用于测定甲型H1N1流感病毒全基因序列的引物及测定方法

摘要

本发明公开了用于测定甲型H1N1流感病毒全基因序列的引物及测定方法。本发明涉及48对特异性强、灵敏度高、稳定性好的引物，通过48个常规PCR反应对甲型H1N1流感病毒8个片段基因序列测定，包括HA，NA，NP，M1，M2，PA，PB1，PB2片段。利用这48进行检测的方法操作简单，耗时短，特异性强，灵敏度高，适用于甲型H1N1流感病毒鉴定及流行病学调查研究等。

说明书

技术领域

本发明涉及甲型H1N1流感病毒检测技术，具体地说，涉及一种用于测定甲型H1N1流感病毒全基因序列的引物及其试剂盒。

背景技术

流行性感冒（流感）是由流行性感冒病毒（流感病毒）的引起的呼吸系统传染病。流感病毒属于正粘病毒科，是负单链RNA病毒。流感病毒根据核蛋白（Nucleoprotein, NP）和基质蛋白（Matrix protein, MP）抗原性的不同分为甲、乙、丙三种分型，均可以感染人。其中甲型流感病毒的变异能力最强，能引起流感季节性流行或流感大流行。乙型流感病毒变异能力较弱，一般起流感季节性流行。丙型流感病毒抗原性比较稳定，较少引起流行。

甲型流感病毒自1918年从鸟类进入人际传播，引起西班牙流感大流行。甲型流感病毒通过抗原漂移和抗原转换发生变异，产生病毒变异株或新的病毒亚型，是甲型流感病毒在人群引起季节性流行的流感大流行的主要原因。人际流行毒株和禽流感病毒通过抗原转换发生重组，引起1957年和1968年两次流感大流行，分别把H2N2和H3N2两种流感病毒亚型带入人群中。流感大流行使一种病毒亚型持续在人群中传播，引起季节性流感流行直至下一次流感大流行。H1N1自1957年停止在人群中传播，1977年重新进入人际流行。H2N2自1968年后不在人群中流行。目前H1N1和H3N2两种甲型流感病毒同时在人群中流行。

甲型流感病毒的病毒体结构主要包括包膜和核衣壳。病毒体包膜上镶嵌着两种糖蛋白：血凝素（Hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase, NA）。目前已鉴定了16种HA（H1-H16）和9种NA（N1-N9）。甲型流感病毒通过HA和NA不同的组合方式而形成多种亚型，如曾在人群中流行的H1N1、H2N2和H3N2。病毒核衣壳位于病毒体的核心，主要成分是由病毒RNA和NP组成的核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP），在RNP上附着着RNA聚合酶复合体蛋白（PB1, PB2和PA）。甲型流感病毒基因组包括8个基因片段，编码11种蛋白质：HA，NA，NP，M1，M2，PA，PB1，PB2，PB1-F2和，PB2，以及两个非结构蛋白（nonstructural protein, NS）NS1，NS2（NEP）。

2009年4月，从墨西哥和美国的流感患者身上鉴定一种新的猪源H1N1流感病毒。随着新甲型H1N1在世界范围迅速传播，世界卫生组织（World health organization, WHO）于2009年6月11日宣布将流感大流行警戒级别提升至最高级别6级，宣布流感疫情进入全球大流行阶段。在流感大流行的初期进行病毒传播的密切监测，及时发现病例，迅速进行鉴定，对减低流感大流行的危害具有十分重要的意义。

根据流感流行的规律，新的流感变异株产生后，世界各国的人口聚居地都会先出现输入性病例传入，继而相继蔓延为以本地感染为主的社区流行和地域大流行。在这次甲型H1N1流感当中，包括我国在内的一些国家由于早期采取了严格的防控措施，有效推迟了本土病例的传播，为药物储备和疫苗研发争取到了宝贵的时间。本研究组参与甲型H1N1流感的广东省的密切监测。2009年5月18日成功对广东首例输入性甲型H1N1流感疑似病例进行第一时间核酸检测，确定传染源，对寻找、隔离密切接触者的工作赢得宝贵时间。但是我们也发现根据WHO推荐的46对全基因测序引物（http://www.who.int/csr/disease/ swineflu/en/index.html），出现三分之一以上的引物特异性差及灵敏度低的现象，严重影响对甲型H1N1流感病毒全基因序列测定监控的进展。

