一种氧化还原酶或其重组酶的应用及一种重组氧化还原酶

摘要

本发明公开了一种氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的氧化还原酶或其重组酶作为羰基还原酶催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。本发明还公开了由下述方法制得的重组氧化还原酶：培养包含碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的氧化还原酶基因的重组表达转化体，即可。本发明涉及的氧化还原酶制备简便，作为羰基还原酶催化剂可适用的前手性羰基化合物范围广，具有优异的催化活性，可获得高转化率、高光学纯度的光学活性手性醇，并且可实现自身辅酶NADH的再生，无需另外加入其它辅酶再生系统，整个反应过程不需控制pH，反应条件温和，具有很好的工业应用开发前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化还原酶或其重组酶作为羰基还原酶催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用，以及一种重组氧化还原酶。

背景技术

光学活性手性醇是医药和精细化学品合成的重要中间体。目前，光学活性手性醇的制备方法主要包括化学催化的羰基不对称还原法、生物催化的羰基不对称还原法和生物催化的消旋醇手性拆分法。其中，化学催化羰基的不对称还原，通常需要铑、钌等昂贵的金属催化剂。这些催化剂回收困难、污染环境，且反应能耗高。生物催化不对称还原法的优点在于，该方法理论上能将酮100％地转化为单一构型的手性醇，底物利用率高，产物易于分离，缺点是需要添加昂贵的辅酶。生物催化的手性拆分不需添加辅酶，但该方法的缺点在于目标构型的产物最高收率不会超过50％。

前手性羰基化合物的不对称还原是获取光学活性手性醇的有效途径之一。迄今为止，已有许多关于生物催化酮不对称还原制备光学活性醇的报道。例如，Qi Ye等(Construction and co-expression of a polycistronic plasmidencoding carbonyl reductase and glucose dehydrogenase for production of ethyl(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate.Bioresource Technology，2010，101：6761-6767)用来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis)CBS 6054的羰基还原酶PsCR催化4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl 4-chloroacetoacetate，COBE)不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate，(S)-CHBE)。其中(S)-CHBE是用于治疗血胆固醇过多的他汀类药物——羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)抑制剂的重要中间体。该文献采用水/辛酸乙酯两相反应体系和分批加入底物COBE和葡萄糖的策略，有机相中(S)-CHBE的浓度达1.26M，光学纯度高于99％，得率为90％。但该催化方法的缺点在于，需要添加葡萄糖和葡萄糖脱氢酶催化辅酶NADPH的再生，在这种情况下，反应过程中需要精确控制pH值，增加了工艺复杂度。Inoue等(Purification andCharacterization of a Novel Alcohol Dehydrogenase from Leifsonia sp.StrainS749：a Promising Biocatalyst for an Asymmetric Hydrogen TransferBioreduction.Applied and environmental microbiology.2005，75：3633-3641)用来自赖氏细菌(Leifsonia sp.)strain S749的醇脱氢酶LsADH催化2，2，2-三氟苯乙酮生产(S)-2，2，2-三氟苯乙醇(一种潜在的手性液晶材料)，单水相反应体系中可催化的底物浓度达到100g/L，其中醇脱氢酶LsADH具有催化异丙醇氧化，同时使NAD+还原生成NADH的能力，反应过程不需要控制pH值。

然而，目前已用于工业化生产的羰基还原酶类催化剂并不多，其难点在于具有高催化活性和高选择性等优异催化性能的羰基还原酶难以获得，而且催化反应中所涉及的辅酶价格昂贵，无疑增加了工艺生产的成本。因此，针对前手性羰基化合物，亟需筛选高效特异的，尤其是能实现自身辅酶循环的羰基还原酶，以满足工业需要。

Genbank收录了一种氧化还原酶ScCR(Genbank登录号为NP 631416)，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，共包含263个氨基酸，其可来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)NRRL B-16638，其编码基因(Genbank登录号NC 003888.3，REGION：8176680..8177471)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，共包含792bp碱基。至今，尚未见文献报道该氧化还原酶进行任何实际应用的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的高催化活性和高选择性羰基还原酶尚不多见，且大多需要昂贵的辅酶，不能满足工业应用理想需要的缺陷，而提供一种氧化还原酶或其重组酶在羰基化合物不对称还原领域中的新应用，以及一种可高效特异催化羰基化合物，尤其是4-氯乙酰乙酸乙酯的不对称还原，且可实现自身辅酶循环的重组氧化还原酶。

