一种乙酸耐性乙醇生产酿酒酵母菌株及菌株筛选方法

摘要

一种乙酸耐性乙醇生产酿酒酵母菌株，该菌株分类学命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)E5.9，保藏号为：CGMCC No.3618。筛选方法为液体全筛选法，步骤如下：1)菌株诱变：对酿酒酵母出发菌株进行物理、化学或生物诱变；2)液体全筛选：将所有诱变菌株平均转接于24孔板中，首先无选择压力预培养，然后添加选择压力继续培养至多个孔出现正突变体；3)固体平板筛选：稀释正突变培养物，涂布固体选择培养基，挑选优势抗性克隆；4)传代驯化：将优势抗性克隆在选择性液体培养基中传代驯化，筛选遗传稳定的抗逆菌株。

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物遗传育种领域，具体地涉及一种乙酸耐性乙醇生产酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株E5.9和筛选方法。

背景技术

木质纤维素是最为丰富的可再生生物质资源，但是目前还没有得到很好的应用。燃料乙醇是一种可再生清洁能源，有望成为化石能源的替代品之一，并且有利于环境保护，以木质纤维素为原料生产燃料乙醇，经济和社会意义重大。

以木质纤维素为原料生产燃料乙醇，需要预先对原料进行预处理。当前发展了汽爆、稀酸等多种预处理方法，但无论使用哪种方法，预处理物中都不可避免地存在发酵抑制物，严重影响发酵菌株的生长和乙醇发酵。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统的并且使用最多的产乙醇酵母，能在酸性和严格厌氧条件下快速发酵葡萄糖产乙醇、副产物少，不易被细菌和病毒污染，生物安全性好，而且相对其他酵母和工程细菌，具有较强适应性和耐受性，因此是木质纤维素乙醇生产的优势菌种。尽管如此，目前仍然没有报道证明酿酒酵母菌株能耐受木质纤维素预处理液中的抑制物，正常发酵产乙醇。

乙酸是木质纤维素预处理液中的主要发酵抑制物之一[Palmqvist E， B.Fermentation of lignocellulosic hydrolysates.II：inhibitorsand mechanisms of inhibition.Bioresour Technol.2000；74：25-33.]，在高于80mM的浓度下部分酿酒酵母细胞会出现细胞凋亡[Giannattasio S，Guaragnella N，Corte-Real M，Passarella S，Marra E.Acid stress adaptationprotects Saccharomyces cerevisiae from acetic acid-induced programmed celldeath.Gene.2005；354：93-98.2]，严重影响细胞生长和发酵[Narendranath NV，Thomas KC，Ingledew WM.Effects of acetic acid and lactic acid on thegrowth of Saccharomyces cerevisiae in minimal medium.J Ind MicrobiolBiotech.2001；26：171-177.]。

