基于B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因的DNA疫苗及其用途

摘要

本发明属于免疫学和分子生物学领域，涉及一种基于B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因的DNA疫苗及其用途。具体地，所述DNA疫苗含有一种重组表达载体，所述重组表达载体含有与选自pcDNA3.1Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表达载体有效连接的B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因。本发明还涉及一种B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因、该外毒素融合基因编码的外毒素融合蛋白、含有该外毒素融合基因的重组表达载体、以及含有所述重组表达载体的组合物。本发明的DNA疫苗具有良好的治疗或预防同种异体组织/器官移植排斥反应诸如移植物抗宿主病的效果。

说明书

技术领域

本发明属于免疫学和分子生物学领域，涉及一种基于B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因的DNA疫苗及其用途。本发明还涉及一种B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因、该外毒素融合基因编码的外毒素融合蛋白、含有该外毒素融合基因的重组表达载体、以及含有所述重组表达载体的组合物。

背景技术

异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)和实体器官移植已广泛应用于恶性血液病、某些遗传性疾病、急性重度放射病、各种实体器官功能衰竭以及脏器恶性肿瘤等多种疾病的治疗上。由于供-受者间组织相容性抗原(MHC)的差异，当然还有其它诸多已知与未知因素如次要组织相容性抗原(mHA)、组织特异性抗原以及非免疫学因素等等，不可避免的要发生宿主抗移植物(HVGD)和移植抗宿主病(GVHD或GVHR)，这是导致同种异体组织器官移植失败与移植物慢性失功(GCD)的最重要、最根本的原因之一。随着急需器官移植患者人数的不断增加，供体缺乏的矛盾显得日加突出。无论是在现在还是将来，以不完全相合或者半相合移植的病例都将成为造血干细胞移植和器官移植的主流和方向。传统的防治方法是以破坏移植受体的全部免疫机能以至于丧失移植物抗白血病(GVL)、抗感染等作用为代价的，诸如使用大剂量多种免疫抑制剂或者去除移植物中全部T细胞。毫无疑问，解决GVHD和HVGD发生发展的根本出路或新的策略则在于能否有效地干预或抑制T细胞活化的始动环节，诱导特异性的免疫耐受，从而从根本上遏制“细胞因子风暴”的发生与发展。因此，一种理想高效的allo-HSCT和器官移植治疗还应同时包含修正或改良T细胞对异基因抗原的初始反应的策略，而不是去除移植受体内或供体移植物中所有的T细胞。也就是说，诱导对受体或供体的特异性免疫耐受仅是靶向性消除或抑制受体或供体T细胞对同种异基因抗原反应的能力，但仍保留该T细胞对其它抗原反应的正常功能。

业已证实，供、受体的T细胞在造血干细胞移植或器官移植中起着双重作用，既能够有助于造血干细胞或器官的植活、控制条件性感染以及抗白血病效应；同时也是导致GVHD或HVGD的根本原因。这一系列的免疫反应是通过T细胞的识别、活化而完成的。T细胞活化需要两种信号：与T细胞受体结合信号和CD28共刺激信号。第一信号受第二信号调控，导致T细胞活化、部分活化或无反应。因此，通过阻断T细胞受体信号或CD28介导的共刺激信号抑制T细胞活化是防治HVGD和aGVHD的重要策略。目前国际上主要采用CTLA4-Ig或B7抗体诱导特异性免疫耐受，达到防治HVGD和aGVHD的目的，并且已在大量体内、外动物实验的结果中得到证明。但其缺憾在于，所诱导的免疫耐受期限较短，且诱导无能的T细胞可经旁路重新激活，从而导致治疗失败；并且阻断所采用的单抗多为鼠源性，其产生的免疫原性会影响疗效。

因此，提供一种具有良好的免疫耐受与治疗性的治疗或预防同种异体组织/器官移植排斥反应诸如移植物抗宿主病的DNA疫苗是本领域技术人员急需解决的。

发明内容

本发明人经过大量的试验和创造性的劳动，发现了一种B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因，并且惊奇地发现，转染入真核细胞的重组表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL经转录、翻译和翻译后修饰被分泌到胞外，pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL可在真核细胞中高效表达并且表达产物具有很好的靶向免疫抑制活性；发明人还发现，pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因的DNA疫苗可以有效地预防和治疗(例如小鼠)移植物抗宿主病。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

B7-1-PE40KDEL测定序列及开放阅读框分析如下：

SEQ ID NO：1的碱基序列：(1850个碱基)