发明内容

为了克服现有技术缺陷，本发明提供了一种能用于测定甲型H1N1流感病毒全基因序列的引物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于测定甲型H1N1流感病毒全基因序列的引物，包含48对特异性引物，48对特异性引物分成12组用于检测甲型H1N1流感病毒HA片段全基因编码序列，甲型H1N1流感病毒HA片段全基因包括HA，NA，NP，M1，M2，PA，PB1和PB2 八个片段；

第1组用于检测和鉴定甲型H1N1流感病毒HA基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12所示核苷酸序列；

第2组用于检测和鉴定甲型H1N1流感病毒NP基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22所示核苷酸序列；

第3组物用于检测和鉴定甲型H1N1流感病毒NA基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：32所示核苷酸序列；

第4组用于检测和鉴定甲型H1N1流感病毒M基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40所示核苷酸序列；

第5组用于检测和鉴定甲型H1N1流感病毒NS基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46所示核苷酸序列；

第6组用于检测和鉴定甲型H1N1流感病毒PB2基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：63所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64所示核苷酸序列；

第7组用于检测和鉴定甲型H1N1流感病毒PB1基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80所示核苷酸序列；

第8组用于检测和鉴定甲型H1N1流感病毒PA基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO：81，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：95所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：96所示核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供甲型H1N1流感病毒全基因序列的测定方法，其采用常规PCR技术扩增样品的核酸片段，PCR总体系中添加各种引物浓度为0.2 μmol/l；其他试剂可使用常规的的实时定量PCR反应混合液，包括Taq酶，逆转录酶，一步法RT-PCR反应缓冲液；PCR运行条件为： 95 ℃预变性，5 min；95 ℃变性，30 s；55 ℃退火，30 s；72 ℃延伸，60 s；回到步骤2，重复循环30次；72 ℃，10 min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用一对待测甲型流感病毒病原体核酸序列的特异性、高效性及重叠性高的引物，通过常规PCR技术实现靶核酸序列片段的扩增，再进行分小片段测序而高效率的测定甲型流感病毒全基因组。优点如下：

1. 操作简单，结果稳定，48个PCR反应过程均在同一条件下进行，效率高，可根据需要。

2. 灵敏度高，48个PCR反应均能高效进行。

3. 特异性强，48个PCR反应产物均为单条泳带。

4. 适用范围广，取样简单。样品中DNA、肝素、EDTA、柠檬酸盐、血红蛋白、白蛋白和脂质等的污染将不会对结果造成影响，因而适用于各种待测样品如咽喉拭子、血液等。

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1. 使用本发明引物对1株甲型流感病毒全基因分段PCR的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本领域的技术人员可以对其进行各种改造和修改，这些等价形式同样落入本发明的保护范围。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：引物和探针的设计

通过分别对所有GenBank数据库中已知100株甲型H1N1病毒株的基因序列进行比对分析，选择高度保守的区段，设计48对引物和探针，如SEQ ID NO：1~96所述。引物设计的原则如下：

（1）引物长度约20-23nt，GC含量在45%-55%之间。

（2）PCR扩增长度一般在400-600 bp之间。

（3）对于同一个模板片段，设计引物使每个位点有2-3个PCR扩增片段覆盖，以避免PCR反应发生点突变影响结果判读。

分析上述病毒特异性基因的信息，经序列分析软件DNASTAR进行引物间/内二聚体的排除，并经BLAST验证引物的特异性与相近病原体的同源性，设计出针对上述病原体检测的引物和探针。

实施例2：PCR反应体系的构建与优化

1. 样本采集

本实验室于2009年5月17日及5月28日采集三例疑似病例样本，包括广东省首例输入性甲型H1N1疑似病例以及我国第1例和第2例甲型H1N1二代疑似病例戴某和薛某的鼻/咽拭子标本。

2. 鼻/咽拭子标本RNA的提取

使用QIAmp MiniElute Virus Spin Kit（Qiagen, Chatsworth, CA）提取鼻/咽拭子标本的RNA，操作按照说明书进行：

（1）第一次使用此试剂盒时，在AW1和AW2缓冲液中按照试剂瓶上提示体积加入100%乙醇，19 ml AW1中加入25 ml无水乙醇，13 ml AW1中加30 ml无水乙醇；在AL中加入28 μg/ml carrier RNA。