有研究报道，在葡萄糖得率最高的汽爆预处理条件下处理玉米秸秆，在含10％水不溶性固体(water-insoluble solids，WIS)的水解液中，乙酸的量约为30mM，而在酿酒酵母发酵预处理水解液过程中，乙酸的量可升至70mM，至发酵结束乙醇浓度为25g/L，发酵时间约70小时[ K，Rudolf A，Galbe M，Zacchi G.Fuel ethanol production from steam-pretreatedcorn stover using SSF at higher dry matter content.Biomass Bioenergy.2006；30：863-869.]。低乙醇浓度限制乙醇的蒸馏分离、增加生产成本，尤其是当乙醇浓度低于40g/L的情况下。提高发酵液乙醇浓度可以显著降低生产成本[Zacchi G，Axelsson A.Economic evaluation of preconcentration inproduction of ethanol from dilute sugar solutions.Biotech Bioeng.1989；34：223-233]、[Wingren A，Galbe M，Zacchi G.Techno-economic evaluation ofproducing ethanol from softwood-a comparison of SSF and SHF andidentification of bottlenecks.Biotechnol Prog.2003；19：1109-1117.]，要提高乙醇浓度需要提高发酵水解液浓度，若使乙醇浓度高于40g/L，发酵过程中的乙酸浓度也会随之增高至100mM以上，影响发酵菌株的发酵效率和乙醇得率。而在含11％水不溶性固体的柳木汽爆预处理物中，乙酸浓度高达130mM[Sassner P，Galbe M.Zacchi G.Bioethanol production based onsimultaneous saccharification and fermentation of steam-pretreated Salix athigh dry-matter content.Enzyme and Microbial Technology.2006；39：756-762.]。在稀酸预处理方法中，乙酸同样是关键抑制物之一，在半纤维素水解物中通常占到单糖的5-10％(wt)[Ingram LO，Aldrich HC，Borges ACC，Causey TB，Martinez A，Morales F，Saleh A，Underwood SA，Yomano LP，York SW，Zaldivar J，Zhou SD.Enteric bacterial catalysts for fuelethanol production.Biotechnol Prog.1999；15：855-866.]，虽然Ca(OH)₂是最有效的稀酸预处理脱毒方法，但是乙酸不能被中和消除，并且部分可发酵糖会降解为不可发酵糖和乳酸[Mohagheghi A，Ruth M，Schell DJ.Conditioning hemicellulose hydrolysates for fermentation：Effects ofoverliming pH on sugar and ethanol yields.Process Biochem.2006；41：1806-1811.]。水洗脱毒预处理物可以降低抑制物浓度，但同时会损失大量可发酵糖份，增加了生产成本。

发明内容

本发明的目的在于针对木质纤维素乙醇生产中的乙酸抑制问题，培育一株具有乙酸高耐受性的乙醇生产酿酒酵母菌株。

本发明的另一目的在于提供一种筛选上述菌株的方法。

为实现上述目的，本发明提供的乙酸耐性乙醇生产酿酒酵母菌株，该菌株分类学命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)E5.9，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.3618。

本发明提供的筛选上述乙酸耐性乙醇生产酿酒酵母菌株的方法，为液体全筛选法，主要步骤如下：

1)菌株诱变：对酿酒酵母出发菌株进行物理、化学或生物诱变；

2)液体全筛选：将所有诱变菌株平均转接于24孔板中，首先无选择压力预培养，然后添加选择压力继续培养至多个孔出现正突变体；

3)固体平板筛选：稀释正突变培养物，涂布固体选择培养基，挑选优势抗性克隆；

4)传代驯化：将优势抗性克隆在选择性液体培养基中传代驯化，筛选遗传稳定的抗逆菌株。

所述的筛选方法中，菌株诱变是采用紫外诱变、EMS诱变或微波诱变。

所述的筛选方法中，菌株诱变的诱变细胞数为2×10⁶-5×10⁸个。

所述的筛选方法中，24孔板为1-100个，每孔的选择培养基量为0.5-2.5ml。

所述的筛选方法中，传代驯化接种量由大到小，第一次驯化接种量为20-10％，逐次递减至接种量小于1％。

本发明的效果是：

(1)本发明所提供菌株的乙酸耐受性高，在含166mM乙酸的YPD培养基中生长与无乙酸压力对照菌同时达到稳定期；本发明所提供的菌株在133mM乙酸压力下发酵20％葡萄糖，产生76g/L乙醇。

(2)本发明液体筛选步骤对所有诱变菌株做了筛选，而传统的固体筛法通常只对部分突变体进行选择；液体全筛选法实现全筛选的过程简单，以2×10⁸个诱变细胞为例，应用液体全筛选法将所有细胞平均分到1-100个24孔板中，可以实现全筛选，而传统固体筛选法要对所有细胞进行筛选，按照每个固体平板涂布500个细胞算，需要涂布4×10⁵个固体平板，工作量巨大。

本发明培育能够发酵不脱毒水解液的抗逆性酿酒酵母菌株，能够有效降低木质纤维素乙醇生产成本。本发明通过诱变筛选，获得了能够耐受乙酸的酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae E5.9，为近一步发展具有综合抗逆能力、能够有效发酵不脱毒木质纤维素水解液的生产菌株提供了基础。

