一种基于微狭缝结构的全PDMS微流控细胞捕获芯片及其制法

摘要

一种双层结构细胞捕获芯片，它是基于微狭缝结构的全PDMS微流控细胞捕获芯片，它由上、下两片固化的聚二甲基硅氧烷薄片构成，在聚二甲基硅氧烷薄片中分别制作有不同尺寸及形状的微型通道，上下两层通道沿边缘相互平行交错，通道对准键合的方法形成10±5μm狭缝，狭缝长度及数量可通过不同通道组合和对准方法进行调控，从而可对捕获细胞的数量进行控制。该芯片通过流体动力学原理，利用狭缝结构阻挡细胞形成对有限数量细胞的捕获，同时可通过调整流体压力控制释放细胞，实现对细胞的重复捕获。该芯片采用常规的芯片制作方法，实现对单个及多个细胞的捕获和释放，同时可集成微电极对捕获细胞进行实时监测。本发明公开了其制作方法和过程。

说明书

技术领域

本发明涉及PDMS微流控细胞捕获芯片及微流控细胞捕获控制。

背景技术

细胞是非常微小的具有独特生命活动的基本单元，传统的细胞研究通常以大量细胞样本为对象，期望获得同类细胞的普遍性质。然而，即使是同一类型的细胞之间也或多或少存在差异，因此这种分析实际上仅能提供整体细胞样本的平均响应，而忽略了单一细胞及细胞之间的详细信息。细胞行为的异质性无论对于细菌还是动物真核细胞都是其固有性质，在细胞生长、分化及感染等所有复杂生物事件中也是普遍存在的。因此，在生物及化学研究中，对实验条件的可控化，尤其是对于单细胞的控制，将有助于科学家对细胞调控机制和分子水平相互作用等基本生命过程的理解，也一直是推动科技不断发展的强大动力。目前，最成功的单细胞捕获及操纵当属膜片钳和激光光镊技术。前者是通过负压将一个单细胞捕获在单根玻璃微电极吸管端口，并用于记录细胞膜离子通道分子活动的单细胞分析技术。激光光镊技术是利用一束高度汇聚的激光形成的三维势阱来俘获和操控细胞、细胞器甚至生物大分子等大多数生物微粒。但这两种技术均需复杂仪器，且效率太低。

近些年发展起来的微流控技术或芯片实验室技术为细胞操控及分析提供了新的发展思路。基于微尺度下不同的物理化学原理，科学家已发展出具有各种功能和不同应用的微流控细胞芯片。作为细胞后续分析及研究的基本前提，细胞的分离和捕获，尤其是单细胞尺度上，几乎在所有微流控细胞分析装置中都是重要一环。目前，用于芯片上细胞分离和捕获的手段涉及光、电、声、磁、流体力学、机械加工以及化学方法等众多领域，主要分为接触式和非接触式两种。光、电、声、磁等作用都为非接触式。光学手段是激光光镊技术与芯片技术的结合，利用了多数芯片如玻璃、PDMS及其他高分子材料的透明特性，它可实现单细胞捕获和操控，但其涉及仪器复杂，操控单一，限制较多。电学方法是与微流控芯片最成功的结合手段，不仅有利于仪器集成，且有多种作用方式，如电渗、电泳、介电电泳（nDEP, pDEP）等方式，不仅可进行群体细胞的捕获和分离， 还可实现单细胞捕获。但是这种方式往往需要在芯片上集成精细电极，需要复杂的电源控制；另外，电压对细胞活性及溶液体系都有不利的影响。声学和磁学是新兴的非接触式细胞控制手段，但其控制效果有限，很难实现单细胞捕获和操控。化学方法作为一种选择性强，生物兼容性好的方法在微流控芯片上的应用日益广泛。它往往结合微机械加工手段通过化学修饰实现区域化的细胞粘附和结合，可达到单细胞选择性捕获，通常用于细胞培养、免疫分析等，但其捕集效率较差，控制力较弱，且需要复杂的化学修饰处理。还有一种化学方法是利用水凝胶包裹细胞形成捕获，这种方法作用温和，但其可操作性较差。微机械加工技术结合流体力学控制用于整体及单个细胞样本的捕获是目前最有效的细胞固定方式。这种技术往往通过加工尺寸与细胞相匹配的微井、微孔、微坝、微狭缝及微管道等几何陷阱或障碍来捕获细胞，不仅可形成开放阵列体系，还可以在微通道中实现对细胞的控制。这种方法无需其他控制手段和仪器，对细胞无损伤，可兼容其他分析或控制方法，可在单细胞尺度上研究其刺激响应、相互作用以及迁移、分化、凋亡等生理过程，尤其适用于对悬浮细胞进行研究。其缺点是对微加工技术要求较高，在普通化学实验室中难以实现。

