一种非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白IgA的方法

摘要

本发明公开了一种非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白IgA的方法。本发明所提供的提取动物免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：将动物粪便与提取缓冲液混合，得到混合物；将所述混合物离心，取上清液，即得到所述动物中的免疫球蛋白；所述提取缓冲液由PBS缓冲液和吐温-20组成。本发明提供了一种非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白的简单、高效的方法。通过采集普氏野马新鲜粪便，将新鲜粪便溶于添加有一定浓度Tween-20的提取缓冲液中，进行两步离心取上清液，即可提取得到较高浓度的普氏野马免疫球蛋白。此方法操作简单且提取效率较高。

说明书

技术领域

本发明涉及动物免疫学领域中一种非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白IgA的方法。

背景技术

普氏野马(Equus przewalskii)曾广布于欧亚大陆草原地带，上世纪中叶野外灭绝。现存普氏野马均为西方探险者于十九世纪末在中国和蒙古国西部捕获并运往欧洲圈养的后代。中国于1985年从国外引回该物种并建立了繁育中心。2001年在新疆卡拉麦里自然保护区实施了普氏野马的放归野化。监测和评估重引入物种的生存状态，并实施必要的人工管护，是保证放归物种长期存活和建立野生种群的关键环节，但目前这些方面的工作却开展得很少。究其原因，首先，获取自由生活动物的组织样本十分困难，而且定期或不定期采集研究样本几乎是不可能的；再者，捕捉和采集动物血液样品本身就是一个很强的刺激因子，会严重干扰动物的正常生活。显然，受到样品获取和测定等方面的制约，迄今尚未见放归物种的免疫生理的研究。因此，作为监测动物机体免疫生理的重要指标，免疫球蛋白的提取和检测对放归物种研究尤为重要。

显然，对于监测普氏野马免疫生理状况，传统的抽取血液取样途径已经不再适用，急需要发展一种简单、高效、非损伤提取和检测免疫球蛋白的方法。通常非损伤性取样主要是采集目标动物尿液和粪便，但是普氏野马其活动场地广阔，且多为草地或沙质土地，排出的尿液很快就会渗入地下，不容易收集，并且肾小球滤过膜不能透过球蛋白，因此正常动物尿液中含有的免疫球蛋白很少。胃肠道黏膜固有层可以产生分泌型免疫球蛋白，进入胃肠道的胆汁中也会携带部分来自组织液中的免疫球蛋白。基于这些原因，与采集尿液相比，粪便途径是一个理想的非损伤性检测普氏野马免疫球蛋白的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种提取动物免疫球蛋白的方法。

本发明所提供的一种提取动物免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：

将动物粪便与提取缓冲液混合，得到混合物；将所述混合物离心，取上清液，即得到所述动物免疫球蛋白；所述提取缓冲液由PBS缓冲液和吐温-20组成。

所述提取缓冲液中，所述吐温-20的体积百分比浓度为0.01％-0.5％或0.03％-0.07％或0.03％或0.04％或0.05％或0.06％或0.07％。

所述离心的方法包括以下步骤：将所述混合物进行第一步离心，取上清液，记作上清液I；将所述上清液I进行第二步离心；所述第一步离心的转速为2000rpm、温度为25℃和时间为20min；所述第二步离心的转速为10000rpm、温度为4℃或25℃和时间为10min。

在将所述混合物离心前，包括将所述混合物混匀的步骤。

所述混匀的方法为将所述混合物用涡旋仪在1200rpm下振荡10min。

所述PBS缓冲液由氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和水组成，各成分的浓度分别为氯化钠8.5g/L、磷酸二氢钠0.3g/L和磷酸氢二钠2.2g/L。

所述提取缓冲液的pH值为7.2。

所述提取缓冲液的用量为：每1g所述动物粪便中加入10mL所述提取缓冲液。

所述动物粪便为混匀后的动物粪便。

所述动物为普氏野马；

所述免疫球蛋白为免疫球蛋白IgA。

本发明提供了一种非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白的简单、高效的方法。通过采集普氏野马新鲜粪便，将新鲜粪便溶于添加有一定浓度Tween-20的提取缓冲液中，进行两步离心取上清液，即可提取得到较高浓度的普氏野马免疫球蛋白。此方法操作简单且提取效率较高。

附图说明

图1为含有不同浓度Tween-20的提取缓冲液对普氏野马粪便中IgA提取量的影响。

图2为鱼精蛋白对普氏野马粪便中IgA提取量的影响。

图3为不同离心温度对粪便IgA提取量的影响。

图4为标准品孔的IgA浓度与OD值的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白及其检测

一、吐温浓度对普氏野马粪便中免疫球蛋白提取量的影响

(一)非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白

1、采集粪样

每天同一时间段观察目标动物普氏野马(Equus przewalskii)(新疆普氏野马繁育研究中心(88°45′E，44°10′N))，一旦发现其排出新鲜粪便，立即采集，分别采集雌性普氏野马和雄性普氏野马的粪便，采样对象是10匹成年野马个体(5)，连续3天采集目标个体的新鲜粪便，每天上午和下午各采集1次，将所采集的雌性普氏野马粪便和雄性普氏野马粪便分别装入自封袋中并编号，及时放入-20℃条件下冷冻保存。