（2）取25 μl Qiagen Protease 放入1.5 ml离心管中。

（3）在生物安全柜内将呼吸道样本（鼻拭子和咽拭子）取200 μl加入此管中，充分混匀。若标本不足200 μl，则用生理盐水补足至终体积为225 μl。

（4）在每管分别加入200 μl AL（内需要提前加入28 μg/ml carrier RNA），充分混匀振荡15 s。56℃孵育15 min。短暂离心，将管盖上的液体离到管底。

（5）加入250 μl无水乙醇，充分混匀振荡15 s，室温（15-25℃）裂解5 min。短暂离心，将管盖上的液体离到管底。

（6）将上述裂解液加入QIAamp MinElute离心柱上，6000 g（8000 rpm），室温离心1 min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液。

（7）于滤柱中加入500 μl AW1液，6000 g（8000 rpm），室温离心1 min，弃收集管中的离心液。

（8）从试剂盒中取一支干净的2 ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500 μl AW2液，6000 g（8000 rpm），室温离心1 min。将滤柱移到一个干净的收集管中，加入500 μl无水乙醇，6000 g（8000 rpm），室温离心1 min。

（9）将滤柱移到一个干净的收集管中，20000 g（14000 rpm），室温离心3 min。离心后将滤柱放在56℃，3 min以干燥滤膜。

（10）将滤柱放在1.5 ml Eppendorf管上，向滤柱中加入20-150 μl的AVE液，室温静置1 min。20000 g（14000 rpm）室温离心1 min，收集离心液即为提取的核酸。提取的核酸溶液分装三份至0.2 ml PCR管中，一份用于检测，其他保存，用于后续的研究。

（11）RNA纯度和浓度检测：取2 μl RNA溶液，以核酸蛋白定量仪（NanoDrop 1000, Thermo）分别测定并计算出其260 nm和280 nm波长的吸光度值A260与A280的比值及RNA浓度，1.8≥ A260/A280 ≤2.0表明纯度符合要求。各组RNA所测得的浓度如表1，纯度均符合要求。

3. PCR反应体系及条件

每个鼻/咽拭子标本的cDNA样本使用附录的引物分别进行反应，单个的反应体系如表1所示：

表1

2×MasterMix25 μlForwardprimer (10 μM)2 μlReverseprimer (10 μM)2 μlcDNA1 μlsterileddH2O20 μlTotal50 μl

混匀，在2720 thermal cycler按以下程序进行扩增反应。反应条件如下：

扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶（含终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭）电泳检测。若扩增产物有单一的特异条带，则进行测序，否则将通过调整PCR反应条件直至电泳检测到单一的特异条带再送测序。

测序完成后，使用生物分析软件Bioedit把同一基因片段的测序结果排列整合成完整的序列。

4. PCR产物的胶回收纯化

用QIAquick Gel Extraction kit（Qiagen, Chatsworth, CA）进行胶回收纯化，按试剂盒说明书整理具体实验步骤如下：

下文涉及的Buffer QG, Elution Buffer试剂及Collection Tube, Spin Column耗材均为试剂盒中提供。

（1）在紫外灯下切取含有PCR产物条带的琼脂糖凝胶，称重并计算胶块体积（按1 μg ＝1 μl计算）；

（2）加入3个凝胶体积量的Buffer QG，混合均匀后，50℃加热融化胶块；

（3）将融化的混合液转于试剂盒提供的Collection Tube上的Spin Column，12000rpm离心1min，弃滤液；

（4）加入750 μl Buffer PE至Spin Column中，12000 rpm 离心30 s；

（5）弃去滤液，再次12000 rpm离心30 s；

（6）将Spin Column置于新的1.5 ml离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50 μl 于65 ℃预热的Elution Buffer，室温静置1min后，12000 rpm离心1 min，将洗脱下的PCR产物-20℃保存。

5. 甲型H1N1流感病毒的基因组测序结果分析

应用本发明所述引物及方法对上述三例甲型H1N1流感病例进行病毒基因组序列测定，各组PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1。使用生物分析软件Bioedit把同一基因片段的测序结果排列整合成完整的序列。对测定序列的病毒株A/GuangzhouSB/01/2009（简称GZ01），A/Guangdong/03/2009（简称GD03），A/Guangdong/05/2009（简称GD05）和我国首例甲型H1N1流感病毒株A/Sihuan/1/2009（SC01）进行序列相似性分析。结果显示，四株病毒株之间，流感病毒八个基因片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、MP和NS）核酸同源性均高于99.5%（表2至表9）。测序结果与序列相似性分析说明本发明鉴定的三株病毒株是A/H1N1/09。测序结果与已有的WHO的测序引物比较碱基序列是一致。三株病毒的全基因序列已提交到国际基因数据库NCBI Genebank，表10列出其编号。

