甲型肝炎病毒株SH及其二倍体细胞适应方法

摘要

本发明提供了一种新的甲型肝炎疫苗病毒株SH，其分离方法及MRC-5细胞适应方法。该病毒是从甲型肝炎急性感染患者粪便中分离得到的，再传至人二倍体细胞MRC-5细胞上适应培养。该SH毒株经基因测序、中和试验等方法证明是甲型肝炎病毒，适应过程中，早代次培养周期为35天，传至8代后培养周期缩短至24天。继续培养8代，抗原滴度可达1∶512-1∶1024，病毒感染滴度可达7.0-8.0lgCCID

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说，涉及甲型肝炎病毒株SH及其二倍体细胞适应方法。

背景技术

甲型肝炎，简称甲肝，是由甲型肝炎病毒引起的一种严重危害人类健康的急性传染病。甲肝主要通过“粪-口”途径传播，或个人间的传播，或因污染了甲肝病毒的水或者食物从而引起甲肝爆发。大龄儿童和成人感染甲肝后，70％以上为临床型感染，病死率为0.3％～0.6％；50岁以上患者的病死率为1.8％；慢性肝病者感染甲肝后，发生急性肝衰竭的危险性升高。随着生活条件的改善，成年人感染甲肝人数有增多趋势，临床型甲肝比例上升，从而甲肝成为较严重的公共卫生问题。

我国是甲型肝炎高发区，每年至少有24万人患甲型肝炎，造成巨大的经济损失和社会危害，因此，研制并开发有效的预防和治疗甲型肝炎的疫苗和药物成为亟待解决的问题。

目前国内生产的甲型肝炎灭活疫苗，由于各生产厂家使用的毒株、细胞基质和生产工艺不同，产品质量参差不齐。我国人口众多，甲肝疫苗远不能满足国内市场需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的甲型肝炎病毒SH株。

本发明的另一目的是提供甲型肝炎病毒SH株在二倍体细胞上适应的方法。

本发明的还一目的是提供甲型肝炎病毒SH株及其传代后的病毒在制备用于预防、治疗甲型肝炎的疫苗、药物中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种新的甲型肝炎病毒SH株，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.4501，保藏日期2010年12月21日。

该病毒株的分离方法包括以下步骤：

(a)取甲型肝炎急性感染患者粪便30～50g，加入直径为3mm玻璃珠40个和5倍体积的PBS，振荡10分钟；

(b)3000转离心20分钟，收集上清；

(c)将沉淀再按上述方法处理2次，收集并合并3次的上清液；

(d)向上清液中加入PEG600010g/100ml和NaCl 2.3g/100ml，待全部溶解后4℃置数小时；

(e)8000转离心30分钟，弃上清；

(f)沉淀物加50ml PBS重悬，加入等体积氯仿振荡20分钟；3000转离心30分钟，收集上层液相，加入PEG600010g/100ml和NaCl2.3g/100ml，溶解后置于4℃过夜；

(g)次日以8000转30分钟离心弃上清，沉淀物加10ml PBS制成病毒悬液。透析15～18小时，更换透析液PBS3次，再加入10×MEM；

(h)过滤除菌，加1％的P.S.。

其中，所述MEM为0.03％Glu、0.08％NaHCO₃、0.01％青霉素和0.01％链霉素；P.S.为青霉素和链霉素，其中青霉素和链霉素的摩尔比为1∶1。

本发明还提供甲型肝炎病毒SH株在二倍体细胞上适应的方法，包括如下步骤：

1)将MRC-5细胞经常规方法培养，细胞长成单层后接种甲型肝炎病毒SH悬液，40cm²培养瓶种1ml病毒液，37℃吸附2小时，加维持液，35℃培养，每间隔7天更换病毒维持液一次，培养35天，用PBS洗细胞面3次，再用胰酶消化细胞，按0.01ml/cm²培养面积加入MEM悬浮沉淀细胞，得到病毒细胞悬液，超声破碎细胞，制备成病毒悬液；

2)以步骤1)的方法，连续在MRC-5细胞上传传15～22代。

其中，所述维持液为MEM加2％小牛血清。

经上述细胞培养适应后的病毒在进行测试后，可作为疫苗生产备选株。

本发明分离获得的新的甲型肝炎病毒SH株，该病毒抗原滴度可达1∶512-1∶1024，病毒感染滴度可达7.0-8.0lgCCID₅₀/ml，经免疫原性和交叉保护试验，用该毒株生产甲型肝炎灭活疫苗具有良好的免疫原性的保护效果，而且该毒株具有在MRC-5细胞上增殖周期短、繁殖效率高的特点，适合用作大规模工业化生产的甲型肝炎灭活疫苗毒种，是生产甲型肝炎灭活疫苗的理想毒株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1  甲型肝炎病毒毒株SH的分离方法

(a)共采集四份临床甲型肝炎病人(沈阳市第六人民医院肝炎科收治的病人)的急性期粪便30～50g，加入直径为3mm玻璃珠40个和5倍体积的PBS，振荡10分钟；

(b)3000转离心20分钟，收集上清；

(c)将沉淀再按上述方法处理2次，收集并合并3次的上清液；

(d)向上清液中加入PEG600010g/100ml和NaCl 2.3g/100ml，待全部溶解后4℃置数小时；

(e)8000转离心30分钟，弃上清；

(f)沉淀物加50ml PBS重悬，加入等体积氯仿振荡20分钟；3000转离心30分钟，收集上层液相，加入PEG600010g/100ml和NaCl2.3g/100ml，溶解后置于4℃过夜；

