一种肿瘤靶向治疗药物载体、其制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种可通过静脉注射全身性给药的药物载体和制备方法及其应用于肿瘤基因治疗的技术，属于肿瘤靶向治疗领域，本发明的载体是由DOTAP或其类似物与卵磷脂或其衍生物按摩尔比20∶(7-13)组成的一种新型脂质体，它能与生物活性物质形成稳定的复合物，并能将这些活性物质定向高效携带到体外培养和人体内部的靶细胞内；本发明的复合物具有较大的包载量，并且颗粒粒径大大减小，即优化到200nm及以下，在高血清浓度的环境下保持了很高的转染效率，当本发明的载体包裹携带抑癌基因或细胞自杀基因DNA等，形成的复合物就可靶向运送到体外培养、离体和体内的肿瘤细胞内，达到对肿瘤进行基因治疗的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤的基因治疗技术，特别涉及一种可全身性给药的人类肿瘤靶向基因治疗药物的载体、其制备方法以及应用。

背景技术

目前，在肿瘤治疗中，由于绝大多数生物活性物质即肿瘤治疗药物都缺乏将自己送入细胞内的能力。所以直接给药存在生物利用度低、细胞毒性大等缺点，为了克服这些缺点，人们研究了大量载体。随着对许多疾病在基因水平分子机理的了解，基因治疗成为治疗许多疾病尤其是恶性肿瘤最有前途的途径，即用各种载体包裹核酸等生物活性物质并携带到达用药靶点进行转导和表达，从而进行肿瘤的靶向治疗。载体目前一般分为病毒载体(如逆转录病毒和腺病毒)和非病毒载体(如阳离子聚合物和囊泡)。早期遗传修饰的病毒成为基因载体的焦点，但是在本世纪初基于病毒的基因转送方法出现安全性和有效性的障碍后，科学界对纳米粒子载体系统的兴趣迅速增长。现行非病毒载体系统可分为阳离子脂质体，DNA-多聚体结合物和裸DNA几类。这几类中，利用阳离子脂质体作为载体转送DNA等核酸类活性物质的基因治疗是研究的热点。

真核细胞最外层是细胞膜，它是一种由双极性脂质分子形成的双层结构，它通过抑制周围环境中化合物的被动渗透保护细胞。它的组成成分主要有三大类：磷脂、糖脂和胆固醇。由于独特双极性的结构，在水溶液中它们都可自发产生脂肪滴。这些脂肪滴被称为脂质体，1961年由Bangham和R.W.Home博士发现其与天然的细胞膜结构非常相像。后来，人们进一步发现脂质体可以和细胞膜融合并将其内含物注入到细胞内。从此，脂质体作为药物的载体广泛应用，如，呼吸道疾病的气溶胶治疗；抗癌药物如Doxorubicin(Doxil)，Camptothecin和Daunorubicin(Daunoxome)目前市场上都有脂质体剂型的出售。

人们不断研究发现，DOTAP，即1，2-二(油酰氧基)-3-(三甲基铵)丙烷，以及它的类似物，由于通过修饰增加的净正电荷以及脂质结构的类似，可以通过与细胞膜融合将DNA转送进入培养的细胞。电荷变化的修饰使得阳离子脂质与带负电荷的细胞膜接近，保证脂质体和细胞膜之间发生主动融合，将物质注入细胞，从而被广泛用于肿瘤药物尤其是基因药物载体。但是，这种电荷的改变也激活动物免疫系统的防卫机制。DOTAP脂质体在50％以上血清浓度情况下，被细胞摄入的作用完全失效。

为了解决DOTAP及其类似物在血清尤其是高血清浓度的条件下作用失效的问题，首次由Gao和Huang于1991年采用胆固醇作为辅助脂用来克服血清的抑制作用。他们建议使用胆固醇与DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺)混合在体内尤其有效。胆固醇使得脂质体的脂质双层结构稳定，已经广泛应用于纤维化囊肿的临床试验。1995年Liu等用阳离子脂质DDAB(dimethyldioctadecyl ammonium bromide)与胆固醇以1∶1摩尔比制成的脂质体，通过静脉注射介导了CAT(氯霉素乙酰转移酶)报告基因的高水平表达。1997年Templeton等通过静脉注射用Dotap∶胆固醇(摩尔比1∶1)将CAT报告基因运送到小鼠组织中，他们发现转基因在不同组织中有差异性的表达，而绝大多数基因表达积累在小鼠的肺和肝组织，(Templeton等，1997)。