CGTTTAACTT AAGCTTGGTA CCTGAGA CAGACACACT CCTGCTATGG GTACTGCTGC    60

TCTGGGTTCC AGGTTCCACT GGTGACGTTA TCCACGTGAC CAAGGAAGTG AAAGAAGTAG    120

CAACGCTGTC CTGTGGTCAC AATGTTTCTG TTGAAGAGCC GGCACAAACT CGCATCTACT    180

GGCAAAAGGA GAAGAAAATG GTGCTGACTA TGATGTCTGG GGACATGAAT ATATGGCCCG    240

AGTACAAGAA CCGGACCATC TTTGATATTA CTAATAACCT CTCCATTGTG ATCCTGGCTC    300

TGCGCCCATC TGACGAGGGC ACATACGAGT GTGTTGTTCT GAAGTATGAA AAAGACGCTT    360

TCAAGCGGGA ACACCTGGCT GAAGTGACGT TATCAGTCAA AGCTGACTTC CCTACACCTA    420

GTATATCTGA CTTTGAAATT CCAACTTCTA ATATTAGAAG GATAATTTGC TCAACCTCTG    480

GAGGTTTTCC AGAGCCTCAC CTCTCCTGGT TGGAAAATGG AGAAGAATTA AGTGCCATCA    540

ACACAACAGT TTCCCAAGAT CCTGAAACTG AGCTCTATGC TGTTAGCAGC AAACTGGATT    600

TCAATATGAC AACCAACCAC AGCTTCATGT GTCTCATCAA GTATGGACAT TTAAGAGTGA    660

ATCAGACCTT CAACTGGAAT ACAACCAAGC AAGAGCATTT TCCTGATAAC GGTGGCGGCG    720

GATCTGGAGG CGGTGGAAGC GGTGGTGGCT CGGGCGGTGG TGGGTCGGGC GGCAGCCTGG    780

CCGCGCTGAC CGCGCACCAG GCTTGCCACC TGCCGCTGGA GACTTCCACC CGTCATCGCC    840

AGCCGCGCGG CTGGGAACAA CTGGAGCAGT GCGGCTATCC GGTGCAGCGG CTGGTCGCCC    900

TCTACCTGGC GGCGCGGCTG TCGTGGAACC AGGTCGACCA GGTGATCCGC AACGCCCTGG    960

CCAGCCCCGG CAGCGGCGGC GACCTGGGCG AAGCGATCCG CGAGCAGCCG GAGCAGGCCC   1020

GTCTTGCCCT GACCCTGGCC GCCGCCGAGA GCGAGCGCTT CGTCCGGCAG GGCACCGGCA   1080

ACGACGAGGC CGGCGCGGCC AACGCCGACG TGGTGAGCCT GACCTGCCCG GTCGCCGCCG   1140

GTGAATGCGC GGGCCCGGCG GACAGCGGCG ACGCCCTGCT GGAGCGCAAC TATCCCACTG   1200

GCGCGGAGTT CCTCGGCGAC GGCGGCGACG TCAGCTTCAG CACCCGCGGC ACGCAGAACT   1260

GGACGGTGGA GCGGCTGCTC CAGGCGCACC GCCAACTGGA GGAGCGCGGC TATGTGTTCG   1320

TCGGCTACCA CGGCACCTTC CTCGAAGCGT CGCAAAGCAT CGTCTTCGGC GGGGTGCGCG   1380

CGCGCAACCA GGACCTCGAC GCGATCTGGC GCGGTTTCTA TATCGCCGGC GATCCGGCGC   1440

TGGCCTACGG CTACGCCCAG GACCAGGAAC CCGACGCACG CGGCCGGATC CGCAACGGTG   1500

CCCTGCTGCG GGTCTATGTG CCGCGCTCGA GCCTGCCGGG CTTCTACCGC ACCAGCCTGA   1560

CCCTGGCCGC GCCGGAGGCG GCGGGCGAGG TCGAACGGCT GATCGGCCAT CCGCTGCCGC   1620

TGCGCCTGGA CGCCATCACC GGCCCCGAGG AGGAAGGCGG GCGCCTGGAG ACCATTCTCG   1680

GCTGGCCGCT GGCCGAGCGC ACCGTGGTGA TTCCCTCGGC GATCCCCACC GACCCGCGCA   1740

ACATCGGCGG CGACCTCGAC CCGTCCAGCA TCCCCGACAA GGAACAGGCG ATCAGCGCCC   1800

TGCCGGACTA CGCCAGCCAG CCCGGCAAAC CGCCGAAGGA CGAGCTG1850

上述序列中，带下划线的部分为KpnI酶切位点，加框部分为起始密码子和终止密码子。上述序列SEQ ID NO：1中的开放阅读框为SEQ ID NO：2(1827个碱基)。

本发明的另一方面涉及外毒素融合基因(SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2)所编码的外毒素融合蛋白(SEQ ID NO：3)。

SEQ ID NO：3的氨基酸序列如下：(608个氨基酸，带下划线的部分为信号肽序列)

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Asp Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val

20                  25                  30

Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Pro Ala Gln

35                  40                  45

Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met

50                  55                  60

Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe

65                  70                  75                  80

Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser

85                  90                  95

Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala

100                 105                 110

Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp

115                 120                 125

Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile

130                 135                 140

Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu

145                 150                 155                 160

Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Ser Ala Ile Asn Thr Thr Val

165                 170                 175

Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp

180                 185                 190

Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly

195                 200                 205

His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu

210                 215                 220

His Phe Pro Asp Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225                 230                 235                 240

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr

245                 250                 255

Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Ser Thr Arg His Arg

260                 265                 270

Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln

275                 280                 285

Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val

290                 295                 300

Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp

305                 310                 315                 320

Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu

325                 330                 335

Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly

340                 345                 350

Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys

355                 360                 365

Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala

370                 375                 380

Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly

385                 390                 395                 400

Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu

405                 410                 415

Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe

420                 425                 430

Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe

435                 440                 445

Gly Gly Val Arg Ala Arg Asn Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly

450                 455                 460

Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp

465                 470                 475                 480

Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg

485                 490                 495

Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu

500                 505                 510

Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly

515                 520                 525

His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu

530                 535                 540

Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr

545                 550                 555                 560

Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Ile Gly Gly

565                 570                 575

Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala

580                 585                 590

Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

595                 600                 605

本发明的还一方面涉及一种重组表达载体，其含有与选自pcDNA3.1 Zeo(+)、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL和腺病毒的真核表达载体有效连接的B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因。

在本发明的一个实施方案中，所述的重组表达载体，其由B7-1-PE40KDEL基因与pcDNA3.1/Zeo(+)载体组成。

本发明的还一方面涉及一种组合物，其含有本发明的任一项重组表达载体。

本发明的还一方面涉及一种治疗或预防移植物抗宿主病的DNA疫苗，其包含本发明的任一项重组表达载体。

在本发明的一个实施方案中，所述的DNA疫苗，其还包含医药学上可接受的免疫佐剂。

在本发明的一个实施方案中，所述的DNA疫苗，其用于以注射、粘膜、基因枪导入等方式实施免疫；具体的，其用于以至少一种选自静脉注射、动脉注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射、胸腔注射和腹腔内注射的方式实施免疫。

在本发明的一个实施方案中，所述的DNA疫苗，其为可经由注射或可经由粘膜施用的水溶液剂或复溶用冻干粉针剂。

本发明的又一方面，提供一种制备DNA疫苗的方法，其包括将包含SEQ ID NO：1或2所示核苷酸序列的B7-1-PE40外毒素融合基因与pcDNA3.1/Zeo(+)载体有效连接的步骤。

根据本发明所述制备DNA疫苗的方法，其包括以下步骤：

1)分别设计含有信号肽及KpnI酶切位点的上游引物P1，及含有确XbaI酶切位点的下游引物P2，其中所述引物的序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；

2)以原核表达载体pGEMT-B7-1-PE40KDEL质粒为模板，采用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增；

3)将PCR扩增产物回收，并用KpnI+XbaI双酶切上述回收产物及pcDNA3.1/Zeo(+)载体，电泳后回收酶切产物；

4)回收酶切产物；

5)将双酶切后的PCR产物与pcDNA3.1/Zeo(+)载体连接；

6)挑取具有Amp抗性的阳性菌落，提取质粒，双酶切鉴定，菌株冻存；和

7)培养菌株，提取并纯化DNA疫苗治疗用质粒，以及任选地，

8)将所获得的质粒与医药学上可接受的免疫佐剂混合。

本发明的还一方面涉及本发明的外毒素融合基因或者本发明的重组表达载体在制备治疗或预防移植物抗宿主病的DNA疫苗中的用途。

本发明的还一个方面涉及一种治疗或预防移植物抗宿主病的方法，包括向受试者施用治疗或预防有效量的本发明的DNA疫苗的步骤。

可以将一天的剂量在一天中一次性全部给与受试者，也可以在一天内将需要的剂量分成两个、三个、四个或更多个小剂量以合适的间隔施用。所述小剂量可以配制成单元剂量形式，例如每个单元剂量形式含有日总剂量细分适宜次数的相应量。当然，也可以以一定的时间周期施用，例如一天施用一次、两天施用一次、一周施用一次、一月施用一次、二月施用一次、三月施用一次、六月施用一次、一年施用一次、两年施用一次等。

附图说明

图1：真核表达载体pcDNA3.1/B 7-1-PE40KDEL构建示意图，其中S表示信号肽序列。

图2：琼脂糖电泳分析B7-1-PE40KDEL PCR扩增结果。泳道1，DNAmarker(DNA标志物)；泳道2，B7-1-PE40KDEL PCR扩增产物。

图3：琼脂糖电泳分析Kpn I+Xba I双酶切重组质粒pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL结果。泳道1，DNA marker；泳道2，Xba I单酶切重组质粒；泳道3，Kpn I+Xba I双酶切重组质粒。

图4：转染CHO-K1-RPE.40细胞后RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析。泳道1，DNA标志物；泳道2，转染pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL的CHO-K1-RPE.40细胞B7-1-PE40KDEL扩增结果；泳道3，β-actin的PCR扩增产物；泳道4，转染pcDNA3.1空载体的CHO-K1-RPE.40细胞B7-1-PE40KDEL扩增结果；泳道5，未经转染的CHO-K1-RPE.40细胞B7-1-PE40KDEL扩增结果。

图5：Western Blot检测B7-1-PE40KDEL融合蛋白在真核细胞中的分泌。泳道1，转染pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL；泳道2，pcDNA3.1/Zeo(+)空载体。

图6：经Zeo筛选后获得稳定转染CHO-K1-RPE.40细胞株表达PEA的相对于定量结果。图A，实时聚合酶链反应定量分析；图B，扩增曲线；图C，溶解曲线。

图7：PEA浓度检测的标准曲线。

图8：真核表达产物B7-1-PE40KDEL的选择性细胞抑制活性比较。

图9：琼脂糖电泳分析pcDNA 3.1/B7-1-PE40KDEL质粒肌肉注射后在血液中的表达情况。

图10：PE40KDELmRNA在血液中的相对定量表达。

图11：采用流式细胞仪分析外周血CD3+CD28+T细胞的部分代表图。

图12：融合毒素基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL肌注后体内CD28+T细胞清除状况。

