一株米根霉菌株及其诱变筛选方法和发酵生产富马酸的方法

摘要

本发明涉及一株米根霉菌株及其诱变筛选方法和发酵生产富马酸的方法。该菌株分类命名为米根（Rhizopusoryzae）ME-F13，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2010351。得到该菌株的方法是采用离子注入物理诱变处理出发菌株ME-F12，然后将处理后的菌液涂布含2-D-脱氧葡萄糖（2-DG）的选择固体平板上培养，挑取抗2-DG的单菌落同步糖化淀粉质原料发酵制备富马酸。采用此方法筛选到的菌株糖化酶活力得到了提高，在对淀粉质原料不需要进行糖化处理的情况下，能直接利用其发酵，降低生产成本，具有工业化应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株米根霉菌株及其诱变筛选方法和发酵生产富马酸的方法，具体涉及同步糖化发酵淀粉质原料的富马酸生产菌，以及获得该菌株诱变筛选方法和利用该菌株以淀粉质为原料生产富马酸的方法。

背景技术

富马酸（Fumaric acid）作为一种重要的有机基本化工原料和大宗化工产品，广泛应用于涂料、树脂、医药、增塑剂、食品添加剂等领域，具有重要的市场价值。同时，以富马酸为原料可以进一步合成多种高价值衍生物，如富马酸二甲酯（DMF）、富马酸亚铁等。另外，富马酸作为一种重要的四碳平台化合物，还可以通过酶催化转化、酯化、加氢等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、1,4-丁二醇、γ-丁内酯和四氢呋喃等四碳化合物。

目前工业上生产富马酸主要采用化学法，在催化剂的存在下，将苯或丁烯氧化生成顺丁烯二酸或顺丁烯二酸酐，再经异构化而得富马酸，其所面临的主要难题是化石资源的短缺、生产成本的提高以及对环境的污染。20世纪70年代石油危机的出现，使得人们加大了对微生物发酵法制备富马酸的研究力度，人们用来发酵制备富马酸的微生物有霉菌、酵母及细菌。其中根霉菌具有养要求简单、环境适应能力强以及生长迅速等特点，又是重点研究的对象，如米根霉、少根根霉以及黑根霉等。而其中米根霉（Rhizopus oryzae）作为富马酸生产的最佳菌株之一，广泛受到关注。

但目前发酵法生产富马酸并未实现工业化，其主要原因是原料费占富马酸生产的很大一部分，降低原材料成本成为生物法制备富马酸的唯一出路（Gangl IC, Weigang WA, Keller FA. Appl Microbiol Biotechnol, 1990, 24-25(1):663-667），而传统的工艺利用廉价的淀粉质原料来生产富马酸的产量都很低（Moresi M, Parente E, Petruccioli M, Federici F J. Chem Tech Biotechnol, 1992, 54(3):283-290; Carta FS, Soccol CR, Ramos LP, Fontana JD. Bioresour Technol, 1999, 68(1):23-28），因此针对底物谱的扩宽来改良菌株成为首要工作。研究表明，2-D-脱氧葡萄糖（2-DG）作为葡萄糖的结构类似物，是菌体进行水解酶（糖化酶、纤维素酶、木聚糖酶，β-葡糖苷酶）合成的分解代谢阻遏物，因而常用来筛选抗分解代谢阻遏的糖化酶高的突变株（Ghosh A, Chatterjee B, Das A Biotechnol Lett, 1991, 13(7):515-520; Sarangbin S, Kirimura K, Usami S, Appl Microbiol Biotechnol, 1993(2-3), 40:206-210; Chandra M, Kalra A, Sangwan NS, Gaurav SS, Darokar PM, Sangwan SR. Bioresour Technol, 2009, 100(4):1659-1662）。如果能提高米根霉自身的糖化酶活力，在不需对淀粉质原料进行糖化预处理的情况下，就能同步糖化发酵淀粉质原料来生产富马酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种能同步糖化发酵淀粉质原料生产富马酸的米根霉。

