一种牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法

摘要

一种牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明采用戊二醛法将新霉素（NEO）与牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）偶联合成新霉素抗原（免疫原NEO-BSA或包被原NEO-OVA），利用红外光谱法和SDS-PAGE凝胶电泳法对NEO-BSA进行鉴定，通过免疫获得新霉素抗血清，并用间接ELISA法检测其效价，通过一步ELISA法对新霉素抗血清的特异性进行检测。本发明相对于间接竞争ELISA法，由于极大地缩短了新霉素抗体特异性的检测时间，并且具有很高的灵敏度，达到了简单、快速、灵敏的检测牛奶中的新霉素残留，可广泛的用于快速现场检测。

说明书

技术领域

一种针对牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，属于免疫分析化学技术领域。

背景技术

新霉素（neomycin，NEO）是由链霉素菌属弗氏链霉菌产生的多组分抗生素，含新霉素B和C两种同分异构体（结构式如下所示），但只有新霉素B具有抗菌活性。新霉素为水溶性的碱性抗生素，市场上常用制剂为白色或类白色粉末状的硫酸新霉素，具有较强的吸湿性，长期暴露在空气中会因为吸收水分而潮解。而新霉素本身具有极强的稳定性，对与酸，碱，热等环境因素的耐受性明显强于其它抗生素。新霉素极易溶于水，但几乎不溶于乙醇、乙醚、丙酮或氯仿等有机溶剂中，具有旋光活性。

新霉素属氨基糖苷类抗生素药物，由于其广谱抗菌性，能够极好的抑制革兰氏阴性菌的生长，目前已广泛应用于医药和兽药领域。在兽医临床上，新霉素成为预防和治疗畜禽细菌性肠炎的首选药物之一，其功效特佳。目前，我国和其他一些国家还将新霉素添加到动物饲料中，一方面提高饲料利用率，促进动物的生长，同时预防由细菌感染引起的疾病而避免损失。但是新霉素吸收毒性大，主要表现为耳毒性和肾毒性，新霉素残留对人体健康危害较大。为了保障民众的食品安全，增强动物源食品的国际竞争力，必须将动物源食品中新霉素残留的检测纳入常规检测中去。

有关新霉素含量测定的方法很多，国内外主要报道的有微生物学法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、液质联用法、免疫分析法、毛细管电泳法和离子交换法等。在这些残留分析方法中，TLC法主要作为一种提纯手段，而电泳法和微生物学方法因为操作繁琐、灵敏度不高，检测速度较慢和特异性较低而受到限制，因此高效液相色谱法和免疫学方法成为新霉素主要分析方法。高效液相色谱法较之微生物法有较高的灵敏度和特异性，但设备昂贵，对实验人员素质也有较高要求，分析费时而不易推广，同时它还需要复杂繁琐的样品前处理且不能同步筛选大量的样品，这些影响因素的存在无疑是不适合及时监控，现场检测的。目前免疫分析是利用抗原与抗体的特异性结合反应为基础的分析技术，以抗体为核心试剂，具有高选择性、高灵敏度等特点。目前国外所采用的基本上都是酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，尤其是用于牛奶、血浆和蜂蜜样品中的残留检测，能够达到很好的检测效果。Jin等成功制备抗新霉素的单克隆抗体，并采用直接竞争ELISA法测定血浆和牛奶中新霉素残留半数抑制浓度IC₅₀=50 ng/mL．在磷酸盐缓冲溶液、血浆，牛奶中的检测限（LOD）分别是6.85 ng/mL、3.61 ng/mL，2.73 ng/mL。

但目前的新霉素免疫分析方法检测时间相对仍然较长，检测限不够高。因此开发针对动物源食品中新霉素残留的更加便捷、快速、灵敏的测定技术，建立新霉素残留的快速检测方法及相应的技术标准是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种更加快速、简单、灵敏的一步ELISA方法，用于检测牛奶中的新霉素残留。

本发明的技术方案：一种牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，包括新霉素抗原的合成与鉴定，新霉素抗血清效价的测定和新霉素抗血清特异性的检测。

