一种可以诱导肿瘤免疫反应的海藻酸盐微颗粒的制备方法

摘要

本发明提供一种可以诱导肿瘤免疫反应的海藻酸盐微颗粒的制备方法，利用基因工程技术，构建MIP-3α真核表达质粒并转化肿瘤细胞，通过筛选获得稳定表达MIP-3α的肿瘤细胞。同时培养大肠杆菌并溶于海藻酸盐溶液中，经高温高压消毒后将MIP-3α肿瘤细胞混匀于细菌海藻酸盐溶液中，此后采用雾化器将“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐溶液”进行雾化，并将雾化颗粒喷入氯化钙溶液中，经过纱网过滤后获得可以注射的MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒，“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”在体外培养环境中可以表达分泌MIP-3α蛋白。将微颗粒注入小鼠膜腔，在肿瘤模型中证实有效抑制肿瘤生长和转移，具有明显的治疗肿瘤的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种海藻酸盐微颗粒，尤其涉及一种可以诱导肿瘤免疫反应的海藻酸盐微颗粒的制备方法。

背景技术

恶性肿瘤治疗仍然是世界难题，免疫生物治疗是当前研究热点。树突状细胞(dendritic cells，DC)是目前所知的功能最强，并且是唯一能激活初始T细胞(native T cell)的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，具有强大的激活CD8⁺T细胞毒淋巴细胞(CTL)及CD4⁺T辅助细胞的能力，控制着体内免疫反应的过程，是肿瘤免疫反应的中心环节。DC主要分布于骨髓、外周血及抗原暴露较多的器官和淋巴组织中，在未接触处理抗原之前的DC称为未成熟DC(immature DC)，不成熟的DC具有极强的捕获和加工处理抗原的能力；当DC捕获处理抗原后则转化为成熟DC(mature DC)，在这个过程中，成熟的DC迁移进入淋巴组织，并具有非常强的激活初始(naive)T细胞，诱导特异性免疫应答的能力。

当前用DC细胞加肿瘤抗原或多肽在体外培养、用肿瘤细胞总RNA转化修饰DC等方法制备的DC疫苗已经在临床应用。但是，由于外周血有核细胞中的DC比例仅占总细胞的0.1％，并且肿瘤细胞本身往往分泌一些细胞因子(如IL-10、VEGF、IL-6、TGF-β等)进而抑制DC的分化、募集和递呈抗原的能力。因此，当前制备DC疫苗必须在体外培养扩增，然后再把病人的肿瘤细胞或人工制备的抗原和扩增的DC细胞共同进行培养，让DC在体外对肿瘤抗原进行适当处理后再输回患者体内。这种制备疫苗的方法过程比较复杂，需要一定的技术和经验，制备方法较难标准化，治疗成本也高，疗效也往往随着实验室不同而不同。这种“作坊”式的制备方法严重影响了DC疫苗在临床的进一步应用。由此可见，寻找一种诱导肿瘤免疫的“体内”DC疫苗方法能够使DC疫苗治疗肿瘤变得简单有效，是一种更好的治疗策略。

研究表明，巨噬细胞炎症蛋白-3α(macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α)是DC特异的趋化因子，它通过吸引表达CCR6的未成熟DC趋化于病原感染组织，使DC能够接触处理和递呈抗原，此后，DC表达CCR6下调，迁移进入淋巴组织，进一步转化为成熟的DC并将抗原递呈给CD8+T淋巴细胞，进而诱导获得性免疫的产生。为此，我们设想，如果设法在体内让肿瘤细胞直接表达分泌MIP-3α，就能促使DC向肿瘤细胞趋化，进而增加DC细胞和肿瘤细胞抗原接触的机会，提高DC递呈肿瘤抗原的能力，这样就可达到当前体外DC疫苗的治疗目标，但是却省去复杂的体外操作，降低治疗成本，较体外DC疫苗安全，具有更好的临床应用前景。

海藻酸盐(alginate)是从海藻中提取的一种有机化合物，在体外溶解于水后再与钙离子接触便会形成固体状结构。我们的研究结果表明，包被肿瘤细胞的海藻酸盐颗粒植入体内后肿瘤细胞能够存活2周以上，并且细胞分泌的抗血管生成因子(如endoglin，TGF-β等)能够自由进出。目前，研究结果也表明，直径为200～400μm的海藻酸盐微粒包被的细胞可在异种动物体内存活，并且能让低分子量营养物质(如电解质，氧、细胞代谢产物、细胞因子等生物活性物质)自由进出，但是其它大分子物质(如免疫球蛋白等)则被排斥于海藻酸盐颗粒之外，这样就能使异种或同种细胞的存活，并且可以分泌细胞活性物质。