图13：血清中PEA抗体浓度检测的标准曲线。

图14：受鼠出现典型GVHD体征，图为典型的弓背(A)和脱毛(B)表型。

图15：移植后各组小鼠体重变化。A：aGVHD模型组；B：骨髓移植组；C：脾细胞移植组；D：单纯照射组。

图16：移植后嵌合体检测：Y染色体sry基因PCR扩增产物电泳图。泳道1，DNA标志物；泳道2，aGVHD模型组sry基因扩增；泳道3，骨髓移植组sry基因扩增；泳道4，脾细胞移植组sry基因扩增；泳道5，单纯照射组sry基因扩增。

图17：aGVHD受鼠病理组织学切片(HE染色×100)。A：小肠；B：肝脏；C：脾脏；D：皮肤。

图18：移植后各组GVHD小鼠的生存率。

图19：移植后各组GVHD小鼠的体重变化。

图20：移植后各组aGVHD小鼠WBC的变化。

图21：外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各组aGVHD小鼠小肠的组织病理学改变(HE染色，40×)。A组(B7-1)，B组(B7-2)，C组(B7-1+B7-2)，D组(空载体组)，E组(CsA+MTX)，F组(aGVHD未治疗组)。

图22：外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各组aGVHD小鼠皮肤的组织病理学改变(HE染色，40×)。A组(B7-1)，B组(B7-2)，C组(B7-1+B7-2)，D组(空载体组)，E组(CsA+MTX)，F组(aGVHD未治疗组)。

图23：外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B 7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各组aGVHD小鼠肝脏的组织病理学改变(HE染色，40×)。A组(B7-1)，B组(B7-2)，C组(B7-1+B7-2)，D组(空载体组)，E组(CsA+MTX)，F组(aGVHD未治疗组)。

图24：外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL防治各组aGVHD小鼠的生存曲线以及中位生存时间。

图25：移植后各组嵌合体检测：Y染色体sry基因PCR扩增产物电泳图。泳道1，DNA标志物；泳道2，pcDNA3.1/B7-1-PE40治疗组sry基因扩增；泳道3，pcDNA3.1/B7-2-PE40治疗组sry基因扩增；泳道4，B7-1+B7-2治疗组sry基因扩增；泳道5，pcDNA3.1输注组sry基因扩增；泳道6，CsA+MTX输注组sry基因扩增；泳道7，aGVHD模型组sry基因扩增。

图26：外毒素融合基因疫苗治疗对aGVHD小鼠外周血CD4⁺/CD8⁺细胞比例的影响。

图27：流式细胞术分析各组小鼠外周血中CD3⁺CD4⁺T以及CD3⁺CD8⁺T细胞比例的部分代表性图谱。

图28：外毒素融合基因疫苗治疗对aGVHD小鼠外周血CD4⁺CD25⁺Treg/CD4⁺T细胞比例的影响

图29：流式细胞术分析小鼠外周血中CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例的部分代表性图谱。

图30：外毒素融合基因疫苗治疗对aGVHD小鼠外周血CD8⁺CD28^-Ts细胞比例的影响。

图31：流式细胞术分析小鼠外周血中CD8⁺CD28^-Ts细胞比例部分代表性图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：真核表达载体pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL的构建

1.材料与方法

1.1质粒、细胞及主要试剂

pGEMT-B7-1-PE40KDEL(2003.3.3)原核表达载体由本室构建。表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)由我室保存。Zeocin^TM、Trizol、Lipofectamine^TM2000购自Invitrogen公司；DMEM/F12培养基购自Gibco公司。Jurkat细胞系、Raji细胞系为本室保存。CHO-K1-RPE.40细胞系由Moehring JM和Moehring TJ构建，由Sucic Joseph.博士惠赠。PEA多抗购自Sigma公司；CD80单抗购自R&D公司。PVDF膜，Amicon Ultra-4购自Millipore公司。ECL发光液购自Pierce公司。MTS(CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)、PureYieild^TM plasmid midiprep system购自Promega公司。反转录试剂盒、Premix Ex Taq^TM、Kpn I酶、XbaI酶及T4连接酶购自TaKaRa公司。TMB底物显色液、2×Pfu PCR MasterMix购自TIANGEN公司。QIAquick Gel Extraction Kit购自QIAGEN公司。

1.2主要仪器

9700PCR仪(PerkinElmer)，640紫外检测仪(Beckman)，Mini II型蛋白电泳仪及蛋白半干电转仪(Bio-Rad)，Gel-Pro3.1凝胶成像系统(Media Cybemetic)，550全自动酶标仪。实时荧光定量PCR仪(Stratagene，Mx3005P)。

1.3真核表达载体pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL的构建

分别设计含有信号肽及Kpn I酶切位点的上游引物P1，及含有XbaI酶切位点的下游引物P2。信号肽序列参照invitrogen公司的pSecTag 2-B载体的信号肽：Murine Ig k-chain V-J2-C singnalpeptide，分泌性较强。引物序列如下：

上游引物P1：

5’GGTACCTGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTG 3’(SEQ ID NO：4，其中，下划线部分为KpnI酶切位点，加框部分为起始密码子，斜体部分为信号肽编码序列)

下游引物P2：

P2：5’TCTAGATTACAGCTCGTCCTTCGGCGG 3’(SEQ ID NO：5，其中，下划线部分为Xba I酶切位点)

因加入信号肽后的P1序列过长，故用SOE-PCR方法将P1分成两段引物进行重叠扩增。

P1-A：

5’CTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGTTATCCACGTGACCAAGGAAGTG3’(SEQ ID NO：6)

P1-B：

5’GGTACCTATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCA 3’(SEQ ID NO：7)

以原核表达载体pGEMT-B7-1-PE40KDEL质粒为模板，采用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增体系如下：

2×Pfu PCR Master Mix         12.5μl

P1(20μM)                     0.5μl

P2(20μM)                     0.5μl

pGEMT-B7-1-PE40KDEL(1∶50)    3μl

ddH₂O                         8.5μl

总体积                        25μl

PCR反应条件如下：96℃预变性5min，96℃变性1min，63℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，后72℃延伸10min，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将PCR扩增产物回收，并用Kpn I+Xba I双酶切上述回收产物及pcDNA3.1/Zeo(+)载体，电泳后回收酶切产物。酶切体系如下：

10×M Buffer    2μl

Xba I                            1μl

Kpn I                            1μl

0.1％BSA                         2μl

回收PCR产物及pcDNA3·1/Zeo(+)

14μl

载体

总体积                            20μl

混匀后37℃水浴3h。

将酶切产物按如下步骤回收：

1)用干净刀片将目的条带从琼脂糖凝胶上切下放入1.5ml Ep管中。

2)称量凝胶的重量，按100mg的凝胶加300μl的Buffer QG加入相应体积的溶胶液。

3)50℃水浴孵育10min直至胶完全溶解，其间每2-3min上下颠倒以彻底混匀。

4)加入1倍体积的异丙醇，充分混匀。

5)将样品加入QIAquick柱，离心1min。弃掉废液，加0.5ml BufferQG，离心1min。

6)弃掉废液。加0.75ml的Buffer PE，放置2-5min，离心1min。

7)弃掉废液，离心1min。后将柱放于1.5ml的干净Ep管中。

8)将30μl注射用水加入柱膜中央，放置1min后离心1min收集洗脱液。

9)将双酶切后的PCR产物与pcDNA3.1/Zeo(+)载体连接，体系如下：

2×T4 Ligase Buffer    5μl

T4 Ligase              1μl

双酶切PCR产物          3μl

双酶切pcDNA3.1/Zeo(+)  1μl

总体积                 10μl

将连接管至于4℃冰水混合物中连接过夜。

将连接产物按如下方法转化入DH5a感受态菌中。具体操作如下：

1)将连接产物5μl、试剂A 20μl用无菌水稀释至100μl，冰上备用。

2)冰上融化入DH5a感受态菌(5min)，加入上述稀释备用质粒。

3)冰上放置20min，后室温放置10min。铺板，37℃过夜。

挑取具有Amp抗性的阳性菌落，提取质粒，双酶切鉴定(条件同前)，阳性者送TaKaRa公司测序确认。

将鉴定序列正确的菌株冻存并大量培养，采用PureYieild^TM质粒中提试剂盒大规模提取并纯化基因治疗用质粒。提纯的质粒溶解于生理盐水中，260/280在1.8～2.0.浓度＞0.5μg/μl。

