甲型肝炎病毒在人源二倍体细胞的分子进化研究

摘要

本文中,我们将甲肝病毒野毒H<,2>W在人胚肺二倍体细胞KMB<,17>连续传代至30代,在传代的中间代次应用冷适应法变异病毒,然后挑选六个子代病毒进行基因序列分析.对H<,2>W及六个子代病毒的基因组RNA进行RT-PCR扩增,并通过PCR产物直接测序法测定其全长基因组序列.通过对所获序列进行同源性分析,总结甲肝病毒野毒在人源二倍体细胞连续传代过程中的分子进化信息.同时我们将所获序列与HM175、LA等标准病毒株,以及L-A-1、MBB、HAV7等细胞适应病毒株进行进化树分析,以研究甲肝病毒在人源二倍体细胞中的进化方向等.实验结果显示第五代之前绝大多数变异已完成,第5代相比于原代野毒株,共有648个核苷酸发生变异,其中40个导致了氨基酸改变.从第5代到第10代仅发生一个核苷酸变异,位于5'NCR区;第10代到第14代,仅发生一个核苷酸变异,即4222位u/C突变导致Phe/Ser的氨基酸变异;第14代到第15代仅发生一个变异,位于5'NCR区;从第15代到第30代,再未观察到任何变异发生.从变异的热点看,许多与病毒适应细胞相关的热点变异均发生于第5代附近,如128至136位的连续9bp缺失、176至177位的1lbp插入序列,特别是3889位的C/U变异是病毒适应细胞的标志性变异.与毒力相关的热点变异则发生第10代到第14代之间.从病毒基因变异的时序来看,大多数变异完成于第5代附近,其中包括与细胞适应相关的关键变异;第5代到第15代之间仅发生极少量的变异,其中包括位于4222点的U/C变异,这一变异与毒力高度相关,其发生时序为第10到第14代之间;第15代之后的连续传代中病毒基因组表现为高度稳定. 本文所获序列与文献序列进行进化树分析表明,H<,2>W在进化树上趋近于GBM系列,而他的六个子代病毒在进化树上距离其亲本较远,更加接近于L-A-1、MBB等细胞适应株.本文所获得的分子进化的时序、热点、基因稳定性等资料有助于解决活疫苗病毒株育种中相关技术问题,同时对于监测活病毒疫苗株的遗传稳定性等方面的研究均可提供理论支持和技术储备.以甲肝病毒为模型,研究 RNA 病毒在人源二倍体细胞连续适应传代培养中的分子进化,包括进化热点、时序、方向等.方活@2 将甲肝病毒野毒H<,2>W在人源二倍体细胞KMB<,17>中连续传代培养至30代.每隔5代选取其细胞适应子代病毒共六个,用PCR产物直接测序法测定H<,2>W及选定的六个子代病毒的全基因序列.然后用序列分析软件对所获序列进行分析,总结甲肝病毒野毒在长期的细胞连续适应培养中的进化热点、进化时序.通过对所获基因序列与其他已知甲肝病毒株特别是细胞适应株的进化树分析,研究甲肝病毒在人源二倍体细胞中的进化方向.结果1.获得了H<,2>W及其六个子代病毒的接近全长的基因序列,并存入GenBank,录入号分别为:H<,2>w:EF406357;H<,2>K<,5>:EF406358;H<,2>K<,10>:EF406359;H<,2>K<,15>:EF406360;H<,2>K<,20>:EF406361;H<,2>K2<,5>:EF4063 62; H<,2>K<,30>:EF4063632.基于VP1/2A区168bp核苷酸片段的差异性比较,结果表明甲肝病毒野毒在适应KMB<,17>细胞的过程中,其基因亚型由IA转变为IB.3.在H<,2>W适应细胞的前5代,一共有648个核苷酸发生变异,其中有40个导致氨基酸改变.这些变异中包含以下热点变异,如第128至136位的9bp缺失、第176至177位的11bp插入、第5018到.5023位的6bp缺失(导致二个亲水氨基酸Asn、Asp缺失)、第3889位的C/U突变(导致Ala/Val的氨基酸变异)等是甲肝病毒野毒在适应细胞过程中普遍发生的热点变异.在第10代到第15代之间,发生一个毒力相关的热点变异,即4222位发生U/C点突变,该变异导致Phe/Ser的氨基酸突变.4.从原代到第5代,共发生648个核苷酸变异.从第5代到第10代,仅一个核苷酸发生变异,203位缺失1bp.从第10代到第15代,仅二个核苷酸发生变异,其一位于4222位的U/C点突变,导致Phe/Ser的氨基酸突变.另一个则位于5'NCR.区.第15代到第30代,无任何突变发生.绝大多数的变异完成于第5代附近,其中包括与细胞适应相关的热点变异,其后长达25代的连续传代中仅累积发生三个变异,其中包含一个与毒力相关的变异,发生于第10代至第15代之间.5.进化树分析结果显示,H<,2>W在进化树上比较趋向于GBM系列,而他的六个子代病毒则更加趋向于L-A-1、MBB等细胞适应株.他们在进化树上的距离较远. 结论 1.首次观察到病毒在细胞中的完整进化时序:获得了甲肝病毒野毒在人二倍体细胞的进化时序,细胞适应相关基因的变异大约完成于第5代,毒力相关基因的变异介于第10代至15代之间. 2.甲肝病毒野毒适应人二倍体细胞连续传代的特点表现为:快速变异后的稳定遗传.甲肝病毒基因组在人二倍体细胞连续传代中的稳定性极高.进化方向上趋近于其他细胞适应株如MBB、L-A-1. 3 分子进化可用于甲肝病毒的毒力基因定位研究、毒力基因变异条件的研究以及甲肝病毒基因组遗传稳定性研究. 4.甲肝病毒是一个研究病毒分子进化的极有效的模型:可在多种细胞系培养(猴肾、肝瘤细胞、非肝二倍体细胞等等);基因组较小,可方便地进行全基因组序列测定.将甲肝病毒野毒直接适应于人源二倍体细胞以选育一株毒力弱化且免疫原性良好的甲肝减毒活疫苗病毒株.

目录

前言

摘要

第一部分甲型肝炎病毒野毒在人源二倍体细胞连续传代中的分子进化

材料和方法

结果

讨论

结论

主要参考文献

序列表

第二部分甲型肝炎减毒活疫苗病毒株H2K的培育

材料和方法

结果

讨论

结论

主要参考文献

本文的结论及创新

综述活疫苗病毒株的培育方法

攻读博士期间本人完成的论文及参与的课题

致谢