本发明的另一个目的是提供该米根霉菌株的诱变筛选方法。

本发明的另一个目的是提供该米根霉发酵生产富马酸的方法。

本发明目的是通过下列技术方案实现的：

一、一株米根霉菌株，其分类命名为Rhizopus oryzae ME-F13，保藏日期为2010年12月16日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NO：M 2010351；所述的Rhizopus oryzae ME-F13能以淀粉质原料为碳源，采用同步糖化工艺发酵生产富马酸。

二、本发明所述的Rhizopus oryzae ME-F13的诱变筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将米根霉出发菌株Rhizopus oryzae ME-F12（ME-UN-8）进行离子注入物理诱变，得到突变株；

2）将上述步骤1）获得的突变株菌液涂布于含有2-D-脱氧葡萄糖的选择性固体培养基平板，培养，得到耐受2-D-脱氧葡萄糖的米根霉；

3）对步骤2）所得的耐受2-D-脱氧葡萄糖的菌株的抗性稳定性进行考察，挑取单菌落以可溶性淀粉为碳源进行摇瓶发酵，最终选定其中一株糖化酶活力及富马酸的产量比原始菌株增加最多的菌株，命名为Rhizopus oryzae ME-F13。

其中，步骤1）所述的离子注入物理诱变方法，其中离子注入条件是采用15KeV N⁺注入诱变，注量为50×10¹³～300×10¹³/cm²，靶室真空度为10^-3 Pa。

其中，步骤2）所述的方法中含2-D-脱氧葡萄糖的选择性固体培养基中2-D-脱氧葡萄糖的浓度为0.2～0.6 g/L。

其中，步骤3）所述的方法中含2-D-脱氧葡萄糖的选择性固体培养基中碳源为甘油，其浓度为30 g/L，其他营养成分组成：尿素为2 g/L，KH₂PO₄为0.6 g/L，MgSO₄·7H₂O为0.5 g/L，ZnSO₄为0.11 g/L，FeSO₄·7H₂O为0.088 g/L，琼脂为20 g /L。

三、利用本发明所述的Rhizopus oryzae ME-F13同步糖化发酵生产富马酸的方法：将Rhizopus oryzae ME-F13孢子悬浮液接种于种子培养基培养后，接种到发酵培养基中利用菌株自产的糖化酶同步糖化发酵生产富马酸；其中种子培养基和发酵培养基的碳源是淀粉质原料液化液。

具体地，将经斜面培养6～7天的Rhizopus oryzae ME-F13用无菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液，接种于种子培养基中，在30～40℃、pH 2.0～2.7条件下培养28～32 h，再将种子按照5%～10%的接种量接种到发酵培养基中，在30～40℃条件下培养60～85 h；其中种子培养基和发酵培养基是由淀粉质原料液化液与无机盐成分混合后，分别在115～121℃条件下灭菌15～20 min，冷却后混合得到，发酵培养基中另外添加CaCO₃作为中和剂。

其中，淀粉质原料液化液的制备方法是：淀粉质原料与水以8-12%的比例混合成糊状后，加热到70 ℃，再加入耐高温淀粉酶，加酶量为800～1000 U/g干淀粉质原料，保温10 min后继续加热到90℃，碘检不变色后继续加热到100℃煮沸5～10 min，然后趁热经过两层纱布过滤，滤液冷却后加水调整糖度，制成淀粉质原料液化液。

