靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒及其应用

摘要

本发明涉及一种靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒Ad-TD-hIL12，该病毒已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO：V201031。该病毒载体为C亚类的5型腺病毒Ad5，经删除E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个基因，并利用E3gp-19K启动子控制表达人IL12的p35和p40亚基基因序列。该病毒通过感染肿瘤细胞在肿瘤细胞中复制溶解肿瘤细胞同时，能在肿瘤组织中产生高水平具有多种抗肿瘤作用的hIL12。hIL12具有抗肿瘤血管形成作用，能调节人体免疫能力，使机体产生抗肿瘤特异免疫能力，杀死远处转移肿瘤细胞并可防止肿瘤复发，可作为一种靶向性基因工程药物治疗各种实体瘤，不但可用于肿瘤内注射，还可用于腹腔、胸腔内注射，均不会引起明显副作用，具有较好的疗效和安全性。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程生物技术领域，特别是涉及一种靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒及其应用。

背景技术

基因工程腺病毒载体Ad-TD是一种肿瘤靶向性载体，经过删除E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个基因，并保留E3gp-19K启动子序列的5型腺病毒，具有很好的抗肿瘤效果。白介素12（IL12）被称为自然杀伤细胞刺激因子或者细胞毒性淋巴细胞成熟因子，是由二硫键连接的异二聚体的细胞因子，两个亚基通常称为p35和p40。p35由T细胞、B细胞、NK细胞及单核细胞等产生；p40主要由活化的单核细胞及B细胞产生。人和小鼠的p35和p40基因已经被测序，并且它们在体内外显示出NK细胞和T细胞的生长因子的功能。进一步研究表明，IL12能有效地使小鼠肿瘤消退和完全消失。但是，IL12在体内有很短的半衰期，需经持续注射才能够达到治疗效果，需要IL12的量相对较大（1-10μg/天），并且给予重组的IL12蛋白经常导致严重毒性。目前，利用逆转录病毒载体的IL12基因治疗在一些实验室中正在进行，其抗肿瘤效果已经被证实，但是，直接运用IL12基因治疗还不能引起建立的肿瘤和肿瘤自发转移灶的消退。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种靶向性治疗人肿瘤的腺病毒Ad-TD-hIL12，该病毒可作为治疗肿瘤的基因工程药物，该病毒载体具有靶向性、安全、高效的特点。

本发明的技术方案：

5型腺病毒载体为含有编码人IL12的p35和p40亚基基因的复制选择型腺病毒，该病毒能选择性地在肿瘤细胞中复制，并在进入肿瘤后表达有功能的人IL12。这些肿瘤包括裸眼能看到或者显微镜下可见的实体瘤、转移瘤和扩散瘤。该病毒载体进入机体后能够选择性地在肿瘤细胞中复制并溶解肿瘤细胞，释放大量肿瘤相关抗原，与表达的细胞因子人IL12协同作用，使机体产生高效、特异的抗肿瘤反应，杀伤未被病毒感染的远处肿瘤细胞，包括转移的微小肿瘤细胞灶。在肿瘤细胞中高表达的IL12还具有抗肿瘤血管形成等多种作用。

为了解决上述问题，本发明构建了一种肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-hIL12，该病毒载体为C亚类的5型腺病毒Ad5，删除该腺病毒的E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个内在基因（Triple Deletion，TD），保留了有助于病毒基因的表达和增强病毒在体内持续时间的E3B基因，同时，保留E3gp-19K启动子表达外源治疗基因——人白细胞介素12。

白介素12是异二聚体，包括p35和p40亚基，每个亚基有各自的基因编码，IL12的p35和p40亚基的编码DNA序列可以从包括人的组织中获得。本发明中的人IL12序列包括来源于人组织、体外合成或者重组的完整的和改变的具有抗肿瘤效果的编码序列。这些序列包括但不只限定在人IL12 DNA序列的增加、删除、点突变及5'和/或3'端的缺失。不同于本发明中的人IL12序列的同源DNA序列或者编码的多肽表现出抗肿瘤效果或者引起肿瘤消退的序列也包含其中。

所述p35和p40亚基基因对应的氨基酸序列分别为SEQ NO：1和SEQ NO：2，对应的核苷酸序列分别为SEQ NO：3和SEQ NO：4。

所述的人肿瘤为人的各种实体瘤。

所述靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒Ad-TD-hIL12在用于制备治疗肿瘤药物中的应用。

靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒的载体Ad-TD-hIL12的构建方法，包括以下步骤：

（1）用NcoI和NheI双酶切pORF-hIL-12质粒，然后用T4 DNA 聚合酶将切出的hIL12基因片段补平，备用；

（2）用平端酶单一切开腺病毒载体pAd-TD的E3gp-19K缺失区，将所述的hIL12基因按基因组一致顺序插入到病毒载体pAd-TD的酶切位点上，用PCR方法鉴定筛选插入方向正确的重组载体；

