温敏性核壳型囊泡控释药物载体、其制备方法及应用

摘要

本发明提供一种温敏型核壳结构囊泡释药载体，由内核脂质体和外层温敏高分子复合凝胶构成。核壳构型不但可以增加囊泡的稳定性，其内核的脂质体和外层的温敏性生物高分子凝胶都可以作为药物载体载药。随着温度的上升，外层的凝胶会发生相变化而皱缩，外层凝胶包裹的药物通过温控可以快速释放出来，而内核脂质体的包容物因为外层凝胶的存在则可以进行缓慢释放，从而达到多维释放的效果。本发明的释药载体具有良好的生物相容性和快速温度响应性，可以用于化妆品领域，也可作为埋植药物的载体，应用于开放型手术植入，微创手术注射或借助内窥镜植入。

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及核壳结构型控释药物载体，更具体涉及囊泡表面高分子修饰的制备方法及作为药物载体的应用。

背景技术

表面活性剂具有两亲性的分子结构，常用于增强界面活性、降低界面张力，或自组装形成各种形状的胶束、液晶，在决定界面的流变学特性以及两相物质传递方面起着十分重要的作用，在美容化妆品、医药品以及各种乳化分散技术中有重要的应用价值。

天然生物表面活性剂是一类具有表面活性的天然化合物，它除了具有与一般化学表面活性剂相同的作用外，还以其安全、无毒、良好的生物可降解性和相容性，良好的热及化学稳定性等优点，在生物医药、环保及石油工业等领域倍受重视。生物表面活性剂的亲水基团可以是离子或非离子形式的单糖、二糖、多糖、羧基、氨基或肽链；疏水基团则由饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸或带羟基的脂肪酸组成。其种类很多，依据它们的化学组成和微生物来源可分为磷脂、糖脂、脂肽和脂蛋白等。其中，磷脂、糖脂是生命组织细胞膜骨架的重要组成，也是近年来的研究热点之一。

两亲性的磷脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的封闭囊泡，称为脂质体。自从1965年英国科学家Bangham发现脂质体以来，由于其结构类似生物膜，作为药物载体使用时，囊泡中心的亲水区可包封水溶性药物而囊泡的疏水基团的夹层中可包封脂溶性药物，并且可以提高药物稳定性及靶向性，降低药物毒性，延缓释放，因此得到广泛而深入的研究。但是，脂质体囊泡仍然存在着文献D.R.Khan，E.M.Rezler，J.L.-Fields and G.B.Fields：Chem.Biol.Drug Des.71(2008)，3和S.Sriwongsitanont and M.Ueno：Colloid Polym.Sci.282(2004)，753报道的易聚集、沉降，结构稳定性差等问题，以及文献S.K.E.Messerschmidt，A.Musyanovych，M.Altvater，P.Scheurich，K.Pfizenmaier，K.Landfester and R.E.Kontermann：J.Controlled Release 137(2009)，69、文献S.Sriwongsitanont and M.Ueno：Chem.Pharm.Bull.50(9)(2002)，1238和S.Sriwongsitanont and M.Ueno：Colloid Polym.Sci.282(2004)，753报道的易被网状内皮系统摄取，体内循环周期短等的缺陷，因此，需要进一步对脂质体囊泡结构进行修饰和加工。目前，虽然有人通过对脂质体囊泡的修饰来增加其体内循环时间和结构的稳定性，但是没有制备成核壳结构的，且效果都不够理想。

本发明者以脂质体囊泡为核心，依靠化学键、静电力等作用使生物大分子和温敏高分子在囊泡外表形成“复合凝胶外壳”，以增加囊泡的稳定性并达到多重释放药物的效果，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种温敏型核壳结构控释药物载体。

本发明提供的温敏型核壳结构控释药物载体由内核囊泡和外层高分子复合凝胶构成。

本发明的药物载体中内核采用的囊泡为生物表面活性剂构成的脂质体囊泡，外层为天然生物大分子构成的温敏性高分子凝胶。

构成内核脂质体囊泡的生物表面活性剂可选自磷脂和糖脂，优选磷脂。

本发明的药物载体外层中的天然生物大分子为酸性多糖生物可降解材料，例如，透明质酸(HA)、软骨素、壳聚糖等，优选HA；温敏高分子可采用生物相容性和温度敏感性聚合物，较佳为聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)。

本发明药物载体中的内核脂质体囊泡和多糖生物可降解材料间通过化学键进行链接。

在一个优选实施方式中，本发明选择透明质酸(HA)生物可降解材料，将透明质酸(HA)与甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)连接成HA-GMA，该链上的GMA分子内含有碳碳双键，可进行自由基反应，具有很高的反应灵活性，可与内核脂质体囊泡发生自由基反应，而形成外层高分子复合凝胶。

在一个优选实施方式中，外层高分子复合凝胶中的温敏高分子是聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，由N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)在交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)存在下交联反应而形成，并且与酸性多糖分子链发生交联反应，所形成的网络状复合凝胶结构能够固定并包裹在脂质体的外侧。