本发明涉及一种氧化还原酶或其重组酶作为羰基还原酶催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用；所述的氧化还原酶或其重组酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本发明中，所述的氧化还原酶的Genbank登录号为NP_631416，下文简称氧化还原酶ScCR，其可来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)NRRL B-16638。

本发明中，所述的重组酶可由下述方法制得：培养包含碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的氧化还原酶基因的重组表达转化体，即可。

其中，所述的培养的步骤的方法和条件没有特殊限制，可以根据宿主类型和所选培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使重组表达转化体能够生长并产生本发明的重组氧化还原酶即可。对于培养基，本发明优选包括下述成分的培养基：酵母膏5～10g/L，蛋白胨10～20g/L和NaCl10g/L。

本发明一较佳实例为：将包含碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的氧化还原酶基因的重组大肠杆菌接种于含卡那霉素的LB培养基(包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L)中培养，之后再接种于LB’培养基(包括酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L和NaCl 10g/L)中培养，当培养液OD₆₀₀达到7.5～8.5(优选8)时，在终浓度为0.1～1mM(优选0.5mM)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组氧化还原酶。其中，所述的培养的温度较佳的为30～37℃，更佳的为37℃。所述的培养较佳的在振荡条件下进行。所述的再接种于LB’培养基的步骤较佳的按体积比5％的接种量接种。所述的诱导的时间较佳的为22～28℃，更佳的为25℃。所述的诱导的时间较佳的为10～15h，更佳的为12h。

按上述方法制得本发明的重组氧化还原酶后，可按本领域常规方法收集待用，一般可为下述方式中任一种：(1)收集培养液中的细胞，洗涤，冷冻干燥，得冻干细胞。具体的操作优选：将培养液离心(转速一般为8000～10000rpm)去除上清液，收集细胞，生理盐水洗涤(优选两次)，冷冻干燥，得冻干细胞。(2)将收集的培养液中的细胞进行细胞破壁处理，离心，取上清液，即得粗酶液。具体的操作优选：将收集的培养液中的细胞重新悬浮于本领域常用的pH6.0～7.0的缓冲液(如磷酸盐缓冲液，优选pH6.5、100mM的磷酸-磷酸钠缓冲液)中，进行细胞破壁。所述的细胞破壁的方式可采用常规方法，如超声处理，优选条件为功率400W，超声4s，间歇6s，重复99轮。细胞破壁后的离心的速度较佳的为8000～10000rpm。(3)按方式(2)制备粗酶液，将粗酶液进一步冷冻干燥得粗酶粉

其中，所述的包含碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的氧化还原酶基因的重组表达转化体可按下述方法制得：将包含碱基序列如序列表中SEQID No.1所示的氧化还原酶基因的重组表达载体转化至宿主微生物中，即可。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的氧化还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)。

所述的包含碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的氧化还原酶基因的重组表达载体可按下述方法制得：将碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的氧化还原酶基因连接于载体上，即可。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET-28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的氧化还原酶基因和质粒pET-28a用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，即可得本发明的重组表达质粒。

所述的碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的氧化还原酶基因可通过引物，以天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)NRRL B-16638的基因组为模板，经聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增制得；所述的引物为：上游引物为GGAGATTCATATGAGCACCACCGGAACCACC，下游引物为GTGAAGCTTTCAGACGGCGGTGTAGGCGC。

本发明的应用较佳的按下述方法进行：在NAD⁺和/或NADH、以及异丙醇的存在下，在所述的氧化还原酶或其重组酶的作用下，将作为底物的前手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。

上述应用中，所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，具体选择以及优选条件如下介绍：

所述的前手性羰基化合物较佳的为芳基酮类化合物或酮酯类化合物，更佳的为R₁COR₂、R₃COCH₂COOCH₂CH₃或R₄COCOOCH₂CH₃；其中，R₁为-C₆H₅或-C₆H₄X，R₂为-CH₃、-CH₂CF₃或-CH₂X，R₃为-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂X或-CF₃，R₄为-CH₃、-C(CH₃)₂、-C₆H₄X或-(CH₂)₂C₆H₅，X为C1或Br，X在苯基上取代的位置可为邻位、间位或对位。所述的前手性羰基化合物的量根据具体底物选择，对于单一水相溶剂体系可为10～200g/L反应溶液，对于有机溶剂相/水相的两相转化体系可为10～600g/L水。