综上所述，我们设想利用基因工程技术将MIP-3α质粒转化肿瘤细胞，然后将转染MIP-3α的肿瘤细胞包裹于海藻酸盐微颗粒中，并且在制作海藻酸盐微颗粒的过程中，加进细菌成分(细菌抗原是天然的诱发免疫反应的物质)。我们将包含有可以分泌MIP-3α的肿瘤细胞、细菌成分的藻酸微颗粒当作疫苗、注射于肿瘤组织、皮下或腹腔，就有可能诱导DC细胞及其它免疫反应细胞到达海藻酸盐微颗粒部分，在处理细菌和海藻酸盐微颗粒的同时，也将肿瘤细胞抗原进行处理，因而诱导强有力的肿瘤免疫反应，这是一种具有治疗肿瘤前景的新的技术方法。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种可以诱导肿瘤免疫反应的海藻酸盐微颗粒的制备方法，将本发明的MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒注入小鼠膜腔，在肿瘤模型中证实可以有效抑制肿瘤生长和转移，具有明显的治疗肿瘤的作用，展示出了良好的应用前景。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种可以诱导肿瘤免疫反应的海藻酸盐微颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、构建MIP-3α真核表达质粒并将其转染肿瘤细胞；

(2)、通过G418筛选获得可以稳定表达MIP-3α的肿瘤细胞株，称为MIP-3α肿瘤细胞；

(3)、培养大肠杆菌，将大肠杆菌溶于质量浓度为1.5％的海藻酸盐溶液，获得细菌海藻酸盐溶液；

(4)、将步骤(2)的MIP-3α肿瘤细胞混匀于经高温高压消毒后的步骤(3)的细菌海藻酸盐溶液中，此时获得“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐溶液”；

(5)、通过雾化器将步骤(4)的“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐溶液”进行雾化，并将雾化颗粒喷入250mMol/L(这是摩尔浓度)的氯化钙溶液中，经过孔径大小不同纱网过滤后获得直径50-300μm并且可以注射的“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”。

较佳地，步骤(3)具体为：将海藻酸盐按1.5g/100ml的比例溶于纯水，配制成质量浓度为1.5％的海藻酸盐溶液；同时挑取在平板上培养的大肠杆菌DH5α培养12～14小时，第二天在8000rpm、离心1分钟条件下获得大肠杆菌，用PBS或生理盐水清洗1-2次后按1×10⁷/ml(每ml溶液中加进大肠杆菌1×10⁷/个)大肠杆菌加入质量浓度为1.5％的海藻酸盐溶液中，获得细菌海藻酸盐溶液。

较佳地，步骤(4)具体为：配制250mMol/L浓度的氯化钙溶液，将细菌海藻酸盐溶液和250mMol/L浓度的氯化钙溶液二者在121℃，0.1～0.15MPa，20min条件下高温高压消毒；然后在无菌条件下，将步骤(2)的MIP-3α肿瘤细胞加入经高温高压消毒后的细菌海藻酸盐溶液中，此时获得的混合液为“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐溶液”。

将包含有可以分泌MIP-3α肿瘤细胞、细菌成分的海藻酸盐微颗粒当作疫苗、注射于肿瘤组织、皮下或腹腔，发现可以有效诱导DC细胞及其它免疫反应细胞达到海藻酸盐微颗粒部分，在处理细菌和海藻酸盐的同时，也将肿瘤细胞抗原进行处理，因而诱导强有力的肿瘤免疫反应，这是一种具有治疗肿瘤前景的新的技术方法。

附图说明

图1为本发明构建的MIP-3α的真核表达质粒pcDNA3.1-mMIP-3α的构建方法和鉴定结果。图1A为MIP-3α来源质粒；图1B为PCR扩增mMIP-3α的结果；图1C为使用BstXI(泳道1)和Hind III(泳道2)进行酶切分析的结果；图1D为基因测序分析结果。

图2为本发明将重组质粒pcDNA3.1-mMIP-3α转染小鼠黑色素瘤细胞B16并对分泌MIP-3α肿瘤细胞进行筛选和鉴定。图2A为RT-PCR检测MIP-3αmRNA表达(泳道1)；图2B使用免疫蛋白印迹技术(Western blot)检测MIP-3α蛋白质表达(泳道1)；其它泳道为对照。

图3为本发明制备的“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”的制备和鉴定结果。图3A和图3B为本发明制备的“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”，图3C为本发明使用的雾化器，其中图3B经过染色；图3D显示包埋于本发明“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”中的肿瘤细胞(其中细胞从数个至数十个不等)；图3E显示用Western blot方法检测本发明制备的“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”在体外培养的环境中可以表达分泌MIP-3α蛋白质。

图4为本发明制备的“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”注入小鼠腹腔后具有治疗肿瘤的作用。图4A和图4B分别为肿瘤体积和生存时间(治疗组显示肿瘤体积明显减少，治疗组小鼠生存时间明显延长)；图4C为一例肿瘤治愈的小鼠不同时间肿瘤的外观变化(肿瘤最终消失，留下伤疤)；图4D为本发明制备的“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”可以有效抑制肿瘤的转移(治疗组肺部转移瘤明显少于对照组)。