本发明的有益效果在于：

本发明以富马酸生产菌米根霉Rhizopus oryzae ME-F12（ME-UN-8）为出发菌株，采用上述方法筛选得到的能同步糖化发酵淀粉质原料的富马酸生产菌突变株Rhizopus oryzae ME-F13，该突变株自身的糖化酶活力得到很大提高，大约是原始菌株的2.5倍，利用该突变菌株以淀粉质原料生产富马酸时，采用不需另外添加商品糖化酶的同步糖化发酵工艺。以淀粉质原料液化液为底物，利用菌株自身产生的糖化酶同步糖化发酵，此工艺不仅具有同步糖化工艺的优点，如减轻了高浓度底物的抑制作用、节省发酵时间和设备投资，而且解决了同步糖化中糖化酶活力和发酵条件（温度，pH）相冲突的问题，具备优异的工业化生产前景。

附图说明

图1为筛选菌株富马酸产量对比图。

具体实施方式

一般性说明：

本发明所述的淀粉质原料液化液的制备方法：淀粉质原料与水以8-12%的比例混合成糊状后，加热到70℃，加入耐高温淀粉酶，加酶量为800 U/g干淀粉质原料，保温10 min后继续加热到90℃，碘检不变色后继续加热到100℃煮沸5～10 min，然后趁热经过两层纱布过滤，滤液冷却后加水调整糖度，制成淀粉质原料液化液。

溴甲酚绿固体培养基：溴甲酚绿 0.2 g/L，脱胆酸钠1.0 g/L，可溶性淀粉80 g/L，尿素1 g/L，KH₂PO₄ 0.6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，ZnSO₄ 0.11 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.088 g/L，琼脂 20 g/L。

2-D-脱氧葡萄糖-甘油选择性固体培养基：2-D-脱氧葡萄糖0.2 g/L，甘油30 g/L，尿素2 g/L，KH₂PO₄ 0.6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，ZnSO₄ 0.11 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.088 g/L，琼脂20 g /L。

2-D-脱氧葡萄糖-葡萄糖选择性固体培养基组成：2-D-脱氧葡萄糖0.6 g/L，葡萄糖30 g/L，尿素2 g/L，KH₂PO₄ 0.6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，ZnSO₄ 0.11 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.088 g/L，琼脂 20 g /L。

种子培养基1组成：可溶性淀粉30 g/L，尿素2 g/L，KH₂PO₄ 0.6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，ZnSO₄ 0.11 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.088 g/L，pH2.5～2.7。

种子培养基2组成：全玉米粉、脱胚玉米粉或木薯粉 30 g/L，pH2.5～2.7。

发酵培养基1组成：可溶性淀粉80 g/L，尿素0.1 g/L，KH₂PO₄ 0.6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，ZnSO₄ 0.11 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.088 g/L，CaCO₃ 40 g/L。

发酵培养基2组成：全玉米粉、脱胚玉米粉或木薯粉80～120 g/L，CaCO₃ 40 -60g/L。

富马酸的HPCL的测定方法：富马酸是采用DIONEX summit P680 高效液相色谱仪测定。色谱柱为Aminex HPX-87H柱（Bio-Rad），柱温：65℃紫外检测波长 210 nm，流动相为5 mmol/L H₂SO₄，流速为0.8 mL/min，进样量为20 μL。

实施例1：离子注入诱变处理米根霉

取培养5～6天孢子颜色多而且黑的米根霉Rhizopus oryzae ME-F12（CCTCC NO: M 207023）斜面（斜面培养基即为PDA固体培养基）一支，用无菌水洗脱孢子，接于已经灭菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，35℃及200 rpm充分振荡30 min，使孢子均匀分散，用灭过菌的脱脂棉、两层纱布或两层檫镜纸过滤，制成孢子悬浮液，用血球计数板在显微镜下直接计数，调整孢子浓度为10⁷个/mL，作为待处理菌液，取0.1 mL待处理菌液，均匀涂布于无菌条件下室温风干。然后将这些孢子培养皿放入离子注入机内，靶室抽真空至10^-3 Pa，选用15 KeV N⁺，50×10¹³～300×10¹³/cm²剂量，靶室真空度为10^-3 Pa对这些孢子进行处理。然后取出培养皿，以1 mL无菌水洗脱，调整孢子浓度为10⁶备用。