本发明提供的药物载体的制备方法包括以下步骤：

1)将生物表面活性剂溶于有机溶剂中，真空下旋转容器蒸发溶剂至干，脂质膜均匀沉积在瓶壁上，真空干燥，于30-60℃水浴超声预热10-30min后加入磷酸缓冲溶液水化脂质膜；

2)将酸性多糖溶于超纯水中，加入等体积三乙胺和四丁基溴化铵，反应10-20h后进行冷冻干燥，加水，透析5-10天，然后与1)获得的脂质体溶液超声混合10-60min；

3)在2)所得分散液中加入交联剂1重量份和温敏高分子单体15重量份，于氮气保护下滴加催化剂溶液，50-80℃反应2-5小时。

本发明方法中所用的有机溶剂可选自无水氯仿，二氯甲烷和乙醇。

所述温敏高分子单体优选NIPAM，所述交联剂优选MBA。

本发明方法中，步骤1)可将第一种药物与生物表面活性剂同时溶于有机溶剂中，得到包裹第一种药物的脂质体。

本发明方法还可包括步骤4)：将步骤3)的产物冻干，浸入溶解了第二种药物的水溶液中，20-40℃保持10-20min后，静置半天，得到包封第二种药物的载体。

根据需要，本发明的药物载体可仅在脂质体囊泡中包裹第一种药物，未包封的药物通过葡聚糖微型凝胶柱分离除去；本发明的药物载体也可仅在外层温敏高分子复合凝胶包封第二种药物，这第二种药物通过温敏凝胶外层的相变化被吸附渗入到凝胶层内部，静置后达到饱和吸附，未包封的药物通过葡聚糖微型凝胶柱分离；更优选的是，在脂质体囊泡中包裹第一种药物，在外层温敏高分子复合凝胶中包封第二种药物，使第二种药物先释放，然后再释放第一种药物。

在一个优选方案中，本发明的药物载体制备方法包括以下步骤：

1)薄膜超声水化法制备纳米脂质体

将生物表面活性剂或生物表面活性剂及憎水性药物溶于有机溶剂；30-60℃的恒温水浴中旋转蒸发除去有机溶剂，脂质沉积瓶壁后继续抽干。解除真空后，从干燥箱中取出瓶，在瓶中注满氮气，放入30-60度的水浴超声中预热10-30min，在瓶中加入缓冲溶液水化脂质，最后，通过葡聚糖微型凝胶柱分离未包封的药物。

2)合成HA-GMA复合物

取HA(透明质酸)溶于水中，样品的浓度是1-4mg/mL，加入等量的三乙胺，GMA(甲基丙烯酸缩水甘油酯)，四丁基溴化铵，反应10-20h后，在40-60℃下孵化2-5h。反应后的样品冷冻干燥1-5天，分散至水中，放入透析袋透析5-10天。

3)酸性多糖的包覆

取2)透析后的样品HA-GMA加入水中稀释，在HA-GMA中逐滴加入囊泡溶液，并且超声30-60min，此时溶液称为GHA-lip。

4)壳层合成HA-PNIPAM凝胶

GHA-lip中加入MBA(N，N-亚甲基双丙烯酰胺)，NIPAM(N-异丙基丙烯酰胺)配成溶液，另再将APS(过硫酸铵)溶于水后加入常压漏斗里，抽真空通氮气保护，缓慢滴加到溶液里，滴加完毕，50-80℃下反应2-5小时。

5)核壳微粒的外层载药

亲水性药物代表荧光素二钠：将4)所得微粒冻干处理，称量荧光素二钠放入到溶解了脂质体的磷酸缓冲溶液(pH7.4)中。样品升温(20-40℃)保持10-20min后冷却到室温(25℃)，荧光素二钠通过温敏凝胶外层的相变化被吸附渗入到凝胶层内部，静置半天以使凝胶达到饱和吸附，最后通过葡聚糖微型凝胶柱分离未包封的药物。

本发明以脂质体囊泡为核心，依靠化学键、静电力等的作用，使生物大分子在囊泡外表吸附形成“凝胶外壳”，从而提供一种温敏型核壳结构脂质体控释药物载体。该核壳构型不但可以增加囊泡的稳定性，达到高包封率，同时具有温敏凝胶的快速响应性。本发明选用具有良好的生物相容性的酸性多糖和具有温敏性的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，制备温敏性混合凝胶，这样使得凝胶的壳层不仅保持酸性多糖的良好生物相容性的优异性，还具有聚N-异丙基丙烯酰胺PNIPAM的快速温度响应，并且凝胶外壳的机械强度也得到了很大的提高。

本发明首次在脂质体外侧修饰温敏性凝胶层，制备了具有温敏特性的核壳微凝胶，该微粒内核的双层脂质体囊泡和外层的温敏性生物高分子凝胶都可以作为药物载体载药，随着温度的上升，外层的凝胶会发生相变化而皱缩，外层凝胶包裹药物通过调温可以快速释放出来，而内层脂质体的包容物因为外层凝胶的存在则可以进行缓慢释放，从而达到多维释放的效果。