具体实施方式

下面结合优选实施例对本发明作进一步说明，但本发明决不限于下述实施例。

(1)MIP-3α的真核表达质粒的构建与鉴定

我们从InvioGen公司购进了克隆质粒pORF5-mMIP3α，根据该质粒提供的序列并参照基因库mMIP3α基因序列，设计了一对PCR引物(上游引物：5’-CGT CTA GAT TAC ATC TTC TTG ACT CTT AGG C-3’；下游引物：5’-AAGAAT TCATGG CCT GCG GTG GAAA-3’)，将质粒pORF5-mMIP3α作为模板，利用PCR方法(94℃ 30sec；56℃ 1min；72℃ 3.5min；共30个循环)扩增小鼠MIP-3α基因(图1B)。此后，利用基因工程技术，通过酶切及连接等步骤将PCR扩增获得的MIP-3α基因连接到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，利用酶切(图1C)及基因测序(图1D)方法进行分析，获得正确的重组真核表达质粒pcDNA3.1-mMIP-3α，图1为本发明构建的MIP-3α的真核表达质粒pcDNA3.1-mMIP-3α的构建方法和鉴定结果；图1A为MIP-3α来源质粒。

(2)MIP-3α真核表达质粒转染肿瘤细胞稳定株的筛选和鉴定

图2为本发明将重组质粒pcDNA3.1-mMIP-3α转染小鼠黑色素瘤细胞B16并对分泌MIP-3α肿瘤细胞进行筛选和鉴定。利用脂质体转染技术，将重组pcDNA3.1-mMIP-3α质粒转染小鼠黑色素瘤B16细胞，经G418筛选获得了转染了重组pcDNA3.1-mMIP-3α质粒稳定的小鼠黑色素瘤B16细胞株。用RT-PCR和Western blotting检测mMIP-3α在mRNA和蛋白质水平的表达。结果说明，转染pcDNA3.1-mMIP-3α质粒的小鼠黑色素瘤B16细胞可以在RNA(图2A)和蛋白质(图2B)水平有效表达。

(3)“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”的制备和鉴定

图3为本发明制备的“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”的制备和鉴定结果。图3A和图3B为本发明制备的“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”。将海藻酸盐(Alginic acid，sodium salt，SIGMA-ALDRICH产品)按1.5g/100ml)溶于纯水，配制成1.5％的海藻酸盐溶液(加超纯水经高温高压消毒后会完全溶解)。同时挑取在平板上培养的大肠杆菌DH5α培养过夜约12～14小时，第二天8000rpm离心1分钟获得大肠杆菌(用PBS或生理盐水清洗1-2次)，按1×10⁷/ml将大肠杆菌加入海藻酸盐溶液中，获得“细菌海藻酸盐溶液”。

配制250mMol浓度的氯化钙溶液(将称重获取的钙溶于纯净水)，“细菌海藻酸盐溶液”和250mMol氯化钙溶液将二者高温高压消毒(121℃，1kpa，20min)。然后在无菌条件下，按1×10⁶/ml的浓度将转染MIP-3α的肿瘤细胞加入“细菌海藻酸盐溶液”(此时的混合溶液称“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐溶液”)，接着利用我们自制的钙雾化设备(图3C)方法将“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐溶液”雾化喷入250mMol浓度的氯化钙溶液中，获得大小不一的“颗粒”，最后将这些大小不一的“颗粒”通过不同孔径的“筛子”，获得直径50-300μm“颗粒”(图3A和图3B)，将其命名为“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”。“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”具可注射性，在显微镜下可见包埋的肿瘤细胞，每个颗粒可以包埋数个至数十个细胞不等(图3D)，经体外培养并用Western blot检测方法发现“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”培养上清可以检测到MIP-3α蛋白(图3E)，说明“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”可以有效表达并分泌MIP-3α。

(4)“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”的抗肿瘤作用

图4为本发明制备的“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”注入小鼠腹腔后具有治疗肿瘤的作用。我们体外培养小鼠黑色素瘤B16细胞，然后接种到C57BL/6小鼠右胁肋部(1×10⁶个细胞)或经尾静脉注射(1×10⁵个细胞)，分别建立小鼠黑色素瘤实体和转移肿瘤模型。在建立肿瘤模型前一周(因为注射“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”作为疫苗诱导免疫反应最短时间需要2周)，按1×10⁴/ml“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”的浓度给每只小鼠腹腔注射200μl“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”(作为疫苗)。其中实验小鼠设三组(海藻酸盐微颗粒对照组、细菌海藻酸盐对照组、肿瘤细菌海藻酸盐治疗组)。实体肿瘤模型观察小鼠肿瘤的肿瘤体积(图4A)和生存时间(图4B)，转移肿瘤模型经尾静脉注射肿瘤细胞20天后处死小鼠，取出肺脏观察肺表面转移肿瘤有数量(图4D)。结果发现“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”治疗组小鼠肿瘤体积明显小于对照组(图4A)，观察5只小鼠中有一只肿瘤完全消失(图4C)；同时治疗组小鼠生存时间明显长于对照组(图4B)。肿瘤转移模型观察也发现，“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”治疗组小鼠肺部转移不明显(图4D)，统计学处理具有非常明显的差异(p＜0.0001)。说明“MIP-3α肿瘤细胞细菌海藻酸盐微颗粒”具有抗肿瘤生长和转移的作用。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。