血清对阳离子脂质体介导基因转染的抑制作用非常复杂，目前还没有完全搞明白。对于任何在人血液中工作的运送系统，80％-100％的正常生理血清浓度是首先需要克服的障碍。胆固醇已经被证明在体内转移中可能是有效的的辅助脂质。体外在80％-100％血清浓度的条件下(人类血液的生理条件)转染培养细胞，可以代替动物评价脂质体在血清中的稳定性和转染效率。在高血清浓度的条件下阳离子脂质DNA复合物转染效率的优化，可用DC复合物在小鼠体内高效转导率来判断鉴定。

L-α-卵磷脂是细胞膜的主要结构分子，无免疫原性。在脂质体的形成中作为活性成分，可以单独或作为辅助脂质形成脂质体。辅助脂质对实现脂质体的特殊应用目的具有重要的意义。如，，胆固醇可以保护脂质体包裹的物质免遭血清降解，协助靶向选择等。但通常辅助脂质对脂质体的包装能力有不利的影响。除了一个为正电荷头部，另一个为中性头部基团外，DOTAP与L-α-卵磷脂之间有非常相似的疏水链，确保了两种物质以任何摩尔比都能均匀混合。传统的研究中，是用DOTAP加入到卵磷脂中以增加转染效率，但总的说来，正如Templeton证明的那样，体内的转染率并不高。加入少量(5％)DOPS到DOTAP∶胆固醇(50∶45)中，形成DOTAP∶胆固醇∶DOPS(50∶45∶5)脂质体，体内基因的表达剧烈下降，用DOPC代替胆固醇后，体内基因的表达几乎完全消失。许多研究工作测试卵磷脂及其衍生物如DOPS(Dioleoyl Phosphatidylserine)、DOPC(Oleoyl Phosphatidylcholine)、DOPE(Dioleoylphosphatidyl-ethanolamine)与DOTAP以1∶1摩尔比形成的脂质体，认为它们并不适合体内的基因转染。就在最近的2009年仍有报道采用L-α-卵磷脂及其衍生物与DOTAP及其类似物组成的混合物作为载体，其中，DOTAP与L-α-卵磷脂的摩尔比采用1∶1传统的阳离子脂质和中性辅助脂质配比的模型。DOTAP:卵磷脂在上述的研究中更多地是作为阴性对照在应用，而没有作为一个基因载体的候选。虽然L-α-卵磷脂及其衍生物与DOTAP及其类似物的组合具有比DOTAP与胆固醇的组合更好的包装能力，但正如Templeton等所提到的，这样的组合，由于较大的卵磷脂头部基团阻碍了DOTAP较小头部的阳离子的暴露，反而对脂质体复合物的转染有相反的影响，体内基因转移几乎完全被排除。而且，由于卵磷脂的加入使得脂质体复合物膨胀很多，粒径超过300nm(Templeton等，2009)。卵磷脂及其衍生物作为辅助脂质提高脂质体体内转染率在相关的美国专利申请中被否定(如美国专利号为US6413544和US6770291的美国专利)。而我们从脂质体形成的原理分析L-α-卵磷脂及其衍生物与DOTAP及其类似物的组合之所以被否定，可能是由于卵磷脂加入的量和比例不合适造成的，如果要进一步提高载体的靶向性、载体包覆药物后的血清稳定性以及生物利用度等，需要对载体比例作进一步探索。

另外，载体装载生物活性物质后形成的复合物的大小对于全身性转送是非常重要的(Uchiyama等，1995；Ishida等1999)。例如，由于血管-增强性渗透和滞留效应(EPR)，粒径100nm到150nm的脂质体表现出特异聚集在肿瘤组织的特性。所有健康人类血管的内皮壁被紧密连接在一起的内皮细胞密封。这种紧密的连接阻止血液中任何大颗粒渗漏出血管。肿瘤血管细胞之间不具备这种密封水平的连接，具有特征性的漏洞。这种特性被称为增强性渗透和滞留效应。特定大小的脂质体，尤其是粒径在90-250nm范围的，可以迅速从血管进入肿瘤部位，但遇到健康组织血管的内皮壁它们被保留在血液中(Zhang等，2008)。而采用目前的声波和/或挤压法制备的复合物一般粒径在300nm以上，所以控制载体的大小以及载体装载生物活性物质后的大小非常重要。