1.4重组质粒pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL在CHO-K1-RPE.40细胞的瞬时表达

采用脂质体介导方法，将0.5×10⁵-2×10⁵CHO-K1-RPE.40细胞传入6孔板(培养基为DMEM/F12，7.5％FBS，1×非必需氨基酸)，培养基2ml。4μg质粒和10μl Lipofectamine^TM2000分别用250μlOPTI-MEM I培养基稀释，两者混合孵育20min，缓慢加入6孔板中。37℃、5％CO2孵育6h后，更换为完全DMEM培养基。48h后收集培养细胞及上清，采用RT-PCR及Western印迹进行检测。

1.5RT-PCR检测转染细胞中B7-1-PE40KDEL的mRNA

转染48h后，将生长的CHO-K1-RPE.40细胞用PBS清洗两次，参照说明书用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，然后逆转录合成cDNA，分别用上述引物P1、P2进行PCR扩增，并采用β-actin作为参比对照。

反转录体系如下：

MgCl₂                     2μl

10×RNA PCR Buffer        1μl

dNTP Mixture              1μl

RNase Inhibitor           0.25μl

AMV            0.5μl

Oligo dT       0.5μl

RNA            4.75μl

总体积         10μl

反应条件为42℃30min，99℃5min，5℃5min。

PCR反应体系如下：

MgCl₂                    3μl

10×LA Buffer            4μl

ddH₂O                    31.75μl

LA Taq                   0.25μl

P1(20μm)                0.5μl

P2(20μm)                0.5μl

cDNA第一链               10μl

总体积                   50μl

反应条件如下：96℃预变性5min，96℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环，后72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

β-actin引物序列为：

上游引物P1：5’CTG TGG CAT CCA CGA AAC TA 3’(SEQ ID NO：8)

下游引物P2：5ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC 3’(SEQ ID NO：9)

1.6 Western印迹检测转染细胞B7-1-PE40KDEL蛋白的表达

1)蛋白电泳：转染CHO-K1-RPE.40细胞48h后，收集培养上清并浓缩。取15μl样品与15μl 2×SDS Loading Buffer混匀，煮沸5min，行SDS-PAGE蛋白电泳，80V电压电泳至蛋白泳出积层胶，后行150V电泳至分离胶底部，断开电源。蛋白电泳配方如下：

10％分离胶5％积层胶

(5ml)        (2ml)

ddH₂O                    1.90ml         1.40ml

30％丙烯酰胺             1.70ml         0.33ml

1.5M Tris-HCl(PH8.8)     1.30ml

1.0M Tris-HCl(PH6.8)     0.25ml

10％SDS                  0.05ml         0.02ml

10％过硫酸铵             0.05ml         0.02ml

TEMED                    0.002ml        0.002ml

2)转膜：电转至PVDF膜。PVDF膜选用Immobilon-P。在甲醇浸泡15s，水中泡2min，电转液中泡20min，同时将滤纸及胶泡电转液15min，按+(白色)/三层滤纸/膜/胶/三层滤纸/黑色。转膜条件：60mA 40min。

3)使用封闭液室温封闭2h；

4)加入以适当比例用封闭液稀释的一抗，PEA多抗或CD80单抗4℃过液；

5)TBST洗涤3次，每次5min；

6)加入用封闭液稀释的HRP-抗兔或抗山羊IgG一抗，室温孵育1h；

7)TBST洗涤3次，每次10min；

8)采用ECL方法曝光显影、定影。

1.7重组质粒pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL稳定转染CHO-K1-RPE.40细胞

采用脂质体介导方法，具体操作同1.4。转染24h后，1∶20稀释转染细胞，按800μg/ml浓度加入Zeocin^TM，每隔3d换液一次，待抗性克隆逐渐增大后将其转至24孔板，长满后传至6孔板中继续培养，并扩增多瓶。用实时荧光定量RT-PCR相对定量的方法进行鉴定，将阳性细胞克隆冻存备用。

1.8ELISA检测稳定转染细胞B7-1-PE40KDEL蛋白表达量

1)收集稳定转染细胞的48h培养上清并浓缩。

2)取10μl浓缩液按1∶10稀释后包被96孔板过夜，每孔100μl，每组样品设3个平行孔。

3)封闭液封闭1h。

4)加入抗PEA多抗37℃孵育1h。

5)用PBST洗板3次。

6)加HRP-抗兔IgG 37℃孵育1h。

7)PBST洗板3次。

8)加入显色液TMB，15min后用2mol/L的H2SO4中止，测450nm吸光度值并计算相应浓度。

9)以未转染质粒的正常细胞培养液作为空白对照。采用PEA作为标准品绘制标准曲线(Kirman JR，Seder RA.DNA vaccination：theanswer to stable，protective T-cell memory？Curr Opin Immunol，2003，15：471-476.)。

1.9真核表达产物B7-1-PE40KDEL的选择性细胞毒作用检测

将高表达CD28的人淋巴瘤细胞系Jurkat、鉴定阳性的pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL稳定转染CHO-K1-RPE.40细胞以1×10⁵/ml浓度共培养于96孔培养板中，于37℃、5％CO₂培养条件下孵育48h，加入20μl MTS，1h后测定490nm吸光度值计算细胞毒活性。以低表达CD28的人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji作为阴性对照。细胞死亡率按如下公式计算：

细胞死亡率＝(1-稳定转染CHO-K1-RPE.40细胞与靶细胞共培养孔中的存活细胞/未转染CHO-K1-RPE.40细胞与靶细胞共培养孔中的存活细胞)×100％.

2.结果

2.1pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL真核表达载体的构建

为使B7-1-PE40KDEL融合基因可在真核细胞中表达，一个含有B7-1-PE40KDEL以及Zeo抗性基因的真核表达载体pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL按图1所示构建。用所设计的PCR引物扩增人B7-1-PE40KDEL，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见预期大小为1850bp的特异性条带(图2)。将双酶切回收后产物克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)的KpnI和XbaI酶切位点，构建成pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL重组质粒，经质粒提取、双酶切后电泳(图3)和测序鉴定结果(图4，测序图见附录1)，得到阳性克隆。测序显示信号肽之后的碱基序列没有发生点突变和移码突变，与原核表达质粒pRSETA-B7-1-PE40KDEL中的基因序列完全一致，与人B7-1以及PE40蛋白一、二级结构比对结果见表1。

表1：B7-1-PE40KDEL融合蛋白与B7-1及PE40蛋白一、二级结构比较

2.2 B7-1-PE40KDEL融合基因在真核细胞中的表达检测

将测序鉴定正确的pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL真核表达载体瞬时转染CHO-K1-RP E.40细胞，分别采用以下方法检测了B7-1-PE40KDEL融合蛋白的表达：首先用RT-PCR检测转染细胞中B7-1-PE40KDEL mRNA的合成，结果显示转染pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL的CHO-K1-RPE.40细胞在1850bp处可见特异性条带，而转染空载体的CHO-K1-RPE.40细胞未出现此条带。β-actin的PCR扩增产物为内参(图4)。采用Western印迹方法检测细胞培养上清B7-1-PE40KDEL融合蛋白的抗原性及分泌表达情况。结果表明无论采用PEA多克隆抗体还是采用CD80单克隆抗体，均在相对分子质量约62-83kDa之间有阳性条带，而空载体转染细胞上清无任何条带显示，结果见图5。