工艺步骤为：

(1) 利用戊二醛法合成新霉素抗原（免疫原和包被原）；

(2) 利用红外光谱法（IR法）和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）对抗原进行鉴定；

(3) 通过免疫获得抗新霉素抗血清；

(4) 利用间接ELISA法测定新霉素抗体的效价；

(5) 利用一步ELISA法检测新霉素抗体的特异性；

所述新霉素抗原：免疫原和包被原的合成：

①称取80 mg 新霉素NEO，40mg 牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA溶于10 mL、0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液中；

②充分溶解后逐滴加入1.5mL 质量浓度1% 戊二醛溶液，室温搅拌反应30 min；

③加入112 mg NaBH₄，4℃冰箱中静置1h；

④反应液用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液透析3天，间隔6h换液；

所得NEO-BSA偶联物为免疫原，所得NEO-OVA偶联物为包被原。

所述利用红外光谱法进行新霉素免疫原的鉴定：

①分别称取NEO标准品，BSA和NEO-BSA样品各2 mg；

②分别加入干燥的溴化钾KBr 200 mg，混合物置于玛瑙研钵中，在红外灯照射下混匀、充分研磨；

③装入压片模具，在10吨压力下压片10 min，制得厚度1 mm的透明 KBr药品压片；

④分别制取相应的KBr-NEO，KBr-BSA，及KBr-NEO-BSA  3块样品压片，随后上红外光谱仪测试鉴定。

所述利用SDS-PAGE凝胶电泳法进行新霉素免疫原的鉴定：

①分离胶10%，浓缩胶5%，电压100V，电流20mA，电泳时间1.5h；

②固定液为12.5%的三氯乙酸溶液，固定30min；

③含0.1%考马斯亮蓝G250的固定液染色1h；

④超低分子量标准蛋白分子量分别为：兔肌球蛋白200000、钙调蛋白130000、兔磷酸化酶B 97400、牛血清白蛋白66200、兔肌动蛋白43000。将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，获得一条标准曲线；

⑤当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质在SDS-PAGE电泳中的迁移率和它的分子量的对数呈线性关系，符合下式：log(Mw)=k-b×R_f，式中：Mw为蛋白质分子量，R_f为迁移率，k、b均为常数，将未知分子量的待测蛋白质在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，根据它的电泳迁移率在标准曲线上求得其分子量。

所述制备新霉素抗血清，并进行新霉素抗体效价的测定：

①包被：将新霉素包被原NEO-OVA用包被缓冲液作系列梯度稀释后加入96孔酶标板中包被，100 μL/孔，于4 ℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，甩干，每孔注入200 μL 0.01mol/L PBST溶液作为洗涤液，水平摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤3次，以下洗涤方法相同；

②封闭：充分洗涤后，加入0.01M的PBST封闭液封闭酶标板，200 μL/孔，于37℃烘箱内温育2h后，重复洗涤3次，放入烘箱中10min烘干后取出待用；

③竞争：将抗新霉素阳性抗血清稀释系列梯度，对应加入到酶标板7行，第8行加入阴性血清，100 μL/孔，37 ℃孵育30min后洗涤、拍干；

④加二抗：每孔加入100 μL，1:3000稀释的酶标二抗HRP-IgG，37 ℃烘箱中孵育30 min后洗涤、拍干；

⑤显色：每孔加入100 μL显色液，TMB与底物缓冲液体积配比为1:5，37 ℃烘箱暗处反应15 min；

⑥终止：取出后每孔加入100 μL终止液，即2 mol/L的硫酸，用酶标仪测定450nm处的吸光值A₄₅₀。

选择阳性血清的A₄₅₀值在1.5-1.9，同时与阴性血清的A₄₅₀值差距最大的包被原稀释浓度、抗体稀释浓度为最佳工作浓度。

阳性血清的A₄₅₀≥阴性对照孔的2.1倍，并且A₄₅₀大于0.1，此时血清的稀释倍数即为血清的效价。

所述利用一步ELISA法进行新霉素抗体特异性的测定：

① 包被：取两条8孔的酶标板，以工作点检测所选择出来的最佳包被浓度对包被原进行系列梯度稀释并进行包被，100 μL/孔，设置两个对照，置于4℃冰箱保存过夜，PBST洗液洗涤三次，每次3 min，拍干；