当阳离子脂质体与DNA混合，正离子电荷的脂质体和负离子电荷的DNA等核酸类活性物质互相电力的吸引，看得见的封装转换马上开始，整个过程在几秒钟内完成。包裹装载的脂质体体积在这个转化过程中膨胀。质粒DNA比起大多数的小分子药物为大分子。由于复合物大小，部分依赖于被包装的DNA等核酸类活性物质分子的大小和数量，所以复合物大小的控制并不能通过只单独控制脂质体来实现。总的说来，随着DNA等核酸类活性物质浓度的增加，最终复合物颗粒长的越大。当DNA等核酸类活性物质浓度超过脂质体的包装能力，就会发生沉淀。从DNA等核酸类活性物质工作起效剂量的角度来说，单颗粒中需要更多的基因携带，尤其是在肿瘤治疗或疾病根治的情况。治疗起效必需的DNA等核酸类活性物质量阈值在大多数情况下限制了用较少DNA量取得较小复合物颗粒的选择。而大于400nm粒径的纳米颗粒对于静脉注射并不理想，因为引起栓塞导致动物死亡的可能性很大。具有大装载量同时颗粒粒径较小的载体组成配方就是成功的基础。

复合物组成中过量的DNA等核酸类活性物质引起复合物颗粒粒径的增大和沉淀发生。不足量的DNA等核酸类活性物质引起复合物毒性的增加。而正确制备的脂质体DNA复合物并不表现出裸脂质体般的毒性。有效地包装DNA等核酸类活性物质达到载体的最大装载量实际上是非常重要的，不仅仅因为对最大转染效率的考虑，也是减小脂质体-DNA复合体毒性的考虑。而目前并没有控制载体达到最大装载量的方法，从而使得载体的装载量较为随机，不易控制，进而导致治疗效果不佳。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是：提供一种药物(生物活性物质)载体，这种载体能装载用于肿瘤预防和治疗的生物活性物质，并能靶向转染基因和具有更好血清稳定性。

解决该技术问题的方案是：一种肿瘤靶向治疗药物载体，由DOTAP或其类似物和卵磷脂或其衍生物两种组分组成，所述DOTAP或其类似物、卵磷脂或其衍生物的摩尔比20∶(7-13)，其中，所述的DOTAP类似物包括但不限于DOTMA(1，2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane chloride)、DDAB(Dimethyldioctadecylammonium Bromide)、甲基硫酸化DOTAP中的一种，所述的DOTAP具有如附图1中A的结构；

所述的卵磷脂衍生物包括但不限于DOPC(二油酰基卵磷脂)、DOPS(二油酰基磷脂酰丝氨酸)或DOPE，所述的卵磷脂具有如附图1中B的结构。

作为优选：DOTAP或其类似物和卵磷脂或其衍生物的摩尔比为20∶(8-11)。

进一步的：DOTAP或其类似物和卵磷脂或其衍生物的摩尔比为20∶9。

本发明所要解决的第二个问题是：提供一种肿瘤靶向治疗药物载体的制备方法，从而制备合适的粒径大小的载体，满足药物装载的需要和靶向治疗的需要。

解决该技术问题的技术方案是：依次按照下述步骤进行制备：

a在容器中将上述摩尔比的DOTAP或其类似物、卵磷脂或其衍生物在脂溶性有机溶剂中混合，然后用氮气吹洗容器；所述的脂溶性有机溶剂包括但不限于氯仿，乙醇或乙腈；

b加热至30℃将氯仿蒸发去除，形成脂质体薄膜；

c在50℃下用D5W液溶解b步骤中得到的脂质体薄膜；

d用孔径0.45μm的过滤器过滤一次，再用孔径0.1μm的过滤器过滤4次，即得。

本发明所要解决的第三个问题是：提供一种这种载体的应用。

解决该技术问题的技术方案是：将该载体应用于肿瘤治疗。

作为优先：所述载体装载负电荷的生物活性物质形成复合物。

作为优选：将负电荷的生物活性物质运送到体外培养、离体和体内的活细胞中。

进一步的：所述负电荷的生物活性物质为DNA或RNA或寡聚核酸。

进一步的：所述复合物中还混合有蛋白质配体、抗体或类固醇。

更进一步的：所述复合物的粒径为90nm-250nm。

进一步的：所形成的复合物用于联合肿瘤治疗的化疗和放疗。

更进一步的：所形成的组合物制备成注射剂或气溶胶喷雾剂。

更进一步的：控制载体装载负电荷的生物活性物质达到载体的最大装载量，其方法为：复合物在波长260nm的光吸收值与负电荷的生物活性物质浓度之间的校正符合载体和负电荷的生物活性物质浓度之间的正弦曲线拟合模型，当达到正弦曲线的第一个波峰时，即达到载体的最大装载量。