本发明的温敏型核壳结构脂质体控释药物载体具有良好的生物相容性和快速温度响应性，在室温为可注射型制剂，发生相变化后沉淀附着于固体表面，可达到定向释放的目的。本发明的产品可以用于化妆品领域，也可作为埋植药物的载体，应用于开放型手术植入，微创手术注射或借助内窥镜植入。

附图说明

图1是壳层凝胶化的脂质体颗粒用原子力显微镜观察到的形貌图，扫描范围是5×5μm。

图2是壳层凝胶化的脂质体颗粒用透过显微镜观察到的结构。

图3、图4分别是不同分子量HA制成核壳结构颗粒后粒径和透过度随温度的变化。HA分子量：■：3604g mol^-1；●：1.1×10⁴g mol^-1；▲：3.0×10⁵g mol^-1；8.0×10⁵gmol^-1

图5和图6分别是外层及内层药物释放效应比较。图中曲线为37℃下释放情况，药物浓度在荧光分光光度计上进行检测。

具体实施方式

以下用实施例对本发明作更详细的描述。这些实施例仅仅是对本发明最佳实施方式的描述，并不对本发明的范围有任何限制。

实施例1

1.取透明质酸溶于超纯水中，浓度为2mg/mL，加入重量比为1∶1∶1的三乙胺，四丁基溴化铵和GMA(甲基丙烯酸缩水甘油酯)，室温反应10h后，在40℃下孵化2h，然后冷冻干燥2天，透析5天。

2.将磷脂溶液中加入1mg罗丹明6G，溶液移入圆底烧瓶中，蒸发溶剂，室温下真空干燥2-4h，制备含有罗丹明6G的磷脂膜。解除真空后，放入50度的水浴中预热20min；加缓冲液水化后制备出包裹罗丹明6G的脂质体，使其通过葡聚糖微型凝胶柱分离未包封的部分，可获得包裹了罗丹明6G的脂质体。

3.将步骤1所得的反应液加入超纯水稀释，逐滴加入步骤2所得脂质体的溶液，超声30min。

4.将步骤3所得的反应液加入1重量份MBA(N，N-亚甲基双丙烯酰胺)，10份NIPAM(N-异丙基丙烯酰胺)，再将1重量份APS(过硫酸铵)，溶于水里面放入常压漏斗里，抽真空通氮气保护，缓慢滴加10mL的APS到溶液里，滴加完毕，50℃下反应5小时。

5.将步骤4所得温敏性颗粒冻干处理，取荧光素二钠(固体)放入到溶解了固体温敏脂质体的磷酸缓冲溶液中，荧光素二钠的最终浓度是0.027mg/ml。荧光素二钠通过温敏凝胶外层的相变化被吸附渗入到凝胶层内部，使凝胶达到饱和吸附，使其通过葡聚糖微型凝胶柱分离未包封的部分。

6.颗粒中模拟药物的释放

外层：取洗脱液0.5mL放入透析带中，再将透析带放入装有30mL pH7.4的磷酸缓冲液中，恒温37℃，每隔20min外围重新换上已预热的空白缓冲液，并测试缓冲液的荧光强度值。

内层：继续透析，每隔2-3h外围重新换上已预热的空白缓冲液，并测试缓冲液的荧光强度值。

实施例2

1.取软骨素溶于超纯水中，浓度为4mg/mL，加入0.6mL三乙胺，0.6g四丁基溴化铵和0.6mLGMA，室温反应20小时后，在60℃下孵化2h，然后冷冻干燥5天，透析8天。

2.将磷脂溶液中加入0.5mg罗丹明6G，冷冻干燥制备含有罗丹明6G的脂膜。加缓冲液水化后制备出包裹罗丹明6G的脂质体，使其通过葡聚糖微型凝胶柱分离未包封的部分，获得包裹了罗丹明6G的脂质体。

3.将步骤1所得的反应液加入超纯水稀释，逐滴加入步骤2所得脂质体的溶液，超声30min。

4.将步骤3所得的反应液加入1份MBA(N，N-亚甲基双丙烯酰胺)，10份NIPAM(N-异丙基丙烯酰胺)，再将1重量份APS(过硫酸铵)溶于水里面放入常压漏斗里，抽真空通氮气保护，缓慢滴加APS到溶液里，滴加完毕，70℃下反应3小时。

5.将步骤4所得温敏性颗粒冻干处理，称量适量的荧光素二钠(固体)放入到溶解了固体温敏脂质体的磷酸缓冲溶液中。荧光素二钠通过温敏凝胶外层的相变化被吸附渗入到凝胶层内部，使凝胶达到饱和吸附。使其通过葡聚糖微型凝胶柱分离未包封的部分。

研究结果显示：温敏性核壳结构微粒用动态光散射DLS和紫外光度计UV考察其温敏性，最低临界溶解温度都接近34℃，外层的凝胶层包裹一种亲水性的模拟药物荧光素二钠，包封率72.96％，累积释放时间1h，累积释放率81.16％；内核脂质体包裹一种疏水性的模拟药物罗丹明6G，由于外层凝胶的交联覆盖作用，内部包裹的模拟药物会达到缓慢释放的效果，其包封率52.64％，累积释放时间40h，累积释放率82.28％。两种不同释药方式，不同药物的释放时间差从而达到二维释放。