2.3稳定转染细胞的筛选及B7-1-PE40KDEL融合蛋白的表达检测

在所筛选获得的40个克隆中，经real time-PCR半定量验证，16个为阳性，扩大培养后冻存(见图6)。为检测稳定转染细胞B7-1-PE40KDEL表达分泌量，取数个阳性克隆的上清，或已知浓度的PEA作为标准品，采用ELISA方法，绘制标准直线(见表2，图7)。将待测上清的OD值与标准曲线比较获得各稳定转染克隆的分泌量，具体结果见表3。其余稳定转染细胞株未检测。结果表明1×10⁶个稳定转染细胞24h约表达287pg/ml的PEA蛋白。

表2：不同浓度PEA标准品的ELISA检测值

以OD450为纵坐标，PEA浓度为横坐标，利用Curve Expert1.3软件拟合标准曲线图，根据polynomial fit拟合方程的标准曲线(图7)计算出PEA在稳定转染细胞株培养上清中表达的浓度。

表3：B7-1-PE40KDEL融合蛋白表达水平检测

2.4B7-1-PE40KDEL真核表达产物的选择性细胞毒性

利用高表达CD28的人淋巴瘤细胞系Jurkat检测真核表达产物B7-1-PE40KDEL的细胞毒抑制活性，并以低表达CD28的人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji作为阴性对照。MTT检测结果显示：稳定转染的细胞与Jurkat细胞共孵育48h后测得的OD值为0.782，未转染组为1.466；Jurkat单纯细胞组为1.29，稳定转染的细胞与Raji细胞共孵育后测得的OD值为1.296，未转染组为1.564。根据公式计算获得稳定转染细胞对Jurkat细胞的杀伤率为92.87％，对Raji细胞的杀伤率为15％，抑制率显著高于对照组，证实真核表达产物B7-1-PE40KDEL具有很好的选择性抑制效应(见图8)。

实施例2：pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因的DNA疫苗防治移植物抗宿主病的试验(1)

1.材料与方法

1.1质粒、细胞及主要试剂

pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL真核表达载体为本研究构建；pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL真核表达载体则由本室薛红博士先前构建保存。PEA多克隆抗体购自Sigma公司。FITC-anti-mouse CD3、PE-anti-mouse CD28，Pharmlyse^TM购自BD公司。Premix Ex Taq^TM(Perfect Real Time)购自Takara公司。注射用甲氨蝶呤(MTX)购自江苏恒瑞医药股份有限公司，环孢素A购自Novartis PharmaSchweiz AG。小鼠淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品公司。

供体鼠为清洁级近交系C57BL/6，雄性，16～18g；受体鼠为清洁级近交系Balb/C，雌性，18-22g；均由军事医学科学院动物中心提供，饲养条件为SPF级。病理标本的制作及观察由军事医学科学院附属医院病理科协助完成。流式细胞检测由军事医学科学院辐射与放射医学研究所董波老师完成。实时荧光定量PCR仪由军事医学科学院附属医院血液室完成。

1.2主要仪器

WJ2002活体基因导入仪(Scientz Biotechnology)，550全自动酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.3异基因造血干细胞移植小鼠aGVHD动物模型的建立

受鼠于移植前一周前接受含庆大霉素(32×10⁴U/L)和红霉素(250mg/L)的饮用水预防感染，并在空气层流柜中无菌饲养。移植前4h经⁶⁰Co TBI(8.0Gy、剂量率1.8Gy/min)。

供鼠骨髓细胞和脾细胞的制备：颈椎脱臼处死C57BL/6供鼠，75％酒精中浸泡数分钟后，无菌剪取其股骨，用RPMI-1640培养液冲出骨髓腔内的骨髓，将其通过200目细胞筛，并用0.83％氯化铵溶液溶解红细胞，RPMI-1640培养液洗两次(1000rpm，10min)，制成骨髓单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁸/ml。无菌取脾脏，置于200目细胞筛上研磨，离心收集细胞后，0.83％NH₄Cl溶液溶解红细胞，RPMI-1640培养液洗两次(1000rpm，10min)，制成脾单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁸/ml。

将制备的脾细胞和骨髓细胞经尾静脉注射分别输注给各组受鼠。输注细胞数为：脾细胞2×10⁷/只；骨髓1×10⁷/只。经体征、造血功能重建、病理学分析、植入等指标检测后，确定小鼠aGVHD模型是否稳定建立。

1.4外毒素融合基因疫苗治疗aGVHD小鼠的方案

取60只aGVHD小鼠随机将其分成6组，每组10只，分别为：(1)B7-1-PE40KDEL基因疫苗治疗组；(2)B7-2-PE40KDEL基因疫苗治疗组；(3)B7-1-PE40KDEL/B7-2-PE40KDEL联合治疗组；(4)空载体组；(5)环孢素A(CsA)+甲氨碟呤(MTX)联合治疗对照组。(6)未治疗aGVHD组。空载体和治疗载体都分别溶解在生理盐水(NS)中，质粒载体无RNA污染，去内毒素，超螺旋DNA要占70％-80％，OD260/OD280＝1.8-2.0，浓度不能小于0.5ug/ul。预实验中，当输注的治疗基因剂量在75ug时，aGVHD的疗效好，副作用小，因此，本实验采取电脉冲介导的肌肉注射方法将基因导入体内，在移植后立即将75ug的空载体或治疗载体输注小鼠股四头肌，并在注射部位给予电脉冲刺激，脉冲参数为电压200V/cm，波宽10ms，脉冲次数6次，频率1Hz(Mir LM，Bureau MF，Gehl J，et al.High-efficiency genetransfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96：4262-4267.)。对照药物采用的是临床上常用的“金标准”CsA+MTX方案。CsA每天腹腔注射一次，剂量为1.5mg/kg.d；MTX在1d，3d，6d，11d腹腔注射，剂量为0.4mg/kg.d(Xu K，Li C，Pan X，et al.Study of Relieving Graft-versus-HostDisease by Blocking CD137-CD137 Ligand Costimulatory Pathwayin Vitro.Int J Hematol，2007，86：84-90.)。

1.5外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40 KDEL在正常小鼠体内的表达

采用电脉冲介导的采用肌肉注射的方法，将75μg的pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL纯化质粒注射入Balb/C正常小鼠股四头肌内，后给予电脉冲刺激(200V/cm，10ms，1Hz，6脉冲)。在注射后1d、7d、14d、21d、28d以及35d摘眼球取血，并用肝素抗凝，利用Trizol提取RNA，RT-PCR定性B7-1-PE40KDEL mRNA在血液中的表达情况，进一步采用real-time PCR的方法对PE40mRNA在血液中的表达进行相对定量比较，均以β-actin作为内部参照。

RNA的提取：用小鼠淋巴细胞分离液从小鼠外周血中(约1ml)分离白细胞，PBS洗2次后加入1ml Trizol。室温放置5min，加入200μl氯仿，振荡混匀，放置分层后4℃ 12000g离心15min。吸取上层水相至另一管中，加500μl异丙醇，混匀室温放置10min后，4℃ 12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底，用75％乙醇清洗，4℃ 8000g离心5min，弃去上清，待管中乙醇完全挥发后，用适量DEPC水溶解RNA，紫外分光光度仪定量。

逆转录条件如下：

MgCl₂                        2μl

10×RNA PCR Buffer           1μl

dNTP                         1μl

RNase Inhibitor              0.25μl

AMV                          0.5μl

Oligo dT                     0.5μl

RNA                          0.5μg

总体积                       10μl

反应条件为42℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。

小鼠β-actin引物序列为：

上游引物P1：5’AGG CAT CCT GAC CCT GAA GTA C 3’(SEQ ID NO：10)

下游引物P2：5’TCT TCA TGA GGT AGT CTG TCA G 3’(SEQ ID NO：11)