(g)次日以8000转30分钟离心弃上清，沉淀物加10ml PBS制成病毒悬液。透析15～18小时，更换透析液PBS 3次，再加入10×MEM；

(h)过滤除菌，加1％的PS。

其中，所述MEM为0.03％Glu、0.08％NaHCO₃、0.01％青霉素和0.01％链霉素。(MEM购自北京清大天一生物技术有限公司，生产批号：080302)。P.S.为青霉素和链霉素，其中青霉素和链霉素的摩尔比为1∶1。

实施例2  甲型肝炎病毒毒株SH在MRC-5细胞上的适应

取含有MRC-5细胞的冻存管，迅速放入40℃水浴中融化，然后加入到预温至30～37℃的MEM细胞培养液中，置于37℃培养，经3-4天长成单层后接种实施例1分离的甲型肝炎病毒毒株SH株悬液，40cm²培养瓶种1ml病毒悬液，37℃吸附2小时，加20ml维持液(MEM加2％小牛血清)，置于35℃培养，每间隔7天更换病毒维持液一次，培养35天，用PBS洗细胞面3次，再用0.125w/v％胰酶消化细胞，按0.01ml/cm²培养面积加入MEM悬浮沉淀细胞，即为病毒细胞悬液，超声破碎细胞，制备成病毒悬液。

按以上方法，将实施例1分离的甲型肝炎病毒毒株SH株连续在MRC-5细胞上传15代，最终获得一株MRC-5细胞适应性好的甲型肝炎病毒毒株。

本发明的甲型肝炎病毒毒株SH的特征为：

病毒颗粒直径：27-32nm；

耐酸性：在pH值3.0条件下，2-8℃作用8小时，感染滴度无明显变化；

耐碱性：经乙醚2-8℃作用8小时，感染滴度无明显变化；

中和试验：被HAV特异性抗体中和；

基因序列分析：与甲型肝炎病毒野毒株HM-175的基因序列同源性高达95.92％，同属I B基因亚型。

抗原滴度：1∶512-1∶1024；

感染性滴度：7.0-8.0lgCCID₅₀/ml；

增值高峰期：21-24天；

最适培养温度：35℃-36℃；

增值部位：细胞胞浆内；

具有甲肝病毒特性。

本发明的不同代次SH毒株抗原滴度及病毒感染滴度如表1所示。

表1  SH毒株不同代次抗原滴度及病毒感染滴度

本发明的SH毒株15代增殖高峰期抗原滴度及病毒感染滴度试验结果如表2所示。

表2  SH毒株15代增殖高峰期试验结果

本发明的SH毒株免疫小鼠试验结果如表3所示。

表3  SH毒株的小鼠免疫原性试验结果

(L-A-1株为对照株，来源于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。)

本发明的SH毒株对其它毒株的交叉保护作用如表4所示。

表4  SH毒株对其它毒株的交叉保护作用

(以上毒株均来源于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。)

实施例3  甲型肝炎病毒毒株SH在制备用于预防、治疗甲型肝炎的疫苗、药物中的应用

取长满单层的细胞工厂培养的人胚肺二倍体细胞(MRC-5)，经0.125w/v％胰蛋白酶-EDTA消化细胞，加入MEM细胞培养液，使细胞浓度为每毫升含100-150万个细胞，细胞液按0.05-0.1MOI加入甲肝病毒在20-30℃温度下进行混合吸附30-90分钟。将混合吸附的细胞-病毒混合液用含10％小牛血清的MEM细胞培养液稀释10倍后按0.5MOI接种于2-40层细胞工厂增殖甲肝病毒，置35℃±0.5℃静置培养21-24天。待病毒增殖高峰期，用0.125w/v％的胰酶常规消化细胞，以每平方厘米面积加入20μl 0.01M pH值7.2的PBS收集细胞病毒混合液。超声破碎细胞病毒混合液，超声破碎为输出功率1500W，每次在冰浴中超声5分钟破碎细胞，共超声5次。破碎后2000rpm离心10分钟取上清病毒液，病毒液加入氯仿抽提，按三氯甲烷与病毒液1∶2的体积比混合，振摇20分钟，以每分钟4500转的速度离心20分钟，吸取上层水相；蛋白相再用抽提缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)抽提4次，抽提4次即能将大部分病毒回收，合并上层水相。抽提液经截留分子量为50-100KD的超滤膜超滤浓缩10-40倍后用Phenyl Sepharose 6FF疏水凝胶层析柱纯化，用0.9mol/L PB(pH6.8)作为上样缓冲液，用0.01mol/L PBS(pH6.8)作为梯度洗脱液，收集病毒洗脱峰，为纯化的甲肝病毒液，再经0.2μm滤膜除菌过滤，在无菌条件下加入终浓度为80μg/ml的甲醛37℃灭活12天。灭活的甲肝病毒液经进一步检验合格后，根据病毒抗原性滴度水平稀释至640EU/ml，经氢氧化铝佐剂吸附制成半成品，将半成品分装于无菌的西林瓶中，制成成品疫苗。

将制成的成品进行小鼠体内效力试验，计算终点稀释度，观察其免疫原性。km小鼠购自中国军事医学科学院病原微生物所，雌雄各半，体重16-18g，随机分组。试验分为8组，每组10只，试验苗4组：分别注射实施例3制备的疫苗；参比苗组：国外甲型肝炎灭活疫苗(购自北京军区疾病预防控制中心，爱巴苏：产品批号：3001424.02)。用疫苗稀释剂将试验苗和参比苗进行4倍系列稀释，共4个稀释度原倍、1∶4、1∶16、1∶64。每只小鼠腹腔注射1.0ml，免疫4周后，眼内眦采血，离心分离血清，-20℃保存备用。采用ELISA竞争抑制法检测抗HAV抗体，按照Reed-Muench法计算终点稀释度。结果如表5所示。

表5  本发明的甲肝灭活疫苗小鼠效力试验结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。