更进一步的：控制复合物达到最小的细胞毒性，其方法为：复合物在波长260nm的光吸收值净增与复合物的细胞毒性呈正相关，复合物OD260正弦曲线第一个波峰时的DNA浓度，是复合物体内外细胞毒性最小的浓度。

更进一步的：控制复合物达到最大的转染能力，其方法为：波长260nm的光吸收净增与复合物的转染能力呈正相关，在复合物OD260正弦曲线第一个波峰时的DNA浓度，是复合物体内外转基因表达最高的浓度。

发明人经过大量实验发现，与现有的脂质体载体相比，采用适当比例的DOTAP及其类似物与卵磷脂及其衍生物作为载体，运载DNA、RNA或者寡聚核酸等生物活性物质时，在体外或者体内环境下，都具有较好的血清稳定性，同时具有更好的靶向转导性。另外，采用适当的制备方法，本发明的载体与生物活性物质制成的复合物的粒径大小合适，更有利于药物装载和靶向治疗。

本发明通过理论分析和大量实验证明，DOTAP及其类似物与卵磷脂及其衍生物采用适当比例以及适当方法制备的药物载体，可以具有较好的肿瘤治疗靶向性和最较小的细胞毒性，克服了DOTAP及其类似物与卵磷脂及其衍生物的组合物不适合用于药物载体尤其是基因药物治疗肿瘤的载体的技术偏见，同时取得了意想不到的技术效果：该脂质体作为载体运载DNA等药物治疗肿瘤具有更好的靶向性，同时具体更好的血液稳定性。

研究发现，以DOTAP和卵磷脂形成载体，装载DNA为例，如图1所示，DOTAP脂质和合作(辅助)脂质卵磷脂共用同长的双链疏水尾巴，阳离子DOTAP具有一个修饰过的正电荷头部基团，卵磷脂具有天然磷酸基头部基团，图中的载体是由DOTAP∶卵磷脂摩尔比为20∶9的混合物，通过0.1μm过滤产生的主要为单层小泡的脂质体。卵磷脂的大头部基团遮蔽较小带正电荷的DOTAP，规避血清的降解作用和增加脂质体复合物在血液中的稳定性。

在探索出较佳的载体组分及比例的同时，本发明还提供了这种载体的制备方法。本发明是在氯仿等有机溶剂中溶解和混合DOTAP或其类似物和卵磷脂或其衍生物，蒸馏去除有机溶剂形成薄膜，水化合DOTAP或其类似物和卵磷脂或其衍生物，通过用0.1μm孔径滤器挤压过滤4次制成均匀的单层小泡结构，粒径为80-100nm。本方法可以放大达到载体的大规模生产或为靶向转移的运送修饰加入配体，该方法制备的载体的结构重现性好，并且在适合的贮存条件下非常稳定，可存放至少2年。上述载体可与生物活性试剂结合形成活性复合物，本发明的载体为生物活性试剂提供保护，防止血清降解作用并具有主动转染能力。

这种载体能应用于肿瘤治疗。其中应用之一是这种载体可以与DNA、RNA或寡聚核苷酸等混合制成复合物，该复合物具有在高浓度血清培养细胞和人类肿瘤移植动物模型经静脉注射后，体内外高效基因转移的能力。这种复合物的主要靶组织是体内、体外快速生长的肿瘤细胞。这赋予了它用于人类癌症基因治疗的重要应用潜能。

本发明进一步优化这种复合物粒径到90nm到250nm并包裹携带具治疗效能的DNA，RNA或寡聚核苷酸等。实验证明，1μg/μl具有细胞凋亡原基因的DNA、RNA或寡聚核苷酸等可与本发明的载体混合形成粒径大约200nm的复合物。

本发明还提供了这种复合物形成的最佳方法的鉴定和控制。经过大量实验发现，测量这种复合物在260nm波长测量的光吸收值，可以用来测定本发明及别的脂质体，如DOTAP与胆固醇混合的脂质体等，对DNA，RNA或寡聚核苷酸等的装载能力，这种复合物在260nm波长测量的光吸收值与DNA、RNA或寡聚核苷酸等生物活性物质的浓度以正弦模型方式相关，正弦曲线的第一个波峰即显示出本发明的载体对DNA、RNA或寡聚核苷酸等生物活性物质最大包装能力。