② 封闭：以0.01M的PBST封闭液封闭，200 μL/孔，置于4℃冰箱保存过夜，PBST洗液洗涤三次，每次3 min，拍干；

③ 竞争：第一排加抗体稀释液，第二排起分别加7个浓度的新霉素标准溶液，50 μL/孔，以工作点检测所选择最佳稀释浓度稀释抗体，50 μL/孔添加，同时各孔均加入1:3000稀释的酶标二抗，100 μL/孔，于振荡器上充分振荡，37℃放置30 min，PBST洗液洗涤五次，每次3 min，拍干；

④ 显色：加入显色液，底物缓冲液与TMB体积比5:1，100 μL/孔，37℃反应15 min；

⑤ 终止：加终止液，2 mol/L浓硫酸，100 μL/孔，酶标仪上检测各孔吸光度；

⑥ 求出各浓度的B/B₀：B/B₀=B_校正值/B_0校正值。

B_校正值=Ab_实测均值－Ab_空白均值

B_0校正值为新霉素标准品溶液添加浓度为0 ng/mL时的吸光值，即阴性对照孔的校正值。

IC₅₀为达到吸光值为最大吸光值A_max一半时所添加的的新霉素标准品浓度，以B/B₀为纵坐标，以新霉素标准品溶液添加的系列梯度浓度的对数值为横坐标在EXCEL上作图，即得新霉素的抑制标准曲线。

本发明的有益效果：本发明制备了一种针对牛奶中新霉素残留的一步ELISA检测方法，并且相对于间接竞争ELISA法，由于极大地缩短了新霉素抗体特异性的检测时间，并且具有很高的灵敏度，达到了简单、快速、灵敏的检测牛奶中的新霉素残留，可广泛的用于快速现场检测。

附图说明

图1 红外光谱法鉴定新霉素免疫原的合成。

图2 SDS-PAGE凝胶电泳法鉴定新霉素免疫原。A、BSA，B、NEO-BSA，C，Marker。

图3 新霉素抗体的一步ELISA抑制标准曲线。

具体实施方式

实施例1

（1）戊二醛法合成新霉素抗原

①称取80 mg 新霉素，40mg 牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA） 溶于10 mL、0.01 mol/L PBS中；

②充分溶解后逐滴加入1.5mL 1% 戊二醛溶液，室温搅拌反应30 min；

③加入112 mg NaBH₄，4℃冰箱中静置1h；

④反应液用0.01mol/L 磷酸盐缓冲液透析3天，间隔6h换液；

所得NEO-BSA偶联物为免疫原，所得NEO-OVA偶联物为包被原。

（2）红外光谱法（IR法）鉴定新霉素免疫原(NEO-BSA)

①分别称取NEO标准品，BSA和 NEO-BSA样品各 2 mg；

②分别加入干燥的溴化钾（KBr）200 mg, 混合物置于玛瑙研钵中，在红外灯照射下混匀、充分研磨；

③装入压片模具，在10 吨压力下压片10 min，制得厚度1 mm的透明 KBr药品压片

④分别制取相应的KBr-NEO，KBr-BSA，及KBr-NEO-BSA  3块样品压片，随后上红外光谱仪测试鉴定。

（3）SDS-PAGE凝胶电泳法鉴定NEO-BSA

①分离胶10%，浓缩胶5%，电压100V，电流20mA，电泳时间1.5h；

②固定液为12.5%的三氯乙酸溶液，固定30min；

③含0.1%考马斯亮蓝G250的固定液染色1h；

④超低分子量标准蛋白分子量分别为：兔肌球蛋白200000、钙调蛋白130000、兔磷酸化酶B 97400、牛血清白蛋白66200、兔肌动蛋白43000。将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，获得一条标准曲线；