PCR反应体系如下：

Premix Ex Taq^TM(2×)    12.5μl

ddH₂O                   10.5μl

P1(20μM)               0.5μl

P2(20μM)               0.5μl

cDNA                    1μl

总体积                  25μl

Real-time PCR反应：

Segment 1：预变性

Repeat：1

95℃ 5min

Segment 2：PCR反应

Repeat：35

94℃30秒

59℃30秒

72℃60秒

Segment 3：Dissociation。

1.6外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL在正常小鼠体内活性

在75μg pcDNA 3.1/B7-1-PE40KDEL纯化质粒注射后1d、7d、14d、21d、28d以及35d，将小鼠摘眼球取血并用肝素抗凝。取100μl抗凝血，加入FITC-anti-mouse CD3及PE-anti-mouse CD28各1μg，室温避光孵育30min。加2ml Pharmlyse^TM红细胞裂解液，室温避光孵育15min。1500rpm离心5min，弃掉上清，用PBS重悬，1500rpm离心5min。弃掉上清，加入0.5ml 2％多聚甲醛PBS，上机检测。

1.7外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL在正常小鼠中抗PEA抗体的检测(Chen SY，Yang AG，Chen JD，et al.Potentantitumour activity of a new class of tumour-specific killercells.Nature，1997，385：78-80.)

肌注基因疫苗后+21d，小鼠摘眼球取血，离心分离血清后-20℃储存备用。检测采用ELISA方法：将PEA(1mg/mL)溶于包被液，按每孔100μl包被，每孔包被200ng，4℃过夜。次日PBST洗涤2-3次后，牛血清封闭液室温2小时。取待测血清以及标准品100μl/孔37℃孵育1h，PBST洗三次，HRP酶标抗小鼠IgG 1∶50000稀释100μl/孔37℃孵育1h，PBST洗四次后100μl/孔TMB显色液37℃孵育15min，50μl/孔2M H₂SO₄终止，450nm处测定吸光度值。以兔抗PEA多克隆抗体作为阳性对照，以pcDNA3.1空质粒肌注的小鼠血清为阴性对照。

1.8外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL毒副作用的初步观察

肌肉注射75ug的pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因疫苗后，观察小鼠体征、行为等变化，并取第7d、14d和21d的心、肝、脾、肺、肾脏器行病理组织学检查，初步观察基因疫苗在小鼠体内有无毒副作用。

1.9外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL对GVHD小鼠体征影响

移植后每天测量各组小鼠的体重，观察其毛发、精神、有无腹泻等体征变化。

1.10外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL对GVHD小鼠造血功能重建的影响

从预处理开始，定期从受鼠尾静脉取血20μl至380μl白细胞稀释液中，血球计数板计外周血白细胞数，了解各组小鼠血象变化及造血重建情况。

1.11外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL对GVHD小鼠嵌合体的影响

移植采用不同性别的供受者小鼠，因此可以从雌性受鼠的外周血中提取基因组DNA，设计Y染色体的特异性基因sry引物，PCR特异性扩增雄性供鼠Y染色体，检测植入情况。

Sry引物1：5’-TGTGGTCCCGTGGTGAGA-3’(SEQ ID NO：12)；

引物2：5’-ATCAACAGGCTGCCA ATAAA-3’(SEQ ID NO：13)。

1.12外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL对GVHD小鼠的组织病理学影响

移植后+21d取各组小鼠的肝、脾、小肠、皮肤组织，10％福尔马林溶液固定，石蜡切片，HE染色，观察各组织的病理改变。

1.13统计学处理

应用SPSS 13.0软件进行分析，两组计量资料均数差异统计学意义比较采用t检验，两组等级资料的比较采用非参数检验(Mann-Whitney检验)。P＜0.05为差异有统计学意义。同时应用SPSS13.0软件绘制Kaplan-Meier生存曲线。

2.结果

2.1外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL在正常小鼠体内的表达

RT-PCR的结果(图9)显示pcDNA3.1-B7-1-PE40KDEL质粒在注射后1d、7d、14d、21d、28d、35d均可检测出B7-1-PE40KDEL的mRNA，以β-actin作内参。

通过Real-time PCR的相对定量比较(图10)发现，PE40KDEL mRNA在第1d、第7d的相对表达较高；随着时间的变化而逐渐减弱，在第28d和35d表达较低。

2.2外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL在正常小鼠体内的活性

由于B7-1-PE40KDEL可特异性杀伤CD28高表达细胞，因此采用流式细胞仪检测输注B7-1-PE40KDEL质粒的小鼠外周血中CD28⁺T细胞清除状况，以几何荧光平均强度Geo mean来表示，详见图11。检测结果显示在B7-1-PE40KDEL质粒肌肉注射第7天，开始突显对CD28⁺T细胞清除效应，血液中CD28⁺T的Geo mean低于正常对照小鼠。治疗第21天时，CD28⁺T细胞下降至最低，在28天和35天，血液中的CD28⁺T开始逐渐回升，但仍较正常小鼠CD28⁺T的Geo mean值低。这说明随着B7-1-PE40KDEL在体内表达的逐渐减弱，体内CD3⁺CD28⁺T细胞有恢复至正常水平的趋势(图12)。

2.3外毒素融合基因疫苗B7-1-PE40KDEL肌注后小鼠血清中抗PEA抗体水平检测

PEA抗体水平检测采用ELISA方法，以商品PEA抗体作为标准品，绘制标准曲线。以OD450为横坐标，以PEA抗体浓度为纵坐标，以CurveExpert 1.3软件进行拟合成曲线(图13)，根据Quadratic Fit拟合方程的标准曲线，计算出血清中PEA抗体浓度，结果详见表4。pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL肌注组的抗PEA抗体水平明显低于阳性对照组(p＜0.05)，与阴性对照即空载体肌注组的抗PEA水平无统计学差异。

表4：pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL肌注21天后小鼠血清中PEA抗体水平

*表示与阳性对照相比，P＜0.05

2.4外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL对正常小鼠的毒副作用

肌肉注射75ug的pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因疫苗后，每天观察小鼠，小鼠体征、行为等未发生异常，第7d、14d和21d的心、肝、脾、肺、肾脏器行病理组织学检查示未发生明显的病理学改变。

2.5aGVHD小鼠模型建立情况

小鼠移植一周后开始出现毛色杂乱，精神萎靡，食欲减退，腹部、头部脱毛严重，腹泻，黑便，溃疡，弓背体位等典型的GVHD症状(图14)。体重进行性下降，每天下降近1g，在+10d左右达到最低约14.77±1.66g，之后开始回升，+14d后又开始逐步下降直至死亡，死亡时体重下降了8g左右(图15)。外周血白细胞数于+1d开始下降，+3d～+4d降至最低点，白细胞计数为0.69±0.18×10⁹/L，于+6d开始造血恢复，+14d达到峰值，随后又持续下降，死亡时白细胞值为1.54±0.14×10⁹/L。移植后+35d均可在受鼠外周血中检测到雄性供鼠的特异性Y染色体sry基因序列，如图16所示的371bp片段大小，提示植入成功。病理学结果出现典型的IV GVHD病理表现，具体可见：①小肠组织粘膜腺体上皮细胞坏死，在上皮细胞及腺腔内见坏死细胞碎屑；腺上皮细胞变为扁平形，腺体成囊状，腺体减少、消失，粘膜上皮脱落(图17-A)；②肝脏组织发生局灶肝细胞变性坏死，淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润(图17-B)，肝细胞膨胀、变性；③脾脏出现大片出血、脾小体纤维化，脾窦扩张出血，脾细胞稀少(图17-C)；④皮肤真皮下浅层纤维组织增生，真皮内淋巴细胞浸润(图17-D)。GVHD模型组小鼠于照射后24天内全部死亡，中位生存时间为22.7d；骨髓移植组组平均生存时间超过60天，视为长期存活；脾细胞移植组中位生存时间为9.6d；单纯照射组中位生存时间为12.3d。各组小鼠生存率见Kaplan-Meier生存曲线(图18)。综合上述出现的GVHD典型的症状，我们可以确定建立了稳定的急性GVHD小鼠模型，且建模成功率几乎为100％，为下步的疗效实验奠定了稳定的模型基础。