本发明进一步应用是用本载体制备任何试剂盒套装。本发明的载体可以单独进行商业化利用，也可以作为特定应用试剂盒的组成部分。本发明也包括在任何试剂盒，指导和手册中OD260正弦曲线模型作为优化脂质体核酸的方法。

本发明进一步应用是关于使用抑瘤基因，如本发明实施例中的抑瘤基因p53，与本发明的载体形成抑瘤基因DNA癌症基因治疗复合物。

本发明的另一个应用是包含生物活性物质如核酸的复合物可以通过多种途径注射，如静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、病灶内注射给药，或输液，口服或喷雾方式给药。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明的载体通过适当的制备方法并装载核酸等生物活性物质，从而可以应用于全身性给药进行肿瘤靶向治疗，可靶向运送到体外培养、离体和体内的肿瘤细胞内，具有达到最大包装量、靶向转染基因和血清稳定性的理想效果。

附图说明

图1：A为DOTAP的结构，B为L-α-卵磷脂的结构，C为DOTAP:卵磷脂:DNA复合物形成的模式，图中C中“-”代表核酸的负电荷，A中“+”代表正电荷；

图2：天然卵磷脂的大头基团帮助DOTAP免遭血清的降解并增加脂质体复合物在血液中稳定性的原理示意图；

图3：不同比例的DOTAP与卵磷脂组成的载体在无血清培养液中对H1299细胞的转染力对比图；

图4：DOTAP与卵磷脂组成的载体与DNA形成的复合物在高或低血清浓度条件下不同的转染效率；

图5：摩尔比为20∶9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与DNA形成的复合物的转染效率与复合物粒径大小的关系；

图6A-F：DL:DNA复合物的OD260值与DNA浓度的关系图；

图7：摩尔比为20∶9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与pFCB-eGFP形成的复合物对不同细胞株不同的转染效率；

图8：体内有肿瘤或无肿瘤情况下LacZ基因在肺脏和肝脏的表达，A：是对照小鼠的肝脏，B：是A549肿瘤转移的肝脏，C：是对照小鼠的肺脏和脾脏，D：是A549肿瘤转移的肺脏；

图9：静脉注射摩尔比为20∶9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与pFCB-p53形成的复合物对A549皮下移植瘤模型肿瘤生长的抑制。

表1：DOTAP，Lecithin(卵磷脂)浓度比的缩写；

表2：转染率和细胞毒性比较，其中XTT读数代表处理组活细胞比未处理组细胞的比率，表中“Luc”表示通过测定luciferase酶的活性来确定基因的转移效率。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的实施例中：

表1代表DOTAP，Lecithin(卵磷脂)浓度比的缩写

表1

表2为转染率和细胞毒性比较

表2

实施例1：不同比例的DOTAP和卵磷脂在无血清培养液中对H1299细胞的转染力实验如图3所示，DOTAP的转染力随着加入卵磷脂增加而下降。1μg/μl的pFCB-eGFP与等体积的不同Dotap∶Lecithin摩尔比的DL脂质体混合。H1299细胞接种到12孔培养板用含2.5μlDL:DNA复合物的Opti-MEM培养液处理4小时进行转染，过后用含10％胎牛血清的培养液RPMI替换Opti-MEM，培养板放入培养箱再孵育48小时，用荧光显微镜放大倍数200观察照相，得到图3的结果。

实施例2：DOTAP与卵磷脂组成的载体与DNA形成的复合物在高或低血清浓度条件下不同的转染效率

如图4所示，H1299细胞接种到12孔培养板，于37℃，5％CO₂培养过夜。当细胞长至30％饱和度，细胞用含1μl、2.5μl或5μl DL:pFCB-eGFP的1ml培养液处理，培养液分别为含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640或1ml 100％FBS。处理后的细胞每30分钟轻轻用手摇动一次。4小时后转染培养液用1ml RPMI-1640+10％FBS培养液替换，培养48小时后，用荧光显微镜观察照相，放大倍数200。8mM具不同Dotap∶卵磷脂摩尔比的脂质体与等体积的1μg/μl pFCB-eGFP质粒DNA结合。此处所示的照片是Dotap∶卵磷脂摩尔比20∶8到20∶10。DC是4mM dotap:胆固醇脂质体代替DL做为基因转染的对照。相片是用荧光显微镜200倍拍照，得到图4的结果。

实施例3：摩尔比为20∶9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与DNA形成的复合物的转染效率与复合物粒径大小的关系实验