附图说明

图1是出发菌株和E5.9基于26S rDNA D1/D2和ITS序列的系统发育树。

图2是酿酒酵母E5在含乙酸条件下的发酵产乙醇结果。

图3是酿酒酵母E5.9在含乙酸条件下的发酵产乙醇结果。

图4是酿酒酵母E5.9在含乙酸条件下的生长曲线。

图5是本发明抗逆性筛选方法的流程示意图。

具体实施方式

本发明所提供的酿酒酵母菌株为Saccharomyces cerevisiae E5.9，已保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏日期：2010年1月19日；保藏号：CGMCC No.3618。

本发明所提供的菌株是通过以下措施获得的：

分析96株不同来源酿酒酵母菌株的压力耐受能力，从中选择综合抗逆性强的菌株XL14-1作为出发菌株；应用紫外诱变、EMS诱变和微波诱变三种方法诱变出发菌株XL14-1；应用实施例2所述液体全筛选法筛选乙酸耐性菌株，即将全部诱变菌液平均转接于24孔板，预培养，然后加入选择压力，继续培养至多个孔出现抗性正突变；将正突变培养物涂布于固体选择培养基，待菌落长出，挑取大菌落转接于更高选择压力培养基中；传代驯化。

本发明所提供的菌株具有如下特征：

(1)形态学特征：细胞呈椭圆形、卵形或圆形；大小在1.0-8.0μm×2.0-12μm之间；菌落颜色为乳白色到微黄色，边缘平滑，有隆起；液体静止培养，菌体沉于底部；在醋酸钠产孢培养基上能产生子囊，子囊内形成2-4个圆形子囊孢子。

(2)抗逆性特征：E5.9在无乙酸和低于166mM乙酸压力下，培养36小时同时达到稳定期，在200mM乙酸压力下出现12h的生长延迟。

(3)产乙醇能力：E5.9在133mM乙酸压力下发酵20％葡萄糖，产生76g/L乙醇。

本发明所提供的抗逆筛选方法步骤如下：

1)菌株诱变：对酿酒酵母出发菌株进行紫外、EMS或微波诱变。

2)液体全筛选：将所有诱变菌株平均转接于1-100个24孔板，无选择压力预培养1-8小时(h)，添加选择压力继续培养至24孔板中多个孔出现抗性正突变。

3)固体平板筛选：稀释正突变培养物，涂布固体选择培养基，挑选优势克隆于选择性斜面培养基上培养。

4)传代驯化：将斜面上的抗性菌株在选择性液体培养基中传代驯化，筛选遗传稳定的抗逆性菌株。

以下通过实施例对本发明做进一步的阐述，但不应理解为对本发明的限制，在不背离发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换都属于本发明的范围。

实施例1：乙酸耐性酿酒酵母E5.9的筛选

1)出发菌株

通过分析96株不同来源酿酒酵母菌株的压力耐受性，从中选择综合抗逆性强的菌株XL14-1作为出发菌株。菌株鉴定采用表型和核糖体基因26S rDNA D1/D2区和ITS区序列分析方法。

2)秸秆预处理发酵液

秸秆汽爆预处理固体物由中粮生化能源(肇东)有限公司提供，经反复提取，获得水解液。在15％提取水解液中添加葡萄糖15％、酵母提取物0.6％、蛋白胨1％、(NH₄)₂SO₄ 0.2％、KH₂PO₄ 0.1％、MgSO₄.7H₂O 0.15％、CaCl₂0.055％做成预处理发酵液，葡萄糖终浓度为20.5％。

3)诱变

本发明采用的紫外诱变、EMS诱变和微波诱变三种诱变方法均按照常规方法进行。

4)生长曲线测定

生长曲线测定采用YPD培养基(酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)，添加乙酸至终浓度分别为0mM、50mM、83mM、133mM、166mM和200mM。

5)发酵产乙醇测试

种子培养基：酵母提取物0.6％，蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，KH₂PO₄0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.15％，CaCl₂ 0.055％，乙酸130mM，葡萄糖10％。

发酵培养基：酵母提取物0.6％，蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，KH₂PO₄0.1％，MgSO₄.7H₂O 0.15％，CaCl₂ 0.055％，乙酸130mM，葡萄糖20％。