因此，探寻一种简单通用的，采用常规加工手段即可实现的芯片制作方法，及在普通实验室中即可实现的高效率、高分辨率的细胞捕获方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于避免昂贵设备及精细未加工手段的使用，而提供一种制作简单的、高效通用的微流控细胞捕获方法，用于拓展普通实验室中对细胞进行研究的有效手段。

本发明的目的通过如下措施来达到：

一种双层结构的细胞捕获芯片，它是基于微狭缝结构的全聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控细胞捕获芯片，它由上下两片固化的聚二甲基硅氧烷薄片构成，，在聚二甲基硅氧烷薄片上分别制作有不同尺寸及形状的微型下凹通道，上、下两片聚二甲基硅氧烷叠合时，使上、下两层通道沿边缘相互平行交错，形成10±5μm的单个或多个狭缝，该狭缝用于阻挡细胞形成对有限数量细胞的可控捕获。

上述的双层结构细胞捕获芯片，所述的通道狭缝可以通过通道对准键合的方法制得。

上述的双层结构细胞捕获芯片，所述的通道狭缝长度及数量可以通过不同通道组合和对准方法进行调控。

上述的双层结构细胞捕获芯片，可通过调整狭缝的长度和大小对捕获细胞的数量进行控制，可形成从单个细胞到几十个细胞的有效捕获。

上述的双层结构细胞捕获芯片，可利用流体动力学原理对细胞进行捕获，并可在捕获后通过出入口的压力控制释放细胞，从而可重复进行细胞的捕获操作。

一种制作上述的双层结构细胞捕获芯片的方法，它包括下列步骤：

步骤1. 玻璃通道制作：玻璃芯片通道采用标准光刻和化学湿法刻蚀技术制备。采用商品化匀胶铬版，根据通道设计图案进行光刻，蚀刻深度为30-50 μm；

步骤2. 制作上下两层聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道薄片：以上述玻璃芯片为阴性模板，在其上浇铸一定量PDMS，加热固化，剥离后即得具有相应阳模结构的PDMS芯片，将此PDMS阳模经空气等离子体处理后，迅速在表面旋涂质量百分浓度为0.1~0.5%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，并于红外灯下烘干，以此PDMS芯片为阳性模板，在其上浇铸聚二甲基硅氧烷，固化后可轻松剥离，即可得到与刻蚀玻璃芯片通道一致的PDMS芯片；

步骤3. 狭缝制作与芯片键合：将制作好相应通道的上下两片PDMS芯片同时经等离子体处理，迅速在其上滴加数滴去离子水，然后将上片盖在下片上，此时由于水的存在，两片PDMS可相互顺利滑动，将两层上的微通道平行对准，使其形成整条或部分长度的狭缝，在显微镜下调整狭缝宽度使之不超过15μm(小于相应细胞尺寸)，用滤纸吸去大部分多余水分，保持上下两层芯片位置并置于红外灯下烘干，约30min后即可键合稳固而得到狭缝捕获芯片，狭缝长度可根据对准管道部分进行调整，上片需预留上下两层通道的出入口以进行进样操作和压力调整。

上述的制作双层结构细胞捕获芯片的方法，所述的步骤3可以进行通道组合与狭缝调控：可采用不同构型的微通道进行组合形成不同长度的狭缝，用于调控捕获细胞的数量；可采用直线通道组合形成较长狭缝，从而形成细胞的直线排列；也可采用点状通道组合或直线与点状通道组合形成多个捕获狭缝，实现对少量细胞的捕获；同时，由于可通过上下两片PDMS的滑动灵活控制通道的对准位置，可采用合适的点状通道组合，交叉对准形成微小狭缝，对单个细胞进行捕获。

本发明的双层细胞捕获芯片可方便地对单个及多个细胞进行捕获和释放，其步骤为：

在上层通道入口处注入细胞悬液，由于液体静压力的差别，细胞跟随溶液流向出口并向下层管道形成分流，受狭缝阻挡，细胞沿流动方向不断在狭缝上排列聚集形成捕获，多余细胞随悬液从出口排出；保持压力作用，还可对捕获细胞进行清洗等操作。

将样品溶液自入口吸出，在下层通道出入口注入缓冲溶液，使液体压力反向，即使溶液反向流过狭缝，可释放捕获的细胞，并从上层通道出口排出，从而可重复对细胞进行捕获和释放。

本发明的具体效果如下：本发明方法通过简单的芯片制作方法，利用微通道对准键合方法制作可用于捕获少量细胞的狭缝结构。与传统的利用流体动力原理和微结构的芯片上细胞捕获技术相比，该发明具有以下优点：1、制作方法简单、可靠，成本低廉，采用全PDMS材质及水润滑键合方法，不需过多修饰步骤；2、无需超净室，无需精密微加工仪器及手段，仅利用传统刻蚀方法即可形成适用于细胞尺寸的狭缝结构，普通化学实验室中即可实现，便于普及；3、该方法制得结构可方便调整，实现从单个细胞到数十个细胞的捕获和排列，捕获效率高，控制简便；4、该芯片为软质芯片，同时PDMS材质使得后续修饰及集成操作简单可行，还可制作集成微电极用于对细胞进行实时监控和分析检测。