如图5所示，复合物的转染效率与复合物的粒径大小密切相关。含0.2μg/μl的pFCB-eGFP和1μg/μl的pFCB-Luc的DNA混合物，与等体积的DL[20∶9]混合。然后复合物用孔径1μm和0.45μm.的滤器过滤，标记为1μm和0.45μm。含0.2μg/μl pFCB-eGFP和0.6μg/μl pFCB-Luc的DNA混合物，与等体积的DL[20∶9]混合。然后复合物用孔径0.2μm和0.1μm.的滤器过滤，标记为0.2μm和0.1μm。H1299细胞接种到12孔培养板，24小时内细胞达到30％饱和度时，进行转染操作。转染用2μl和5μl DL[20∶9]:DNA复合物在1ml的RPMI-1640+10％FBS或100％FBS中进行。

实施例4：摩尔比为20∶9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与DNA形成的复合物的OD260值与DNA浓度的关系实验

如图6所示，摩尔比为20∶9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与DNA形成的复合物的OD260值与DNA浓度符合正弦曲线拟合模型y＝a+b*cos(cx+d)，同时具不同摩尔比的DOTAP与卵磷脂载体符合同样的正弦曲线拟合，只是略微有点位移。

实施例5：摩尔比为20∶9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与pFCB-eGFP形成的复合物对不同细胞株不同的转染效率实验

如图7所示，摩尔比为20∶9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与pFCB-eGFP形成的复合物用来转染肝癌细胞和肺癌细胞，并和正常细胞NHBE和WI-38一起对照。从图中可以看出，该复合物对肿瘤细胞的平均转染率在15％或以上，而对正常细胞的转染率低于1％，图中，肝癌细胞HepG2，腺癌A549，H322，大细胞肺癌H1299，H460。NHBE为正常人类支气管上皮细胞，WI-38为正常人类纤维细胞。

实施例6：DOTAP与卵磷脂形成的载体与DNA形成的复合物的制备

200mg DOTAP和98.8mg卵磷脂用15ml HPLC(高效液相色谱)级的氯仿在1升的圆底烧瓶中混合。烧瓶用氮气吹洗并与旋转整流器连接。30℃，室内负压情况下(～30Hg)蒸馏氯仿30分钟。将烧瓶取下再次用氮气吹洗。再次将旋转蒸馏器接到50℃水浴，用室内负压(～30Hg)蒸馏15分钟。从蒸馏器上取下烧瓶，用氮气充满。将烧瓶口朝下倒转，继续用氮气吹洗15分钟。将载体膜用36ml的D5W(5％右旋糖苷溶液)溶解并用封口膜将烧瓶口封闭。摇晃烧瓶使所有物质完全溶解，将溶液转移到50ml锥形管中。50℃孵育5分钟，有助于载体膜完全溶解。将溶液用0.45μm孔径的滤器过滤1次，用0.1μm孔径的滤器过滤4次。这样制成的载体为8mM的载体2倍溶液，DOTAP与卵磷脂摩尔比为20∶9。2x载体在氩气下封闭，在黑暗条件下于4℃保存2年，而没有明显的氧化。

为制备DOTAP与卵磷脂形成的载体：DNA复合物，DNA用D5W溶解，浓度为1μg/μl。等体积的DNA溶液加入到DOTAP与卵磷脂载体溶液中，并用移液枪上下吸吹10次。产生的复合物出现奶状溶液，并没有可见的沉淀物。复合物在4℃保存至少2个月保持稳定。

质粒DNAs用Macheney-Nagel NUCLEOBOND AX柱按照厂家的说明书纯化。内毒素用购自Sigma-Aldrich公司的内毒素清除液清除2次，用Chembrex.公司的LAL检测盒测定，保证内毒素在10EU/mg水平以下。

DOTAP(890890P，1，2-dioleoyl-3-tr Avanti Polar Lipids imethylammonium-propane)和鸡蛋卵磷脂(840051P，L-a-phosphatidylcholine)购自Avanti Polar Lipids。甲基硫酸化的DOTAP由实验室合成。NUCLEOBOND AX anion exchange columns阴离子交换柱(Cat 740531.50)购自Macherey-Nagel内毒素清除方法按厂家指导进行。

实施例7：DOTAP与卵磷脂形成的载体与pFCB-eGFP形成的复合物(简称“DL:pFCB-eGFP复合物”)的转染力与DOTAP∶卵磷脂的比例以及复合物粒径大小的相关性