2、配制提取缓冲液

(1)配制PBS缓冲溶液

称取8.5g氯化钠、0.3g磷酸二氢钠和2.2g磷酸氢二钠定容于1000ml超纯水中，轻轻振荡混匀，待溶解后，配制成pH值为7.2的PBS缓冲溶液。所述PBS缓冲溶液中氯化钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的浓度分别为：氯化钠8.5g/L、磷酸二氢钠0.3g/L和磷酸氢二钠2.2g/L。

(2)配制提取缓冲液

每1000ml上述PBS缓冲溶液中分别添加不同量(见表1和表2)的吐温-20(Tween-20)，轻轻振荡混匀后，配制得到18个不同Tween-20浓度(见表1和表2)的PBST(PBS+Tween-20)水溶液，作为实验组提取缓冲液。同时以上述PBS缓冲溶液作为对照组提取缓冲液。

表1实验组提取缓冲液中Tween-20的添加量及浓度(0.05％-0.50％)

表2实验组提取缓冲液中Tween-20的添加量及浓度(0.01％-0.09％)

3、提取普氏野马免疫球蛋白

将步骤1采集的雌性普氏野马粪便和雄性普氏野马粪便分别混匀(混匀方法：称取每个个体三天内每天采集的粪样各100g，粉碎机(23000r)粉碎10min，将混匀的样品分小袋保存备用)后，分别称取雌性普氏野马粪便和雄性普氏野马粪便1g于15ml塑料离心管中，分别加入10ml步骤2中配制好的实验组提取缓冲液和对照组提取缓冲液，用涡旋仪在1200rpm振荡10min混匀，得到混合物；将所述混合物用低速离心机(LDZ5-2型台式低速离心机)在转速为2000rpm和温度为25℃的条件下离心20min，取上清液I1ml于2ml塑料离心管中，将所述上清液I用高速冷冻离心机(Heal ForceNeofuge 15R台式高速冷冻离心机)在转速为10000rpm和温度为4℃下离心10min，取上清液II，即得到免疫球蛋白。取上清液II于2ml塑料离心管中，于-20℃冷冻保存待测。每个样品设三次重复。

(二)检测

购买针对所要检测的免疫球蛋白专一的酶联免疫吸附试剂盒，严格按试剂盒说明书操作。

所用试剂盒是上海越研生物科技有限公司生产的马免疫球蛋白IgA酶联免疫吸附试剂盒。试剂盒的主要参数为：

(1)测定范围：5μg/ml-100μg/ml；

(2)灵敏度：＜2.5μg/ml；

(3)平均回收率：96-101％；

(4)变异系数：批内＜6％；

(5)特异性：IgA与IgM、IgG和IgE交叉反应均＜0.01％。

该试剂盒中含有如下试剂：包被原为纯化的马IgA抗体、标准品为马IgA、酶标二抗为HRP标记的IgA抗体、洗涤液(50mM Tris，0.14M NaCl，0.05％Tween-20，pH8.0)和终止液(0.18M H₂SO₄)和样品稀释液(50mM Tris，0.14M NaCl，1％BSA，0.05％Tween-20)。

酶标板由试剂盒自带。

具体检测步骤如下：

1、标准品的稀释与加样

在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为90μg/ml、60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml和7.5μg/ml)。

2、加样

分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液(50mM Tris，0.14M NaCl，1％BSA，0.05％Tween-20)40μl，然后再加待测样品(即上述步骤(一)提取得到的实验组和对照组免疫球蛋白样品)10μl(样品最终稀释度为5倍)。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3、温育

用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4、配液

将30倍浓缩洗涤液(50mM Tris，0.14M NaCl，0.05％Tween-20，pH 8.0)用蒸馏水30倍稀释后备用。

5、洗涤

小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6、加酶

每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7、温育

操作同步骤3。

8、洗涤

操作同步骤5。

9、显色

每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

10、终止

每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立即变成黄色)。

11、测定

用空白孔调零，450nm波长依序检测各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

根据标准品孔的加样浓度值(μg/ml)及各孔测得的OD值(表3)，制作标准曲线(图4)，根据标准曲线方程y＝-0.45186+0.11139X-0.00079X²(R²＝0.97963)，得到样品孔中IgA的浓度(μg/ml)，再根据公式：每克粪便中IgA的量(μg/g)＝样品孔中IgA的浓度(μg/ml)*5*10ml/粪样重(g)，换算得到每克粪便中IgA的量(μg/g)。

表3  标准品孔的IgA加样浓度值及孔的OD值

  IgA浓度(μg/m1)  OD值  7.5  0.4160  15  0.8065  30  2.4315  60  3.2475  90  3.1985

结果如下：

步骤(一)提取得到的实验组和对照组免疫球蛋白的浓度见表4和图1。结果取所有雌性普氏野马免疫球蛋白提取产物中免疫球蛋白量的平均值，取所有雄性普氏野马免疫球蛋白提取产物中免疫球蛋白量的平均值。