（3）将所述重组载体转染到293细胞中，生产所述的病毒载体Ad-TD-hIL12。

本发明的肿瘤靶向性腺病毒Ad-TD-hIL12，已经在中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：V201031，保藏日期：2010年12月1日。

本发明的积极有益效果：

（1）本发明的肿瘤靶向性腺病毒Ad-TD-hIL12，利用病毒内在基因的启动子，删除了E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个腺病毒内在基因，保留了E3区的部分基因，利用E3gp-19K基因的启动子表达人的IL12基因作为治疗基因。该病毒通过特定靶向人肿瘤细胞中常见的Rb基因和抗凋亡基因的异常，能选择性地在肿瘤细胞中复制而不在正常细胞中复制，从而增加特异性和安全性，复制的病毒能溶解肿瘤细胞，同时能在肿瘤组织中产生高水平并具有多种抗肿瘤作用的IL12。

（2）本发明的Ad-TD- hIL12表达的hIL12具有抗肿瘤血管形成的作用，更为重要的是能调节人体免疫力，并与在肿瘤细胞中复制的Ad-TD-hIL12产生协同作用，使机体产生抗肿瘤特异免疫能力，从而杀死远处转移的肿瘤细胞，并可防止肿瘤复发。经细胞学实验和动物试验表明，该病毒能选择性地杀死肿瘤细胞，清除部分免疫缺陷和无免疫缺陷鼠类的荷瘤，具有较好的疗效和安全性。

（3）本发明的肿瘤靶向性腺病毒Ad-TD-hIL12，具有肿瘤靶向性和抗肿瘤效果，可作为一种靶向性基因工程药物，能治疗的肿瘤包括裸眼能看到或者显微镜下可见的实体瘤、转移瘤和扩散瘤，也可治疗晚期弥漫播散性肿瘤。

（4）本发明的溶肿瘤腺病毒Ad-TD-hIL12，不但可用于肿瘤内注射，还可用于腹腔、胸腔内注射，并且均不会引起明显的副作用。

（5）本发明的靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒Ad-TD-hIL12，安全、高效，为作为一种肿瘤靶向性基因工程药物推向临床应用打下基础，将为肿瘤病人提供一种有效的治疗方法，将产生较好的社会效益和经济效益。

附图说明

图1：本发明的肿瘤靶向性腺病毒Ad-TD-hIL12、Ad-TD-gene、dl1520和对照病毒Ad-TD-RFP的结构图。

图2：本发明的病毒Ad-TD-hIL12和对照病毒对大负荷肿瘤的治疗效果。

图3：不同剂量Ad-TD-hIL12、对照病毒和dl1520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤生长曲线。

图4：不同剂量Ad-TD-hIL12、对照病毒和dl1520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤停止进展率。

图5：不同剂量Ad-TD-hIL12、对照病毒和dl1520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤清除率。

图6：低剂量Ad-TD-hIL12、对照病毒和dl1520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤生长曲线。

图7：低剂量Ad-TD-hIL12、对照病毒和dl1520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤停止进展率。

图8：低剂量Ad-TD-hIL12、对照病毒和dl1520处理荷瘤金黄地鼠的肿瘤清除率。

图9：Ad-TD-m/hIL12治疗荷瘤有免疫能力动物后所产生的肿瘤特异免疫能力。

图10：不同剂量Ad-TD-hIL12对胰腺癌腹腔扩散治疗作用(其中1：PBS；2： Ad-TD-hIL12 1×10⁹ pt/次；3：Ad-TD-hIL12 2.5×10⁹ pt/次；4：Ad-TD-hIL12 5×10⁹ pt/次)。

其中图3、图4、图6、图7中的符号表示， ：PBS；：dl1520；：Ad-TD-RFP；：Ad-TD-hIL12。

具体实施方式

以下通过实例对本发明进一步说明，并不是限定本发明的保护范围，本领域的技术人员根据说明书可以对这些实施方案进行修改，只要不脱离本发明的精神和范围都可以得到类似或相同的结果，均在本发明的保护范围之内。

实例1：肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD- hIL12的对应鼠IL12基因病毒载体Ad-TD-mIL12的构建方法，参见图1，其步骤如下：

（1）首先用PCR方法得到要改造序列E1A-CR2基因两侧的DNA片段，上游序列称为左臂，下游序列称为右臂，用基因工程方法把左臂和右臂按病毒基因一致的顺序连接到质粒载体pSuperShuttle上，建成E1A-CR2穿梭载体；