表2.  甲型流感病毒PB2基因核酸同源性的比较

表3.  甲型流感病毒PB1基因核酸同源性的比较

表4.  甲型流感病毒PA基因核酸同源性的比较

表5.  甲型流感病毒HA基因核酸同源性的比较

表6.  甲型流感病毒NP基因核酸同源性的比较

表7.  甲型流感病毒NA基因核酸同源性的比较

表8.  甲型流感病毒MP基因核酸同源性的比较

表9.  甲型流感病毒NS基因核酸同源性的比较

表10. 向NCBI Genbank提交的3株甲型H1N1流感病毒全基因序列的编号

。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中山大学

 

<120>  用于测定甲型H1N1流感病毒全基因序列的引物及测定方法

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<170>  PatentIn version 3.5

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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attgtcacca taagcagcca                                                   20

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttc                                          28

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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tcttgatgac cccacaaaaa cata                                              24

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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catgactcga acaaaggtgt aacg                                              24

 

 

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tatattctga aatgggaggc tggt                                              24

 

 

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gaagggagaa tgaactatta ctgg                                              24

 

 

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ggttgaactc tttacctact gctg                                              24

 

 

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gtttcattga aggggggtgg acag                                              24

 

 

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agatcgccaa aatctggtaa atcc                                              24

 

 

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ggtttcctgg acatttggac ttac                                              24

 

 

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agggtgtttt ttctcatgct tctg                                              24

 

 

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gagtaagacc tgctgttgca tctt                                              24

 

 

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gagaggatgg tgctttctgc tttt                                              24

 

 

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ttccacgttt gatcattctg atta                                              24

 

 

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caaacaatgg cgaagatgca acag                                              24

 

 

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aatgggtcta tcccgaccag tgag                                              24

 

 

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aaacccagga aacgctgaga ttga                                              24

 

 

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acaagagggg tccagattgc ttca                                              24

 

 

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aaagcagggg tttaaaatga atcc                                              24

 

 

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tggagaggga acttcaccaa tagg                                              24

 

 

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agacaacagt gtaagaatcg gttc                                              24

 

 

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tccctctcca tacaactcaa gatt                                              24

 

 

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tccatttgct ccattagacg atac                                              24

 

 

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tgaatgcccc taattatcac tatg                                              24

 

 

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gtttacacca caaaaggata tgct                                              24

 

 

<210>  31

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  31

agataggata catatgcagt ggga                                              24

 

 

<210>  32

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  32

agaaacaagg agttttttga acaa                                              24

 

 

<210>  33

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  33

aagatgagtc ttctaaccga ggtc                                              24

 

 

<210>  34

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  34

gtcactgttc ccatcctgtt gtat                                              24

 

 

<210>  35

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  35

attttaggat ttgtgttcac gctc                                              24

 

 

<210>  36

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  36

ttgcatgtac catctgccta gtct                                              24

 

 

<210>  37

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  37

aacaggatgg gaacagtgac caca                                              24

 

 

<210>  38

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  38

taaagcgacg ataaatacat ttga                                              24

 

 

<210>  39

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  39

actaccacca atccactaat cagg                                              24

 

 

<210>  40

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  40

agttttttac tctagctcta tgtt                                              24

 

 

<210>  41

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  41

gtgacaaaaa cataatggac tcca                                              24

 

 

<210>  42

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  42

ctcctcagtg aaagccctta gtag                                              24

 

 

<210>  43

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  43

gaatggatct tgaaagagga atcc                                              24

 

 

<210>  44

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  44

ttcatttctg ctctggaggt agtg                                              24

 

 

<210>  45

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  45

gcgatcatgg aaaagaacat agta                                              24

 

 

<210>  46

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  46

cattaaataa gctgaaacga gaaa                                              24

 

 

<210>  47

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  47

atggagagaa taaaagaact gagag                                             25

 

 

<210>  48

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  48

caacttccat aatcacatcc tgtg                                              24

 

 

<210>  49

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  49

agaccgagtg atggtatcac ctct                                              24

 