6)分析方法

使用生物传感分析仪SBA-40D(济南)测定乙醇和葡萄糖浓度。

7)结果和讨论

7-1)菌株鉴定结果

菌株XL14-1的核糖体基因26S rDNA D1/D2区序列与酿酒酵母模式菌株序列相似性为100％，ITS区序列相似性为99％，结合表型鉴定，该菌株确定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。诱变菌株E5.9在这两个DNA区域无碱基变异，序列与出发菌株XL14-1完全相同(图1)。

7-2)紫外诱变结果

培养XL14-1至指数生长期，收集5×10⁷-2×10⁸个细胞，按照常规紫外诱变方法诱变，然后按照实施例2所述液体全筛选方法进行筛选，获得一系列能耐受130mM乙酸的菌株，最终选择乙酸耐受性和遗传稳定性最好的菌株C4为下一步诱变的出发菌株。

7-3)EMS诱变和发酵测试

以C4为出发菌株，进行EMS诱变。培养菌体至指数生长期，收集5×10⁷-2×10⁸个细胞，按照常规EMS诱变方法诱变，然后按照实施例2所述液体全筛选方法进行筛选，获得一系列在200mM乙酸压力下能生长的菌株。从中选择遗传稳定性好的菌株E5、E6、E9、E11、E13、E14和E15在133mM乙酸压力下进行发酵产乙醇测试。如图2所示，E5在133mM乙酸压力下发酵产乙醇量最高，达75g/L，该菌株为下一步诱变的出发菌株。

7-4)微波诱变和发酵测试

以E5为出发菌株，进行微波诱变。培养菌体至指数生长期，收集5×10⁷-2×10⁸个细胞，按照常规微波诱变方法诱变，然后按照实施例2所述液体全筛选方法进行筛选驯化，获得一系列在260mM乙酸压力下能生长的菌株。从中选择9个突变体进行133mM乙酸压力下发酵测试，如图3所示E5.9乙醇产率最高，达76g/L。

7-5)E5.9在乙酸压力下的生长测试

将E5.9在含130mM乙酸的YPD培养基中过夜培养，以初始OD600＝0.05为接种量，测定其在不同浓度乙酸压力下的生长曲线。如图4所示，E5.9在无乙酸和低于166mM乙酸压力下，同时在36h达到稳定期，在200mM乙酸压力下出现12h的生长延迟，而对照出发菌株在133mM乙酸下被完全抑制。

7-6)秸秆预处理发酵液的发酵

E5.9在种子发酵培养基中培养24-48h，以2g/L酵母培养物的接种量接种秸秆预处理发酵液，至发酵结束乙醇浓度为6％，糖醇转化率为57％，而对照出发菌株无法在预处理发酵液中生长。

实施例2：抗逆筛选方法—液体全筛选法

1、液体全筛选法流程

本方法包括四个步骤：(1)菌株诱变，(2)液体全筛选，(3)固体平板筛选，(4)传代驯化，其中液体全筛选是该方法的核心，参见图5。首先，应用紫外、EMS、微波或者其他诱变方法诱变酿酒酵母细胞，获得突变菌株库；其次，将诱变处理后的全部菌体细胞平均转接到24孔板中，120rpm，30℃预培养6h，然后在预培养菌液中加入选择压力，继续培养，至出现抗性正突变；再次，将正突变菌液稀释涂布相同浓度的固体选择培养基，待菌落长出，挑取大菌落在相同压力液体培养基中培养，培养物作为驯化出发菌株；最后，将驯化出发菌株多次在液体压力培养基中培养，以10％的接种量转接更高压力的培养基，进行菌株驯化，逐渐减小接种量，传代驯化。

2、抗逆菌株筛选实例

以酿酒酵母XL14-1作为研究对象。压力分别设置为：乙酸130mM，乙醇12％(v/v)，温度(42℃)，渗透压(2M KCl)，H₂O₂6mM，糠醛15mM，遗传霉素(G418)400μg/ml，20％玉米秸秆汽爆浸提液。