DNA pFCB-eGFP质粒简单来自pUC19，包含pUC复制起始的抗卡那霉素基因、CMV启动子、和CMV控制的eGFP基因作为报告基因。不同摩尔比的Dotap∶Lecithin脂质体按实施例6给出的方法制备。DOTAP∶卵磷脂摩尔比调整的范围从20∶7到20∶15产生的脂质体与等体积的1μg/μl pFCB-eGFP溶液混合。H1299细胞接种到12孔培养板，待细胞生长到30％饱合度，进行转染操作。DOTAP与卵磷脂形成的载体与pFCB-eGFP形成的复合物用不同量的无血清(FBS)Opti-MEM培养液、RPMI+10％FBS、或100％FBS稀释。将混合物加入到H1299细胞中，37℃孵育4小时。然后吸走混合物，用新鲜的RPMI+10％FBS培养液代替，继续孵育48小时。在荧光显微镜下观察照相。表达eGFP基因细胞的百分率用来测定转染率。低摩尔比的DOTAP与卵磷脂所形成的复合物，如20∶7，在无血清或低血清培养液中表现出强的eGFP基因表达，但在100％FBS条件下急剧下降。DL复合物在100％FBS条件下转染能力达到最大的DOTAP与卵磷脂摩尔比大约是20∶9到20∶10。DNA转染率随着卵磷脂的增加而下降。摩尔比在这个比例范围DOTAP与卵磷脂脂质体在转染率和血清保护之间达到最佳的一个平衡。同样的结果在A549和H322细胞中也观察到。

转染率和复合物粒径大小之间的相关性，用另外的实验进行了比较研究。DL:pFCB-eGFP复合物的粒径大小通过增加非相关的质粒DNA-pFCB-Luc人工膨胀增加。复合物用1μm，0.45μm，0.2μm和0.1μm.孔径的滤器挤压过滤。不同大小过滤后的脂质体加入到RPMI+10％FBS或100％FBS孵育H1299细胞，转染4小时。然后转染混合物用RPMI+10％FBS替代，并继续培养48小时。转染率在荧光显微镜下观察。一般，转染率在2.5μl DL:DNA.时达到峰值。在高血清条件下较小粒径(02μm或0.1μm)转染的效率较高。在低血清条件下转染时，1ml培养液中含1μg DNA的2μl DL[20∶9]:DNA复合物达到最高转染效率。随着复合物量增加到每毫升培养液5μl，由于细胞毒性转染效率下降。在100％FBS条件下每毫升培养液5ul复合物由于血清抑制作用，表现出最好的转染效率，同时在DL:DNA复合物细胞毒性方面表现出降低。粒径增加的大颗粒脂质体复合物应用时，血清抑制因子中和了DL:DNA复合物的活性。粒径越大，血清抑制因子引起的作用就越大。较小粒径的复合物含有更多的粒子，可饱和血清抑制因子，提供更多的转染活性。小于200nm粒径的复合物同时也能避免大颗粒引起的意外沉淀发生，而有助于良好血液循环的维持。

实施例8：DOTAP与卵磷脂形成的载体与DNA形成的复合物(简称“DL:DNA复合物”)对肿瘤细胞和正常细胞基因转移的效率

DL:DNA复合物对肿瘤细胞和正常细胞基因转染的效率，用DL[20∶9]:pFCB-eGFP进行了比较研究。肝癌细胞HepG2、腺癌细胞A549，H322、大细胞肺癌细胞H1299，H460和正常人类成纤维细胞WI-38来自ATCC。正常人类支气管上皮细胞NHBE购自Lonza。所有细胞用12孔培养板，三孔复样，培养过夜。然后培养液用1ml含2.5μl DL[20∶9]:pFCB-eGFP的RPMI+10％FBS替换，4小时后，转染液用细胞各自的培养液替换并培养48小时。转染率数据在荧光显微镜观察得到。结果证明癌症细胞的转染率在15％-80％之间，而正常细胞中几乎观察不到基因的表达，之间有统计学显著性差异(t-test，p＜0.001)。这一结果现象的背后可能有几种原因，其中最重要的是肿瘤细胞和正常细胞表面负电荷性质的区别。所有测试的肿瘤细胞比起正常细胞生长速度至少快50％，这可能也是eGFP基因在肿瘤细胞中高表达的因素之一。