2.6外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL对aGVHD小鼠体征的疗效观察

pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL(简称B7-1)，pcDNA3.1/B 7-2-PE40KDEL(简称B7-2)，以及B7-1+B7-2联合给药组治疗后，弓背、脱毛症状较其它组明显减轻，开始脱毛时间较其它组晚3-6d，无血便，无肛周红肿。pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL治疗后小鼠的体重下降最少；其次是CsA+MTX联合给药组；B7-2+B7-1联合组以及B7-2治疗组的体重再次之，体重下降最多的是空载体组和GVHD未治疗组(NS组)。治疗后各组GVHD小鼠体重的变化见图19。

2.7外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL对aGVHD小鼠造血功能重建的作用

各组aGVHD小鼠外周血白细胞(WBC)数于+1d开始下降，+3d～+4d降至最低点，约为0.6×109/L，于+6d开始造血恢复，恢复的程度B7-1组，B7-2组，B7-1+B7-2，以及CsA和MTX联合治疗组都要比空载体组和未治疗组高，其中B7-1组的WBC恢复程度最好；随后又持续下降，死亡时WBC数均＞1.0×109/L(图20)。

2.8外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL对aGVHD小鼠组织病理学的作用

对治疗后21天的各组小鼠小肠组织进行病理学分析(图21)，发现C组(B7-1+B7-2)和E组(CsA+MTX)腺上皮细胞完整性较好，坏死细胞相对较少；F组(aGVHD未治疗组)粘膜腺体上皮细胞大片坏死，粘膜上皮脱落最严重。皮肤的病理学分析结果发现(图22)，D组(空载体组)和F组(aGVHD未治疗组)皮肤真皮下浅层纤维组织增生严重，A组(B7-1)，B组(B7-2)，C组(B7-1+B7-2)，E组(CsA+MTX)的病变程度较轻，淋巴细胞浸润程度也较D组和F组轻。肝脏的病理学分析结果发现(图23)，只有A组(B7-1)肝细胞膨胀、水样变性程度较低，其它各组局灶肝细胞变性坏死，淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润，肝细胞膨胀、变性较严重。

2.9外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL对aGVHD小鼠生存时间的作用

B7.1治疗组小鼠的生存时间最长，中位生存时间为51d；B7.2治疗组中位生存时间41天；B7.1+B7.2治疗组中位生存时间为47d；空载体组中位生存时间为22.5d；CsA+MTX治疗组中位生存时间39.7天；未治疗组中位生存时间21.5天。各组小鼠生存率见Kaplan-Meier生存曲线(图24)。

2.10外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL以及pcDNA3.1/B7-2-PE40KDEL治疗各组aGVHD小鼠后嵌合体的检测

移植后各治疗组小鼠在第21天均可在其外周血中检测到雄性供鼠的特异性Y染色体sry基因序列(图25)，提示各组均植入成功。

实施例3：pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL外毒素融合基因的DNA疫苗治疗移植物抗宿主病的试验(2)

1.材料和方法

1.1实验动物

供体鼠为清洁级近交系C57BL/6(H-2K^b)，雄性，16～18g；

受体鼠为清洁级近交系Balb/C(H-2K^d)，雌性，18-22g；

均由军事医学科学院动物中心提供，饲养条件为SPF级。

1.2药品与试剂

pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-2-PE40KDEL真核表达载体由本室构建保存；pcDNA3.1/Zeo(+)-B7-1-PE40KDEL真核表达载体为第一章构建并保存。注射用甲氨喋呤(MTX)购自江苏恒瑞医药股份有限公司，环孢素A购自Novartis Pharma Schweiz AG。FITC-anti-mouse CD3、PE-anti-mouse CD28、PE-Cy5-anti-mouse CD8、PE-Cy5-anti-mouseCD4、PE-anti-mouse CD4、PE-anti-mouse CD25、均购自BD公司。Luminex液体芯片检测细胞因子所用的Fluorokine MAP mouse IFNγ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、TNFαkit为R&D公司提供。TGFβ及IL-2 ELISA kit由R&D公司提供。

1.3急性移植物抗宿主病小鼠模型的建立

受鼠于移植前一周前接受含庆大霉素(32×10⁴U/L)和红霉素(250mg/L)的饮用水预防感染，并在空气层流柜中无菌饲养。移植前4h经⁶⁰Co TBI(8.0Gy、剂量率1.8Gy/min)。

供鼠骨髓细胞和脾细胞的制备：颈椎脱臼处死C57BL/6供鼠，75％酒精中浸泡数分钟后，无菌剪取其股骨，用RPMI-1640培养液冲出骨髓腔内的骨髓，令其通过200目细胞筛，并用0.83％氯化铵溶液溶解红细胞，RPMI-1640培养液洗两次(1000rpm，10min)，制成骨髓单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁸/ml。无菌取脾脏，置于200目细胞筛上研磨，离心收集细胞后，0.83％NH₄Cl溶液溶解红细胞，RPMI-1640培养液洗两次(1000rpm，10min)，制成脾单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁸/ml。

将制备的脾细胞和骨髓细胞经尾静脉注射分别输注给各组受鼠。输注细胞数为：脾细胞2×10⁷/只；骨髓1×10⁷/只。经体征、造血功能重建、病理学分析、植入等指标检测后，确定小鼠aGVHD模型是否稳定建立。

1.4新型外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL的防治方案

B7-PE40KDEL基因疫苗治疗方案：小鼠于移植后第一天即开始输注各组药物。实验每组五只，分为六组，分别为：(1)B7-1-PE40KDEL基因疫苗治疗组；(2)B7-2-PE40KDEL基因疫苗治疗组；(3)B7-1-PE40KDEL+B7-2-PE40KDEL联合治疗组；(4)空载体组；(5)环孢素A(CsA)+甲氨碟呤(MTX)联合治疗对照组；(6)未治疗aGVHD组；(7)正常对照组。空载体和治疗载体都分别溶解在生理盐水(NS)中，质粒载体无RNA污染，去内毒素，超螺旋DNA要占70％-80％，OD260/OD280＝1.8-2.0，浓度不能小于0.5ug/ul。在移植后立即将75ug的空载体或治疗载体输注小鼠股四头肌，并在注射部位给予电脉冲刺激，脉冲参数为电压200V/cm，波宽10ms，脉冲次数6次，频率1Hz。对照药物采用的是临床上常用的CsA+MTX方案。CsA每天腹腔注射一次，剂量为1.5mg/kg.d；MTX在1d，3d，6d，11d腹腔注射，剂量为0.4mg/kg.d。