2-1)耐乙酸压力筛选

如图4，应用紫外、EMS和微波诱变菌株，经三次液体全筛选，最终获得的乙酸耐受性酿酒酵母E5.9能够在含166mM乙酸的YPD培养基中生长，与无乙酸条件同时达到稳定期，而对照出发菌株不能在133mM乙酸压力下生长。如图3，E5.9在含130mM乙酸的发酵培养基中产乙醇量达7.6％。

2-2)耐乙醇压力筛选

应用紫外诱变方法处理1×10⁸-2×10⁸个细胞，应用液体全筛选法，将所有细胞平均转接5个24孔板，预培养后施加12％(v/v)的乙醇压力，120个孔中有21个孔出现乙醇抗性正突变体，从中选择6个生长密度大的培养物稀释涂乙醇压力选择平板，分离单菌落。最终获得的突变菌株能够耐受12％(v/v)的乙醇，延迟期为12h，而出发菌株无法生长。

2-3)耐高温压力筛选

应用紫外诱变方法处理5×10⁷-2×10⁸个细胞，应用液体全筛选法，将所有细胞平均转接5个24孔板，30℃预培养后，转到42℃继续培养，有14个孔出现耐高温正突变体，从中选择7个菌体密度大的培养物稀释涂平板，42℃培养，分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在42℃生长，延迟期为6h，细胞终浓度可达7.5×10⁸个/ml，而出发菌株无法生长。

2-4)耐氧压筛选

应用紫外诱变方法处理5×10⁷-2×10⁸个细胞，应用液体全筛选法，将所有细胞平均转接5个24孔板，预培养后施加6mM H₂O₂压力，有9个孔出现乙醇抗性正突变体，将正突变培养物稀释涂氧压平板，分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在6mM H₂O₂压力下生长，延迟期为8h，稳定期细胞浓度与无压力对照相近，而出发菌株无法生长。

2-5)耐渗透压筛选

应用紫外诱变方法处理5×10⁷-2×10⁸个细胞，应用液体全筛选法，将所有细胞平均转接5个24孔板，30℃预培养后，加入KCl至终浓度为2mol/L，继续培养，有33个孔出现耐渗透压正突变体，从中选择6个菌体密度大的培养物稀释涂渗透压选择平板，分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在含2M KCl的YPD培养基中生长，延迟期为16h，细胞终浓度为4×10⁸个/ml，而出发菌株无法生长。

2-6)耐糠醛筛选

应用紫外诱变方法处理5×10⁷-2×10⁸个细胞，应用液体全筛选法，将所有细胞平均转接5个24孔板，30℃预培养后，加入糠醛至终浓度为15mmol/L，继续培养，有28个孔出现耐糠醛正突变体，从中选择6个菌体密度大的培养物稀释涂糠醛选择平板，分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在含15mM糠醛的YPD培养基中生长，延迟期为16h，而出发菌株无法生长。

2-7)耐遗传霉素筛选

应用紫外诱变方法处理5×10⁷-2×10⁸个细胞，应用液体全筛选法，将所有细胞平均转接5个24孔板，30℃预培养后，加入遗传霉素至终浓度为400μg/ml，继续培养，有5个孔出现耐遗传霉素正突变体，将正突变培养物稀释涂遗传霉素选择平板，分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在含400μg/ml遗传霉素的YPD培养基中生长，延迟期为8h，稳定期细胞浓度与无压力对照相近，而出发菌株无法生长。

2-8)耐玉米秸秆汽爆水解物筛选

应用紫外诱变方法处理5×10⁷-2×10⁸个细胞，应用液体全筛选法，将所有细胞平均转接5个24孔板，30℃预培养后，离心，用PBS缓冲液洗涤细胞两次，加入含20％玉米秸秆汽爆浸提液的YPD培养基，继续培养，测定细胞浓度，稀释6个细胞浓度大的培养物，涂布浸提液压力平板，分离单菌落。最终获得的突变菌株能够在含20％玉米秸秆汽爆浸提液的YPD培养基中生长，稳定期细胞浓度为5×10⁸个/ml，而出发菌株无法生长。