实施例9：转染率和细胞毒性比较

参加表2，由CMV启动子控制的luciferase表达质粒DNA与不同浓度的DL[20∶9]混合，形成的DL:DNA复合物，用来转染大细胞肺癌H1299，肺腺癌A549和正常支气管上皮细胞NHBE。细胞接种于96孔板，三孔复样。细胞用含0.25μl或0.5μl DL:DNA复合物的RPMI+10％FBS0.1ml转染4个小时。转染后48小时，以luciferase酶的活性测定确定基因的转移效率。XTT检测用来测定DL:DNA复合物的细胞毒性。XTT读数代表处理组活细胞比未处理组细胞的比率，例如，95的意思是与对照细胞比较95％的细胞是活的。

实施例10：摩尔比为20∶9的DOTAP与磷酸组成的载体与pFCB-LacZ形成的复合物(简称“DL[20∶9]:pFCB-LacZ”)的体内表达

包含CMV启动子控制的LacZ基因的pFCB-LacZ质粒DNA用来做体内基因转移的测试。DL[20∶9]:pFCB-LacZ复合物按实施例一制备。1x10⁶腺癌细胞A549通过尾静脉注射到裸鼠体内，8周以后，100μl含50ug质粒DNA的DL[20∶9]:pFCB-LacZ复合物以1分钟间隔，尾静脉注射到对照和荷瘤的小鼠体内。LacZ注射后48小时，小鼠行动正常，处死动物并将器官用含0.1％TritonX-100的4％多聚甲醛PBS溶液在4℃固定2-3小时，然后将它们在黑暗湿润的小室中与含1mg/ml X-gal的组织染色基础液(Chemicon，Cat.#BG-8-C)室温下孵育过夜。荷瘤小鼠的肝脏变大，并具典型的硬化区域。苍白肿块特征肿瘤转移灶的癌症散布在肺脏和肝脏表面周围。来自两种小鼠的器官都用含有1mg/ml x-gal的组织染色基础液(Chemicon，BG-8-C)室温染色48小时。染色的内源性十二指肠作为蓝色检查的方法对照。肺脏和肝脏内的肿瘤斑点都有不同程度的着色。肺脏中肿瘤长的比肝脏中的肿瘤小，LacZ基因的表达水平也弱一些，着色为淡蓝色。肝脏中A549肿瘤的生长达到了非常晚期的阶段引起纤维化肿瘤病变。尽管肿瘤都是同一起源，但在肝脏肿瘤中深蓝色意味着LacZ基因的表达较强。最令人感兴趣的现象是肝脏肿瘤纤维化病变的表面周围为淡蓝色着色，而纤维化的中心区域没有受到影响，见图8中的B。设计针对不同器官的治疗方案时这些现象都是有价值的参考。

实施例11：摩尔比为20∶9的DOTAP与磷酸组成的载体与p53形成的复合物(简称“DL[20∶9]:pFCB-p53复合物”抑制裸鼠体内皮下A549实体瘤的生长

如图9所示，为评价DL[20∶9]:pFCB-p53对体内肿瘤生长的抑制效应，建立和应用A549裸鼠皮下移植瘤模型。待体外培养的A549肿瘤细胞达到70％-80％饱和度时，收集细胞，制成2x107的细胞悬液，将该细胞悬液200μl注射至小鼠前肢内侧皮下。待实体瘤长成至500mm3左右，切下瘤体等体积分成1mm见方，接种到裸小鼠前肢内侧皮下，待肿瘤生长至30mm3，11只荷瘤动物随机分成4组，尾静脉缓慢注射给药100μl。1组：注射PBS；2组：摩尔比为20∶9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与pFCB-p53形成的复合物；3组：摩尔比为20∶9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与摩尔比为2∶1的pFCB-p53:pFCB-hBax形成的复合物；4组：摩尔比为20∶9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与摩尔比为1∶1的pFCB-p53:pFCB-hBax形成的复合物。给药频率为每隔48小时给药1次，共给药6次，最后一次给药后24小时处死动物，将瘤体剖下，称重并用福尔马林固定，做组织病理学检查。其间每两天记录一次动物体重和肿瘤大小。2、3、4给药组注射的100ul脂质体:DNA复合物含37ug的相应质粒DNA。结果表明动物对该剂量的脂质体:DNA复合物的耐受性较好，没有对动物造成明显的毒性作用，从开始给药到第6次给药期间，动物体重增长正常，动物行为无异常。通过静脉给药的Lipovel:抑癌基因p53或p53+hBax复合物可以抑制实体瘤的生长，体积抑制率达70％左右，瘤重抑制率达60％左右。这些初步的研究表明Lipovel:DNA脂质体混合物对体内肿瘤的靶向选择作用，为进一步研究应用于人类基因治疗打下了基础。