将腺病毒载体Ad5和E1A-CR2穿梭载体按1:2~10的比例转化到BJ5183细菌中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，转染到293细胞中，得到E1A-CR2缺失的Ad5R-CR2病毒载体；

（2）用与构建E1A-CR2穿梭载体相同的方法构建E1B19K穿梭载体，然后与Ad5R-CR2病毒载体同源重组，得到CR2和E1B19K双缺失的Ad5R-CR2-E1B19K病毒载体；

（3）用PCR方法扩增E3gp-19K基因蛋白编码区两侧序列，左臂范围从－1087bp到0bp，其中包含E3gp-19K基因的启动子，右臂起始于E3gp-19K基因的终止密码向后1146bp，两臂用酶切位点相连，构建穿梭载体，然后与Ad5ΔR-CR2-E1B19K病毒载体同源重组，得到E1A-CR2、E1B19K和E3gp-19K三个编码基因均缺失的腺病毒载体pAd-TD，将pAd-TD转染到293细胞中，生产肿瘤靶向性腺病毒载体Ad-TD-gene（Ad-TD）。

（4）用NcoI和NheI双酶切pORF-mIL-12质粒，然后用T4 DNA 聚合酶将切出的mIL12基因片段补平，备用；

（5）用平端酶单一切开腺病毒载体pAd-TD的E3gp-19K缺失区，然后将所述的mIL12基因按基因组一致顺序插入到病毒载体的酶切位点上，用PCR方法鉴定筛选插入方向正确的重组载体；

（6）将插入方向正确的重组载体转染到293细胞中，生产病毒载体Ad-TD-mIL12。

实例2：肿瘤靶向性腺病毒Ad-TD- hIL12的抗肿瘤应用。

在5-6周龄的金黄地鼠背部右上侧接种1×10⁶的HPD1-nr细胞（金黄地鼠胰腺癌细胞），肿瘤体积为160mm³时，分别用PBS、dl1520、Ad-TD-RFP、Ad-TD-mIL12和Ad-TD-hIL12进行瘤内注射5×10⁹pt/次，分三次治疗，然后观察治疗效果。

结果图2表明单独使用Ad-TD-hIL12对大负荷肿瘤动物的治愈率为85.71%，而dl1520组动物的治愈率为0%。

实例3：不同剂量的Ad-TD-hIL12、对照病毒和dl1520体内抗肿瘤效果比较。

在5-6周龄的金黄地鼠背部右上侧接种1×10⁶的HPD1-nr细胞，当肿瘤生长至较大荷瘤（160 mm³）时，在肿瘤内分别注射PBS、dl1520、Ad-TD-RFP、Ad-TD-mIL12和Ad-TD-hIL12，5×10⁹pt/次，每天一次，共五次(与已上市腺病毒药物H101临床应用方案一样，但剂量小20倍)，然后观察肿瘤大小和肿瘤清除率。

结果见图3、图4、图5。图3表明Ad-TD-hIL12比dl1520和对照病毒Ad-TD-RFP显示出更强的抗肿瘤效果；图4说明Ad-TD-hIL12治疗组动物肿瘤生长进程最慢；图5说明Ad-TD-hIL12治疗组动物的肿瘤清除率最高，可达100%，而dl1520组、Ad-TD-RFP组动物的肿瘤清除率均为33.33%。

实例4：低剂量Ad-TD-hIL12、对照病毒和dl1520的体内抗肿瘤效果比较。

用金黄地鼠肾癌模型，在5-6周龄的金黄地鼠背部右上侧接种5×10⁶的HAK细胞，当肿瘤生长到较大体积（230 mm³）时，用更低剂量的不同病毒（1×10E⁹pt/次，五次治疗）在瘤内分别注射PBS、dl1520和Ad-TD-hIL12，然后观察肿瘤大小和肿瘤清除率，结果见图6、图7、图8。图6表明低剂量dl1520、对照病毒Ad-TD-RFP与PBS均没有显著的抗肿瘤能力，而Ad-TD-hIL12显示较强的抗肿瘤能力，图7说明Ad-TD-hIL12治疗组动物肿瘤生长进程最慢，图8说明Ad-TD-hIL12治疗组动物的肿瘤清除率最高，可达71.43%，而dl1520组、Ad-TD-RFP组动物的肿瘤清除率均为0。

实例5：Ad-TD-m/hIL12治疗荷瘤有免疫能力动物后所产生的肿瘤特异免疫能力。

实例3中m/hIL12治疗组中肿瘤消失的金黄地鼠在肿瘤消失60天后，在原来接种肿瘤的对侧皮下接种其他肿瘤细胞（金黄地鼠肾癌细胞HAK，5×10⁶个）或细胞数为原来2倍的HPD1-nr细胞（2×10⁶），7天后，全部长出肿瘤组织。第13天，7只重新接种HPD1-nr的动物有5只肿瘤消失；第103天时，仍是7只中有5只肿瘤消失，产生的肿瘤特异免疫能力比率为71.43%，而接种HAK的金黄地鼠5只一直全部荷瘤，产生的肿瘤特异免疫能力比率为0（见图9）。