1.5aGVHD小鼠血清中细胞因子的检测-Luminex液体芯片技术

小鼠移植后的第7d，14d，21d，分别眶下静脉丛采血取血，离心分离血清后，按如下步骤操作，每份标本进行双复孔检测：

1)实验前的准备：

稀释20ml的wash buffer浓缩液成500ml的wash buffer；

4倍稀释样品：37.5μl RD6-40+12.5μl样品；

标准品稀释：用0.9ml的RD6-40稀释成standard cocktail，并逐级稀释成各梯度浓度；

微球的稀释：50μl微球浓缩液→5ml微球稀释液；

Biotin抗体的稀释：50μl Biotin抗体浓缩液→5ml Biotin抗体稀释液；

链亲和霉素-PE的稀释：55μl streptavidin-PE浓缩液→5.5mlwash buffer

2)室温下准备好所有的试剂、标准品和样品；

3)用100μl的wash buffer预湿微孔板上的滤膜，真空洗板机抽去液体；

4)在振荡器上微震，重悬稀释后的微球，每孔加入50μl的微球；

5)每孔加入50μl的样品或标准品，封膜，锡箔纸封盖避光室温孵育3h；

6)真空洗板机移除液体，加入100μl的wash buffer洗3遍；

7)每孔加入50μl稀释后的biotin抗体混合物，封膜，锡箔纸封盖室温震荡(500±50rpm)孵育1h；

8)同步骤6)洗板3遍；

9)每孔加入稀释后的streptavidin-PE 50μl，封膜，锡箔纸封盖室温震荡(500±50rpm)孵育0.5h；

10)同步骤6)洗板3遍；

11)每孔用100μl的wash buffer重悬，室温震荡(500±50rpm)2min；

12)90分钟内上LuminexTM100仪器检测分析。

1.6 aGVHD小鼠血清中细胞因子的检测-Elisa Kit

由于缺乏小鼠TGFβLuminex配套kit以及ELISA试剂盒，又因人与小鼠TGF-β同源性较高，故本研究使用人TGF-βELISA试剂盒代替；由于血清中IL-2浓度难以检测，(文献和前述Luminex检测后均为阴性)，但T细胞活化时IL-2与它的受体(有α、β和γ三个亚单位)相结合，α亚单位从细胞表面脱落，可以从血清中测到，称之为可溶性IL-2受体(sIL-2R)，故采用小鼠可溶性白介素-2受体(sIL-2R)检测的Elisa Kit再次进行检测。

小鼠血清sIL-2R、人TGFβ的检测方法如下：

1)从平衡至室温的密封袋中取出所需板条。

2)除空白孔外，分别将标本(1∶1稀释)或不同浓度的标准品(100μl/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90min。

3)洗板4次。除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60min。

4)洗板4次。除空白孔外，加入酶结合工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育30min。

5)洗板4次。加入显色剂100μl/孔，避光37℃孵箱孵育10-15min。

6)加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(5分钟内)。

结果判断：

使用CurveExpert1.3软件绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，拟合标准曲线。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。若标本OD值高于标准曲线的上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

1.7aGVHD小鼠外周血T细胞亚群分析

小鼠移植后2周，取肝素钠抗凝外周血，分别加入FITC-anti-mouse CD3、PE-anti-mouse CD28、PE-Cy5-anti-mouse CD8、PE-Cy5-anti-mouse CD4、PE-anti-mouse CD4、PE-anti-mouse CD25单克隆抗体，用流式细胞仪检测CD4⁺/CD8⁺、CD3⁺CD8⁺C28^-抑制性T细胞亚群(Ts细胞)、CD4⁺CD25⁺调节性T细胞亚群(Treg细胞)的变化。检测方法如下：

1)取100μl抗凝血，加入相应荧光标记抗体各1μg，室温避光孵育30min；

2)加2ml Pharmlyse^TM红细胞裂解液，室温避光孵育15min；

3)1500rpm离心6min，弃掉上清，用PBS重悬，1500rpm离心5min；

4)弃掉上清，加入0.5ml 2％多聚甲醛/PBS，上机检测。

1.8统计学方法

结果数据以表示，应用SPSS13.0软件进行分析，方差齐性时组间比较采用ANOVA分析，Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有显著性；方差不齐时采用非参数统计。

2.结果

2.1外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL治疗aGVHD小鼠后血清中细胞因子的变化

在小鼠移植后的第7d、14d及21d，采用Luminex液体芯片技术以及ELISA方法检测了实验各组小鼠血清中细胞因子的变化，检测结果详见表1。结果显示，aGVHD小鼠中Th-1因子中IFNγ、IL-2及TNFα水平明显高于正常对照组(P＜0.01)，尤其是在发病初期+7d；在+14d时IFNγ逐渐回落，到+21d时IFNγ甚至恢复到接近正常水平。而Th-1因子中的IL-2和TNFα始终维持在远高于正常水平之上。Th-2因子IL-4和Th-3因子TGF-β的变化与正常对照并无统计学差异。意外的是，Th-2因子IL-10在+7d和+14d时明显高于正常对照组。由于检测方法灵敏度的缘故，IL-12基本上难以检测到。

如表5所示，在移植后初期+7d，经B7-1-PE40KDEL、B7-2-PE40KDEL基因疫苗组以及两者联合治疗的移植组小鼠，血清中Th1细胞因子如IFNγ下降最为显著(P＜0.01)；而CsA+MTX组的IFNγ水平在第7天时仍然较高，与aGVHD组相比有统计学差异(P＜0.01)；但在+14d和+21d时，CsA+MTX组与B7-1-PE40KDEL各基因疫苗治疗组一样，IFNγ均回落到正常水平。此外，B7-1-PE40KDEL各基因疫苗治疗组和CsA+MTX组的治疗均能有效地降低Th1细胞因子IL-2水平，与aGVHD对照组相比具有统计学差异(P＜0.05)；相反，B7-1-PE40KDEL各基因疫苗治疗组和CsA+MTX组对Th1细胞因子TNF-α的影响不大。

由表5可以看出，对参与抑制炎症的Th2细胞因子如IL-4、IL-10和Th3因子TGF-β而言，B7-1-PE40KDEL各基因疫苗治疗组和CsA+MTX组的治疗对Th2细胞因子IL-4影响无统计学差异。对Th2细胞因子IL-10而言，B7-1-PE40KDEL各基因疫苗治疗组和CsA+MTX组的治疗均能有效地提高其水平，与aGVHD对照组之间具有统计学差异。而对于Th-3因子TGF-β的变化而言，只有B7-1-PE40KDEL基因疫苗组的治疗能有效促进其水平的提高，而B7-2-PE40KDEL基因疫苗组这一效应不明显。相反，CsA+MTX组的治疗则还对Th-3因子TGF-β有少量的抑制作用。

2.2外毒素融合基因疫苗pcDNA3.1/B7-1-PE40KDEL治疗GVHD小鼠后外周血T细胞亚群的变化

小鼠移植后第2周，采用流式细胞仪检测了三种T细胞亚群，即CD4⁺/CD8⁺、CD4⁺CD25⁺Treg细胞亚群以及CD8⁺C28^-Ts细胞亚群。其结果及代表性流式图谱详见图26-31和表6。

结果表明，正常组CD4/CD8比例约是3.2，而aGVHD小鼠在照射、移植以后CD4/CD8的比例严重倒置，较正常组来说，CD3⁺CD8⁺T细胞比例均显著增高，CD3⁺CD4⁺细胞比例显著降低。而经pcDNA3.1-B7-1-PE40KDEL、pcDNA3.1-B7-2-PE40KDEL、两者联合治疗以及CsA+MTX联合治疗后，对CD4/CD8比例并没有明显的逆转现象(图26-27和表6)。

为了检测B7-1-PE40KDEL各基因疫苗治疗组和CsA+MTX组的治疗是否有特殊的T细胞亚群参与了免疫调控的过程，我们比较了各治疗组、各对照组CD4⁺淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺Treg细胞所占比例的改变，结果如图28-29和表5所示。统计学结果显示，B7-1-PE40KDEL组、B7-1+B7-2组中的CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例明显高于空载体组、NS对照组(P＜0.01&P＜0.05)；B7-2-PE40KDEL组的CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例也高于高于空载体组、NS对照组(P＜0.05)，但作用要比B7-1-PE40KDEL组弱。相反，CsA+MTX组中的CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例没有统计学差异。

此外，我们还比较了另外一种调节性T细胞在免疫网络调控中的变化，即各治疗组、各对照组中CD8⁺CD28^-Ts细胞所占比例的改变，结果如图30-31和表6所示。由此可见，B7-1-PE40KDEL组、B7-2-PE40KDEL组、B7-1+B7-2组以及CsA+MTX组中的CD8⁺CD28^-Ts细胞比例要高于空载体组、NS对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。