCCAG；

(2)进行LDR反应：设计三条探针，然后进行LDR反应；所述三条探针的序列分别如下：

A8398G MODIFY：

P-ACCTCGGTGACTAGGTGATACAGAGTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM；

A8398G_A：TTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGT；

A8398G_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGC

其中，A8398G_MODIFY的末端带有FAM修饰(蓝色荧光)，5’端磷酸化，以便与其它两条特异性探针连接；探针A8398G_A的3’末端碱基与A对应，探针A8398G_G的3’末端碱基与G对应；

(3)分析：LDR反应产物由ABI PRISM-377DNA测序仪检测，根据LDR产物的长度与各基因型进行关联分析，结果如下：基因型AA的LDR产物片段长度为82bp，基因型GG的LDR产物片段长度为84bp，基因型AG的LDR产物片段长度为82bp和84bp的混合。

所述步骤(1)中PCR扩增的条件和参数为：

PCR反应采用20μlQiagen系：包括2.0μl PCR-buffer(10×)，0.6μl Mg²⁺(100mM)，2.0μldNTP(20mM/each)，0.2μl Taq酶(5U/μl)，4.0μl Q-solution(4×)，2.0μl primer(5pM)，1.0μl基因组DNA(50ng/L)，最后加入8.2μl去离子水。

PCR程序为：95℃变性15min，94℃30s，59℃1m，72℃1m，35个循环，最后72℃延伸7min。

反应结束后，取2μl反应产物在3.0％琼脂糖凝胶，0.5×TBE中电泳，得到一条清晰的156bp的DNA条带。

所述步骤(2)中LDR反应的具体步骤为：

在200μl的PCR反应管中，分别加入1μl buffer(10×)，1μl Probe Mix(各Probe等比混合)，0.05μl连接酶(40U/μl)，6.95μl去离子水，最后加入1μl PCR反应产物。连接反应程序为：95℃变性2m，94℃30s，60℃2min，35个循环。

LDR反应产物由ABI PRISM-377DNA测序仪检测，根据LDR产物的长度判断各基因型。

上述分析后，可根据基因判断中国荷斯垣牛乳脂率：PRL基因A8398G突变位点的基因型对对中国荷斯垣牛乳脂率有显著影响(P＜0.05)，各基因型效应值依次为AA(4.40)＞GA(3.77)＞GG(3.72)，AA型的乳脂率比GA型多0.63，比GG型多0.68只，PRL基因A8398G突变位点可以做为中国荷斯垣牛乳脂率分子标记。

本发明的利用LDR技术检测中国荷斯垣牛乳脂率分子标记的方法，以碱基错配为基础，使用特异性探针对特定片段DNA进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。结果分析直接由软件分析，客观性强，避免用肉眼判断电泳图的主观误差及酶切不完全造成的判断错误。

与其他SNP检测技术相比，LDR检测技术拥有准确度高、通用性强、通量大、操作简单、成本低等优点。

附图说明

图1：PRL基因用于LDR分析的PCR扩增产物的电泳图。

图2：PRL基因A8398G突变位点LDR图谱。

图3：PRL基因A8398G突变位点测序图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1利用LDR技术检测中国荷斯垣牛乳脂率分子标记

对中国荷斯垣牛乳脂率进行检测，步骤如下：

(1)扩增用于LDR反应包含A8398G位点的片段：以中国荷斯垣牛A8398G基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，用引物在PCR条件下进行扩增，PCR产物大小为156bp，用于LDR反应；

所述引物的序列如下(根据GenBank：AF426315序列设计的，包含A8398G位点)：

上游引物：GAGCTTGATTCTTGGGTTGC；

下游引物：ATCATCTCCATGCCTTCCAG；

PCR扩增的条件和参数为：

PCR反应采用20μlQiagen系：包括2.0μl PCR-buffer(10×)，0.6μl Mg²⁺(100mM)，2.0μldNTP(20mM/each)，0.2μl Taq酶(5U/μl)，4.0μl Q-solution(4×)，2.0μl primer(5pM)，1.0μl基因组DNA(50ng/L)，最后加入8.2μl去离子水。

PCR程序为：95℃变性15min，94℃30s，59℃1m，72℃1m，35个循环，最后72℃延伸7min。

反应结束后，取2μl反应产物在3.0％琼脂糖凝胶，0.5×TBE中电泳，得到一条清晰的156bp的DNA条带。凝胶电泳结果如图1。

(2)进行LDR反应：设计三条探针，然后进行LDR反应；所述三条探针的序列分别如下：

A8398G_MODIFY：

P-ACCTCGGTGACTAGGTGATACAGAGTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM；

A8398G_A：TTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGT；

A8398G_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTATCTGGGGCTCCTTTCATACCCCGC；

其中，A8398G_MODIFY的末端带有FAM修饰(蓝色荧光)，5’端磷酸化，以便与其它两条特异性探针连接；探针A8398G_A的3’末端碱基与A对应，探针A8398G_G的3’末端碱基与G对应；

LDR反应的具体步骤为：

在200μl的PCR反应管中，分别加入1μl buffer(10×)，1μl Probe Mix(各Probe等比混合)，0.05μl连接酶(40U/μl)，6.95μl去离子水，最后加入1μl PCR反应产物。连接反应程序为：95℃变性2m，94℃30s，60℃2min，35个循环。

(3)分析：LDR反应产物由ABI PRISM-377DNA测序仪检测，根据LDR产物的长度与各基因型进行关联分析，结果如下：基因型AA的LDR产物片段长度为82bp，基因型GG的LDR产物片段长度为84bp，基因型AG的LDR产物片段长度为82bp和84bp的混合。如图2所示。

(4)测序结果：测序结果显示PRL基因GenBank：AF426315序列第8398bp发生了A-G突变。如图3所示。