实例6：不同剂量Ad-TD-hIL12对胰腺癌腹腔扩散治疗作用。

5-6周龄的金黄地鼠腹腔注射5×10⁶ HPD1-nr细胞，7天后开始治疗，每天腹腔注射不同制剂一次，共持续5天，然后观察动物生存状态、生存率。注射制剂分别为PBS组，Ad-TD-hIL12 1×10⁹ pt/次治疗；Ad-TD-hIL12  2.5×10⁹ pt/次治疗；Ad-TD-hIL12 5×10⁹ pt/次治疗。PBS组和Ad-TD-hIL12用低剂量（1×10⁹ pt/次和2.5×10⁹ pt/次），动物于肿瘤注射37天后全部出现恶病质，大量腹水和腹腔多发癌转移灶，而Ad-TD-hIL12 5×10⁹ pt/次治疗组动物仍生存良好， 无任何副作用，如肝功能衰竭等。参见图10。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  郑州大学

 

<120>  靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒及其应用

 

<130>  基因工程技术

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  198

<212>  PRT

<213>  Homo sapiens

 

<400>  1

 

Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys

1               5                   10                  15     

 

 

Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln

            20                  25                  30         

 

 

Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile

        35                  40                  45             

 

 

Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys

    50                  55                  60                 

 

 

Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu

65                  70                  75                  80 

 

 

Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser

                85                  90                  95     

 

 

Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met

            100                 105                 110        

 

 

Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro

        115                 120                 125            

 

 

Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu

    130                 135                 140                

 

 

Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser

145                 150                 155                 160

 

 

Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile

                165                 170                 175    

 

 

Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met

            180                 185                 190        

 

 

Ser Tyr Leu Asn Ala Ser

        195            

 

 

<210>  2

<211>  328

<212>  PRT

<213>  Homo sapiens

 

<400>  2

 

Met Gly His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu

1               5                   10                  15     

 

 

Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val

            20                  25                  30         

 

 

Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu

        35                  40                  45             

 

 

Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln

    50                  55                  60                 

 

 

Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val

                85                  90                  95     

 

 

Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp

            100                 105                 110        

 

 

Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe

        115                 120                 125            

 

 

Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp

    130                 135                 140                

 

 

Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg

145                 150                 155                 160

 

 

Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser

                165                 170                 175    

 

 

Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu

            180                 185                 190        

 

 

Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile

        195                 200                 205             

 

 

Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr

    210                 215                 220                

 

 

Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn

225                 230                 235                 240

 

 

Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp

                245                 250                 255    

 

 

Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr

            260                 265                 270        

 

 

Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg

        275                 280                 285            

 

 

Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala

    290                 295                 300                

 

 

Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser

305                 310                 315                 320

 

 

Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser

                325            

 

 

<210>  3

<211>  597

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

 

<400>  3

gccagaaacc tccccgtggc cactccagac ccaggaatgt tcccatgcct tcaccactcc     60

 

caaaacctgc tgagggccgt cagcaacatg ctccagaagg ccagacaaac tctagaattt    120

 

tacccttgca cttctgaaga gattgatcat gaagatatca caaaagataa aaccagcaca    180

 

gtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc aagaatgaga gttgcctaaa ttccagagag    240

 

acctctttca taactaatgg gagttgcctg gcctccagaa agacctcttt tatgatggcc    300

 

ctgtgcctta gtagtattta tgaagacttg aagatgtacc aggtggagtt caagaccatg    360

 

aatgcaaagc tgctgatgga tcctaagagg cagatctttc tagatcaaaa catgctggca    420

 

gttattgatg agctgatgca ggccctgaat ttcaacagtg agactgtgcc acaaaaatcc    480

 

tcccttgaag aaccggattt ttataaaact aaaatcaagc tctgcatact tcttcatgct    540

 

ttcagaattc gggcagtgac tattgataga gtgatgagct atctgaatgc ttcctaa       597

 

 

<210>  4

<211>  997

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

 

<400>  4

atgggtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc     60

 

gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat    120

 

gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg    180

 

accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa    240

 

gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg    300

 

ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag    360

 

aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc    420

 

acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga    480

 

ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc    540

 

agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca    600

 

gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat    660

 

gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac    720

 

ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac    780

 

acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag    840

 

agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc    900

 

cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc    960

 

gaatgggcat ctgtgccctg cagtgttcct ggagtag                             997