⑤当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质在SDS-PAGE电泳中的迁移率和它的分子量的对数呈线性关系，符合下式：log(Mw)=k-b×R_f（式中：Mw为蛋白质分子量，R_f为迁移率，k、b均为常数），将未知分子量的待测蛋白质在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，根据它的电泳迁移率在标准曲线上求得其分子量。

（4）间接ELISA法测定新霉素抗体的效价

采用间接竞争ELISA方法，方阵滴定法确定包被原和免疫血清的最适工作浓度，在最佳工作浓度下测定NEO抗血清的效价，HRP标记的羊抗兔IgG（HRP-IgG）选用推荐浓度1:3000。

①包被：将新霉素包被原（NEO-OVA）用包被缓冲液作系列梯度稀释后加入96孔酶标板中包被，100 μL/孔，于4 ℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，甩干，每孔注入200 μL 0.01mol/L PBST溶液作为洗涤液，水平摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤3次。以下洗涤方法相同。

②封闭：充分洗涤后，加入0.01M的PBST封闭液封闭酶标板，200 μL/孔，于37℃烘箱内温育2h后，重复洗涤3次，放入烘箱中10min烘干后取出待用。

③竞争：将抗新霉素阳性抗血清稀释系列梯度，对应加入到酶标板7行，第8行加入阴性血清，100 μL/孔，37 ℃孵育30min后洗涤、拍干。

④加二抗：每孔加入100 μL，1:3000稀释的酶标二抗（HRP-IgG），37 ℃烘箱中孵育30 min后洗涤、拍干。

⑤显色：每孔加入100 μL显色液（TMB与底物缓冲液体积配比为1:5），37 ℃烘箱暗处反应15 min。

⑥终止：取出后每孔加入100 μL终止液（即2 mol/L的硫酸），用酶标仪测定450nm处的吸光值A₄₅₀。

选择阳性血清的A₄₅₀值在1.5-1.9，同时与阴性血清的A₄₅₀值差距最大的包被原稀释浓度、抗体稀释浓度为最佳工作浓度。

阳性血清的A₄₅₀≥阴性对照孔的2.1倍并且A₄₅₀大于0.1，此时血清的稀释倍数即为血清的效价。

（5）一步ELISA法检测新霉素抗体的特异性

① 包被：取两条8孔的酶标板，以工作点检测所选择出来的最佳包被浓度对包被原进行系列梯度稀释并进行包被，100 μL/孔，设置两个对照。置于4℃冰箱保存过夜。PBST洗液洗涤三次，每次3 min，拍干。

② 封闭：以0.01M的PBST封闭液封闭，200 μL/孔，置于4℃冰箱保存过夜。PBST洗液洗涤三次，每次3 min，拍干。

③ 竞争：第一排加抗体稀释液，第二排起分别加7个浓度的新霉素标准溶液，50 μL/孔。以工作点检测所选择最佳稀释浓度稀释抗体，50 μL/孔添加，同时各孔均加入1:3000稀释的酶标二抗，100 μL/孔，于振荡器上充分振荡，37℃放置30 min。PBST洗液洗涤五次，每次3 min，拍干。

④ 显色：加入显色液（底物缓冲液与TMB体积比5:1），100 μL/孔，37℃反应15 min。

⑤ 终止：加终止液(2 mol/L浓硫酸硫酸)，100 μL/孔，酶标仪上检测各孔吸光度。

⑥ 求出各浓度的B/B₀：B/B₀=B_校正值/B_0校正值。

B_校正值=Ab_{实测值(均值)}－Ab_{空白值(均值)}

B_0校正值为新霉素标准品溶液添加浓度为0 ng/mL时的吸光值，即阴性对照孔的校正值。

IC₅₀为达到吸光值为最大吸光值(A_max)一半时所添加的的新霉素标准品浓度。以B/B₀为纵坐标，以新霉素标准品溶液添加的系列梯度浓度的对数值为横坐标在EXCEL上作图，即得新霉素的抑制标准曲线。