实施例2：菌种筛选

初筛：取100 μL经过离子注入诱变后所得孢子悬浮液涂布于2-D脱氧葡萄糖-甘油选择性固体培养基进行培养2～3 d。

挑取在2-D-脱氧葡萄糖-甘油选择性固体培养基中存活的单菌落，用打孔器将其移入溴甲酚绿固体培养基进行第二次初筛。米根霉生长过程中产生的富马酸可以使菌落周围的培养基出现黄色的变色圈，通过测量变色圈直径与菌落直径，计算两者比值，选取比值较大的菌株转接到2-D-脱氧葡萄糖-葡萄糖选择性固体培养基，经连续培养5代，都能生长且产孢的的菌株，转接至PDA斜面上保藏，进行复筛。

摇瓶复筛：经过第一轮的初筛，得到14株抗2-D-脱氧葡萄糖的突变株，将其按实例1方式制成孢子悬浮液，以2%的接种量接种于种子培养基1，置于转速为220 rpm的摇床上，35℃培养30 h后，将所得的种子以10%的接种量接入发酵培养基2，置于转速为220 rpm的摇床上，35℃培养60～85h，测其最终富马酸的产量，其结果如图1所示，其中5株同步糖化发酵可溶性淀粉的富马酸产量比出发菌株高出10%以上，分别为DG-3，DG-6，DG-8，DG-12，DG-14。

实施例3：突变株与原始菌株的发酵性能的比较

将经斜面培养6～7天的产酸量最高的突变株DG-3用无菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液，接种于种子培养基1中，在35℃、200 rpm、pH 2.5条件下培养30h，再将种子按照10%的接种量接种到发酵培养基中，在35℃、200 rpm条件下培养85 h，发酵结束后，测其糖化酶和富马酸的产量，实验设三次重复，其平均结果如表1所示。结果表明在相同的发酵条件下，菌株Rhizopus oryzae ME-F12（ME-U

N-8）经诱变处理和筛选后，得到的一株突变株DG-3的糖化酶活力比原始菌株增加了156%，富马酸的产量高达39.80 g/L，比原始菌株增加了28%。

将编号为DG-3的菌株分类命名为Rhizopus oryzae ME-F13，并保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC M 2010351。

实施例4 利用Rhizopus oryzae ME-F13以粗淀粉质原料同步糖化发酵生产富马酸

将经斜面培养6天的Rhizopus oryzae ME-F13用无菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液，接种于种子培养基2中，在35℃、200 rpm、pH 2.5条件下培养30 h，再将按照10%的接种量接种到发酵培养基2的5 L发酵罐中，于35℃，1 vvm的通气比率、400 rpm的搅拌转速下培养85h，分别以不同的粗淀粉质原料如全玉米粉、脱胚玉米粉、木薯粉利用Rhizopus oryzae ME-F13进行同步糖化发酵，结果见表2。

实施例5 利用Rhizopus oryzae ME-F13以粗淀粉质原料同步糖化发酵生产富马酸

本实施例的发酵方法同实施例4，其中：

将经斜面培养7天的Rhizopus oryzae ME-F13用无菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液，接种于种子培养基中，在40℃、200 rpm、pH 2.7条件下培养28h，再将按照8%的接种量接种到发酵培养基2的5 L发酵罐中，在40℃、1 vvm的通气比率、400 rpm的搅拌转速下培养60h。结果见表3。

实施例6 利用Rhizopus oryzae ME-F13以粗淀粉质原料同步糖化发酵生产富马酸

本实施例的发酵方法同实施例4，其中：

将经斜面培养7天的Rhizopus oryzae ME-F13用无菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液，接种于种子培养基中，在30℃、200 rpm、pH 2.6条件下培养32h，再将按照5%的接种量接种到发酵培养基2的5 L发酵罐中，在30℃、1 vvm的通气比率、400 rpm的搅拌转速下培养72h，结果见表4。