附图说明

图1. PDMS微通道芯片制作示意图；

图2 狭缝制作及芯片集成示意图。（a）下层PDMS芯片微通道；（b）上层PDMS芯片微通道；（1）PBS缓冲溶液入口；（2）PBS缓冲溶液出口；（1’）细胞溶液入口；（2’）细胞溶液出口；

图3. 细胞捕获及狭缝调控。（a，e）直线通道组合；（b，f）点状通道、直线通道组合；（c，g）直线通道、点状通道组合；（d，h）点状通道、点状通道组合；

图4. 少量细胞捕获及单细胞捕获。（a）点状对应狭缝—多个细胞捕获；（b）点状交错狭缝—多个细胞捕获；（c）点状交错狭缝—单个细胞捕获。

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明作进一步说明。

实验过程中使用的水均为二次蒸馏水，实验所用试剂包括磷酸氢二钠， 磷酸二氢钾，氯化钾，氯化钠，聚乙烯醇等均为分析纯。所用细胞为人胃癌细胞株（BGC-823）。

实施例1. 双层结构细胞捕获芯片的制作：

1. 采用如图1所示的方式制备PDMS微通道芯片。

步骤1. 玻璃通道制作：玻璃芯片通道采用标准光刻和化学湿法刻蚀技术制备。采用商品化匀胶铬版，根据通道设计图案进行光刻，蚀刻深度为30-50 μm；

步骤2. 制作上、下两层聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道薄片：以上述玻璃芯片为阴性模板，在其上浇铸一定量PDMS，加热固化，剥离后即得具有相应阳模结构的PDMS芯片。将此PDMS阳模经空气等离子体处理后，迅速在表面旋涂质量百分浓度为0.1~0.5%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，并于红外灯下烘干，以此PDMS芯片为阳性模板，在其上浇铸一定量PDMS，固化后可轻松剥离，即可得到与刻蚀玻璃芯片通道一致的PDMS芯片。

2.      采用如图2所示的方式制备狭缝及集成细胞捕获芯片

步骤3. 狭缝制作与芯片键合：将制作好相应通道的上下两片PDMS芯片同时经等离子体处理，迅速在其上滴加数滴去离子水，然后将上片盖在下片上，此时由于水的存在，两片PDMS可相互顺利滑动，将两层上的微通道平行对准，使其形成整条或部分长度的狭缝，在显微镜下调整狭缝宽度使之不超过15μm(小于相应细胞尺寸)，用滤纸吸去大部分多余水分，保持上下两层芯片位置并置于红外灯下烘干，约30min后即可键合稳固而得到狭缝捕获芯片。狭缝长度可根据对准管道部分进行调整，上片需预留上下两层通道的出入口以进行进样操作和压力调整。

步骤4. 通道组合与狭缝调控：可采用不同构型的微通道进行组合形成不同长度的狭缝，用于调控捕获细胞的数量。可采用直线通道组合形成较长狭缝，从而形成细胞的直线排列；也可采用点状通道组合或直线与点状通道组合形成多个捕获狭缝，实现对少量细胞的捕获。同时，由于可通过上下两片PDMS的滑动灵活控制通道的对准位置，可采用合适的点状通道组合，交叉对准形成微小狭缝，对单个细胞进行捕获。

实施例2. 采用双层结构细胞捕获芯片，对细胞的捕获和释放：

为了表征该芯片对细胞的捕获效果，我们采用不同的通道组合制作微狭缝，对悬浮BGC-823 细胞样品进行了捕获，结果如图3所示。其步骤为：

步骤1. 在上层通道入口处注入细胞悬液，由于液体静压力的差别，细胞流向溶液向出口并向下层管道分流，受狭缝阻挡，细胞沿流动方向不断在狭缝上排列聚集形成捕获，多余细胞随悬液从出口排出；保持压力作用，还可对捕获细胞进行清洗等操作。

步骤2. 将样品溶液自入口吸出，在下层通道出入口注入缓冲溶液，使液体压力反向，即使溶液反向流过狭缝，可释放捕获的细胞，并从上层通道出口排出，从而可重复对细胞进行捕获和释放。

实施例3. 采用双层结构细胞捕获芯片，捕获数个细胞或单个细胞：

为了表征该芯片对少量细胞的捕获性能，我们采用减小狭缝长度及采用交错键合的方式对数个及单个细胞进行了捕获，结果如图4所示。