基因突变和B-raf基因点突变V600E的一步检测方法及试剂盒

摘要

本发明一种基因突变的一步检测方法，该方法将酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR整合在一起，通过有效的温度和时间控制，一步即可完成酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR反应从而实现突变等位基因的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及酶切富集PCR技术和ARMS荧光定量PCR技术。

背景技术

近年来肿瘤的发病率逐年上升，肿瘤成为了人类健康的头号杀手。肿瘤的产生主要原因在于基因突变。大部分肿瘤患者在确诊时都是晚期，绝大多数晚期患者没有手术根治性治疗的机会，化放疗的临床效果也不理想。随着技术的进步，个体化医疗逐渐进入临床实践中。个体化治疗方案的确定，依赖于基因突变检测的结果。目前，一些医院和肺癌中心，已经开始着手组建专门用于肺癌临床诊断的基因突变检测机构，但是目前我国绝大多数医院并不具有基因突变检测的能力，检测的方法仍不成熟。

最新研究表明：B-raf基因突变被发现存在于肺癌、黑色素瘤、大肠癌等多种恶性肿瘤中，结合EGFR、K-ras基因突变的检测信息制定出最为适合病人个体的肿瘤治疗方案。为临床医生用药提供用药科学依据，降低医生治疗风险以及患者经济负担。因此，针对B-raf基因提供一种简便、快速、灵敏、特异性高的检测方法成为目前临床上迫切的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因突变一步检测方法，本方法整合了酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR技术。

本发明的第一方面提供一种基因突变一步检测方法，在同一反应体系中包括样本DNA、限制性酶、富集引物、ARMS引物、TaqMan探针、聚合酶及缓冲液，控制反应条件依次进行如下反应：

1)限制性内切酶特异性地酶切样本DNA中待测野生型等位基因的要检测部分；

2)在反应1)的基础上，富集引物通过PCR反应富集样本DNA中覆盖待测基因突变位点的要检测部分的片段；

3)在反应2)的基础上，ARMS引物及Taqman探针通过荧光定量PCR反应对所述突变基因进行荧光检测。

在一个实施方案中，所述富集引物的Tm值比所述ARMS引物高5℃。

在另一个实施方案中，所述富集引物扩增片段长度是ARMS引物扩增片段的1.5倍以上。

在另一个实施方案中，所述ARMS引物3’末端碱基与所述突变基因的突变碱基完全互补或相同。

在另一个实施方案中，所述ARMS引物的3’末端第4个碱基引入错配碱基。

在另一个实施方案中，所述聚合酶扩增效率为每分钟约500bp。

在另一个实施方案中，要检测的基因突变是B-raf基因的点突变V600E。优选地，所述限制性内切酶为TspR1；所述富集引物的序列为：上游引物：CATCCTAACACATTTCAAGCCCCA(SEQ IDNO：1)，下游引物：GAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAAC(SEQ ID NO：2)；所述ARMS引物的序列为：上游引物：GGTGATTTTGGTCTAGCTATAGA(SEQ ID NO：3)，下游引物：CACAAAATGGATCCAGACAAC(SEQ ID NO：4)；所述Taqman探针的序列为：ATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGT(SEQ IDNO：5)。更优选地，反应条件为：1)37℃温浴30分钟；2)95℃10分钟；95℃20秒、65℃20秒、72℃60秒，共10个循环；3)95℃5秒、60℃30秒(收集荧光)，共40个循环。

本发明的第二方面提供一种B-raf基因的点突变V600E的一步检测试剂盒，包括：限制性内切酶TspRI；SEQ ID NO：1和2的富集引物；SEQ ID NO：3和4的ARMS引物以及5’端FAM标记的SEQ IDNO：5的Taqman探针。

在一个实施方案中，还包括一种扩增效率为每分钟约500bp的聚合酶及其缓冲液。在一个优选实施方案中，所述聚合酶为包含在Universal Taqman Mix(美国ABI公司)中的Taq酶。

本发明通过将酶切富集PCR和ARMS荧光定量PCR技术整合在一个反应体系中，一步即可实现对突变基因的富集和鉴定，减少了操作步骤，提高了检测灵敏度和特异性。

以B-raf基因的点突变V600E为例进行具体实施说明(B-raf野生型基因序列见Genbank No.NM_004333，V600E突变即该序列中编码B-raf蛋白第600个氨基酸缬氨酸的GTG密码子突变为编码丙氨酸的密码子GAG)。

附图说明

图1是检测的阳性结果。

具体实施方式

在本说明书中，“要检测部分”是指在不被酶切的情况下，可由所述富集引物通过PCR扩增的序列部分。“约500bp”是指500±100bp。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例

实施例1.引物和探针设计

1)富集引物设计

设计可扩增400-500bp片段的引物，相关参数为：Tm值65.0℃-68.0℃，GC值40.0％-65.0％，引物大小23±3bp。所设计的富集引物序列如下：

富集上游引物：CATCCTAACACATTTCAAGCCCCA(SEQ IDNO：1)

富集下游引物：GAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAAC(SEQ ID NO：2)

2)ARMS引物设计

设计可扩增一段80-120bp片段的引物，相关参数为：Tm值55.0℃-60.0℃，GC值40.0％-60.0％，引物大小20±3bp。上游ARMS引物的3’末端位于突变位点处，并与突变型基因相匹配，为提高特异性，在其3’末端第4个碱基处再引入一个错配碱基，所设计的ARMS引物序列如下：

ARMS上游引物：GGTGATTTTGGTCTAGCTATAGA(SEQ IDNO：3)

ARMS下游引物：CACAAAATGGATCCAGACAAC(SEQ IDNO：4)

3)探针设计

在ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％-70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：

探针：ATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGT(SEQ ID NO：5)

上述引物和探针均由上海生工合成。

实施例2.V600E点突变的突变富集ARMS荧光定量PCR一步检测方法

本发明的突变富集ARMS一步检测方法整合了酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR技术，即在一个反应体系中分别独立进行酶切、PCR富集和ARMS荧光定量PCR鉴定，具体过程为PCR仪上将25μl包括下表中组分的反应体系(其中样本基因组DNA是从大肠癌组织中提取的基因组DNA)在37℃下温浴30分钟，内切酶TspRI特异性地酶切B-raf野生型等位基因的要检测部分(该部分含有一个TspRI的限制酶切识别位点)，但不能酶切B-raf基因V600E突变型基因的要检测部分(上述位点中的t突变为a，因此不能为TspRI所识别)，从而降低了野生型基因对突变型基因的干扰；然后对包含突变碱基的要检测部分进行富集，在65℃变性温度下，ARMS引物不能进行有效工作，因此只有富集引物进行延伸和扩增；然后运行第二个PCR反应，在60℃延伸30秒，由于所选用的ABI Taq酶(包含在下述Universal Taqman Mix中)每分钟只能延伸约500个碱基，富集引物在30秒内不能进行有效延伸，形成不了循环，因此只进行ARMS引物的荧光PCR反应。

反应条件如下：37℃温浴30分钟；95℃10分钟；95℃20秒，65℃20秒，72℃60sec，共10个循环；95℃5秒，60℃30秒(收集荧光)，共40个循环。所用荧光定量PCR仪为ABI 7300。

实验结果如图1所示，表明突变检测结果为阳性。