表4实验组和对照组普氏野马每克粪便中IgA的提取量

从图1中A可见，实验组所用的提取缓冲液中Tween-20浓度为0.05％时，免疫球蛋白IgA提取量最高，显著高于其它Tween-20浓度的提取缓冲液和对照组提取缓冲液的提取量。将0至0.1％Tween-20浓度梯度段进行加密，从图1中B可见，提取缓冲液中Tween-20浓度在0.03％-0.07％(v/v)范围内，IgA的提取量较高。因此，确定提取缓冲液中Tween-20的最适浓度范围是0.03％-0.07％(v/v)。各组中雌性普氏野马免疫球蛋白浓度和雄性普氏野马免疫球蛋白浓度均没有显著差异。

二、鱼精蛋白对普氏野马粪便中免疫球蛋白提取量的影响

(一)非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白

1、采集粪样

与步骤一的采集粪样方法相同。

2、配制提取缓冲液

(1)配制PBS缓冲溶液

与步骤一的配制方法相同。

(2)配制提取缓冲液

每1000ml上述PBS缓冲溶液中添加0.5mL Tween-20，轻轻振荡混匀后，配制得到提取缓冲液。该提取缓冲液中Tween-20浓度为0.05％(v/v)。

3、配制鱼精蛋白溶液

称取0.8g鱼精蛋白粉末溶于10ml超纯水中，配制的得到鱼精蛋白水溶液。

4、提取普氏野马免疫球蛋白

提取方法与实验一中所述基本相同，不同的是：(1)在离心前加入鱼精蛋白水溶液，(2)提取缓冲液组成，具体如下：

(1)加入上述步骤3配制的鱼精蛋白水溶液

鱼精蛋白水溶液的加入量为：第一步离心前加100ul，第二步离心前加10ul。实验分为以下4组：第1组，即对照组，两步离心前都不加鱼精蛋白水溶液；第2组，第二步离心前向上清液中加入鱼精蛋白水溶液；第3组，两步离心前都加入鱼精蛋白水溶液，即第一步离心前向混合物中加入鱼精蛋白水溶液和第二步离心前向上清液中加入鱼精蛋白水溶液；第4组，第一步离心前向混合物中加入鱼精蛋白水溶液。

(2)提取缓冲液为步骤2中配制好的Tween-20浓度为0.05％(v/v)的提取缓冲液。

每个样品设三次重复。

(二)检测

与实验一的检测方法相同。

结果如下：

步骤(一)提取得到的4组免疫球蛋白的浓度见图2，图2中1、2、3和4分别代表第1组、第2组、第3组和第4组提取的雌性普氏野马免疫球蛋白和雄性普氏野马免疫球蛋白。

从图2可见，第1组(即对照组)、第2组和第4组提取得到的免疫球蛋白浓度没有显著差异，而第3组(两步离心前都加入鱼精蛋白水溶液)得到的免疫球蛋白浓度显著低于其它三组。此结果表明，在粪便免疫球蛋白的提取过程加入鱼精蛋白并不能增加免疫球蛋白的提取量。各组中雌性普氏野马免疫球蛋白浓度和雄性普氏野马免疫球蛋白浓度均没有显著差异。

三、不同离心方式对粪便IgA提取量的影响

(一)非损伤性提取普氏野马免疫球蛋白

1、采集粪样

与实验一的采集粪样方法相同。

2、配制提取缓冲液

(1)配制PBS缓冲溶液

与实验一的配制方法相同。

(2)配制提取缓冲液

与实验二的配制方法相同，得到Tween-20浓度为0.05％(v/v)的提取缓冲液。

3、提取普氏野马免疫球蛋白

提取方法与实验一中的提取方法基本相同，不同的是离心方式不同，具体如下：

(1)只提取步骤1中采集的雌性普氏野马免疫球蛋白。

(2)按照第二步离心的离心方式不同，分为两组：第一组：第二步离心为普通高速离心，使用湘仪TG16-WS台式高速离心机，在离心温度为室温(25℃)，转速为10000rpm的条件下，离心10min；第二组：第二步离心为高速冷冻离心，使用Heal ForceNeofuge 15R台式高速冷冻离心机，在离心温度为4℃，转速为10000rpm的条件下，离心10min。

每种离心方式设五次重复，结果取平均值。

(二)检测

与实验一的检测方法相同。

结果如下：

步骤(一)提取得到的两组免疫球蛋白的浓度见图3，图3中A代表第一组普通高速离心提取的雌性普氏野马免疫球蛋白；B代表第二组高速冷冻离心提取的雌性普氏野马免疫球蛋白。

从图3可见，第一组和第二组提取得到的免疫球蛋白浓度没有显著差异。此结果表明，第二步离心中高速冷冻离心和普通高速离心对免疫球蛋白的提取效果的影响没有显著差异。因此，高速离心步骤可以使用普通高速离心机，与低温冷冻离心机相比，前者具有价格便宜、体积小、操作方便的优势，并且迷你便携式高速离心机也很普遍，更方便实验操作。