 

<210>  50

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  50

catttctcac ttctcctcct ggag                                              24

 

 

<210>  51

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  51

gctggcaata acaaaagaga agaa                                              24

 

 

<210>  52

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  52

aacccaccaa aactgaaaga tgag                                              24

 

 

<210>  53

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  53

agaaacatag taagaagagc agca                                              24

 

 

<210>  54

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  54

tattgacaaa gttcagatcg cccc                                              24

 

 

<210>  55

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  55

gtgctaacgg gcaacctcca aaca                                              24

 

 

<210>  56

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  56

cggtcaatac tcactaccac tctc                                              24

 

 

<210>  57

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  57

ggcagttagg ggcgatctga actt                                              24

 

 

<210>  58

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  58

tgtgggatct tgtgaccatt gaat                                              24

 

 

<210>  59

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  59

aaagagggaa cgtactattg tctc                                              24

 

 

<210>  60

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  60

ccttgttgta attgaatact ggag                                              24

 

 

<210>  61

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  61

gaaccatttc agtctcttgt ccct                                              24

 

 

<210>  62

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  62

tagcacatta gccttctctc cttt                                              24

 

 

<210>  63

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  63

tttcctcatt gactgtgaat gtga                                              24

 

 

<210>  64

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  64

ggtcgttttt aaacaattcg acac                                              24

 

 

<210>  65

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  65

atggatgtca atccgactct actt                                              24

 

 

<210>  66

<211>  24

<212>  DNA

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agctgttagg ccattcgatc taaa                                              24

 

 

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<211>  24

<212>  DNA

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tacctgagga taatgaacca agtg                                              24

 

 

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<211>  24

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<213>  人工序列

 

<400>  68

attcagtctt tgttttttct tccc                                              24

 

 

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<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  69

acaccataga agtctttaga tcga                                              24

 

 

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<211>  24

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<213>  人工序列

 

<400>  70

acttagtgtt gtccccagtg attg                                              24

 

 

<210>  71

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  71

gcatttgcga aaagcttgaa cagt                                              24

 

 

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<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  72

tccaagattc agtatcgaga ctcc                                              24

 

 

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<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  73

gggaaagggt acatgttcga gagt                                              24

 

 

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<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  74

aaaattagcc acaaatccat agcg                                              24

 

 

<210>  75

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  75

tgggagtctc gatactgaat cttg                                              24

 

 

<210>  76

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  76

atcttctcgt ctgaatttgt gtgt                                              24

 

 

<210>  77

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  77

ttttatcgct atggatttgt ggct                                              24

 

 

<210>  78

<211>  24

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<213>  人工序列

 

<400>  78

tgcttttggc tggaccatgg gctg                                              24

 

 

<210>  79

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  79

gaatcttcac attcctgaag tctg                                              24

 

 

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<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  80

aaggcatttt tatttttgcc gtct                                              24

 

 

<210>  81

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  81

gatccaaaat ggaagacttt gtgc                                              24

 

 

<210>  82

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  82

tctccagtga atgaaaagat gtga                                              24

 

 

<210>  83

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  83

cggggtgaat caataattgt agaa                                              24

 

 

<210>  84

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  84

ttgcgcatag ttcctgtaat ctca                                              24

 

 

<210>  85

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  85

agacacacat tcacatcttt tcat                                              24

 

 

<210>  86

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  86

tacttaattt cagagcatcc atca                                              24

 

 

<210>  87

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  87

gtctatggga ttcctttcgt cagt                                              24

 

 

<210>  88

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  88

atcaaagtct actttttctg gtgc                                              24

 

 

<210>  89

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  89

agtattgaag acccgagtca cgag                                              24

 

 

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<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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ttgagcaagg ccgtatttat gtac                                              24

 

 

<210>  91

<211>  24

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<213>  人工序列

 

<400>  91

tgacagtgat gagccagagc ccag                                              24

 

 

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<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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ggttccattg gttctcacat atag                                              24

 

 

<210>  93

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  93

ttgagaaatg atactgatgt ggtg                                              24

 

 

<210>  94

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  94

caagttgtgg agacgcatat agac                                              24

 

 

<210>  95

<211>  24

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<213>  人工序列

 

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cagattgaga gcatgattga ggcc                                              24

 

 

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<211>  24

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<213>  人工序列

 

<400>  96

acagtatgga tagcaaatag tagc                                              24