按常规方法，所述的氧化还原酶或其重组酶可采用下述形式加入反应体系：将粗酶液直接加入反应体系，或者将悬浮或溶解有冻干细胞或粗酶粉的pH5～9、优选6～7的缓冲水溶液加入反应体系。所述的缓冲水溶液种类可为本领域常用的各种缓冲液，优选磷酸盐缓冲液。所述的缓冲液的浓度可为50～100mM。本发明最优选pH6.5、100mM的磷酸-磷酸钠缓冲液。所述的氧化还原酶或其重组酶的量为催化有效量以上，一般为80～400U/g底物(酶活单位U的定义见实施例3)，优选200～400U/g底物。

所述的异丙醇的量一般为前手性羰基化合物摩尔量的1～45倍，优选1.6～1.8倍。所述的NAD⁺和/或NADH的量可为0.3～1.0mmol/L。较佳的，在反应体系中还加入MgCl₂，以提高本发明的氧化还原酶或其重组酶的酶活力。所述的MgCl₂的量较佳的为2mmol/L。上述mmol/L在单一水相溶剂体系中为mmol/L反应溶液，在有机溶剂相/水相的两相转化体系中为mmol/L水。

所述的不对称还原反应的温度一般为20～40℃，优选25～30℃。所述的不对称还原反应的时间以反应完全为准，一般为1～36小时。

所述的不对称还原反应的溶剂体系可为通常的缓冲水溶液体系。所述的缓冲水溶液同前述。为了更好地解决底物抑制和产物抑制问题，本发明优选有机溶剂相/水相的两相转化体系。所述的有机溶剂相与水相的体积比可为0.5～1.5∶1，优选1∶1。其中，所述的水相为前述缓冲水溶液。所述的有机溶剂优选邻苯二甲酸二丁酯、异辛烷、正庚烷、辛酸乙酯、正己烷、正辛醇、甲苯或乙酸丁酯，更优选甲苯。

同样为更好地解决底物抑制和产物抑制问题，较佳地采用底物和异丙醇分批加入的操作。具体的，底物和异丙醇分批加入的批次可为3～6次，优选4次。每批次底物的加入量可为底物总量的1/6～1/3，优选1/4。异丙醇首次加入量可为总量的2/5～3/5，优选2/5。剩余批次的异丙醇加入量为总量的1/10～3/10，优选1/5。每批次底物和异丙醇加入的时间为前批次底物反应完全后为宜。

反应结束后，按常规方法提取分离后，即可获得光学活性手性醇。

以底物R₁COR₂为例，反应路线如下所示。

本发明进一步涉及一种重组氧化还原酶，其为由下述方法制得的重组酶：培养包含碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的氧化还原酶基因的重组表达转化体，即可。所述的方法的具体条件同前述。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的氧化还原酶ScCR或其重组酶用于前手性羰基化合物的不对称还原，以制备光学活性手性醇。该氧化还原酶制备简便，作为羰基还原酶催化剂可适用的前手性羰基化合物范围广，具有优异的催化活性，可获得高转化率、高光学纯度的光学活性手性醇，尤其是针对4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)，在底物量达600g/L的条件下，反应转化率可达100％，(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)的得率达96％，对映体过量值大于99％。并且，该酶具有催化羰基还原和醇脱氢两方面的活性，因此反应体系中只需加入少量较NADP⁺便宜的NAD⁺和异丙醇，就能实现还原型辅酶NADH的再生，无需另外加入其它辅酶再生系统。整个反应过程不需控制pH，反应条件温和，可用于制备多种光学活性手性醇，特别是(S)-手性醇，具有很好的工业应用开发前景。

附图说明

图1为实施例1中重组表达质粒pET-28a-ScCR的质粒构建示意图。

图2为实施例1中基因ScCR的PCR扩增产物电泳图。

图3为实施例1中大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-ScCR的PCR扩增电泳图。

图4为实施例2中重组氧化还原酶ScCR的粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下列实施例中的材料来源为：

表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。

Marker II，E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCRMasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

实施例1大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-28a-ScCR的构建

1、ScCR基因的扩增

根据如SEQ ID No.1所示的碱基序列，设计引物序列如下：

上游引物(ScCR-NdeI)：GGAGATTCATATGAGCACCACCGGAACCACC；

下游引物(ScCR-HindIII)：GTGAAGCTTTCAGACGGCGGTGTAGGCGC。

以天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)NRRL B-16638的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得ScCR基因。PCR体系为：2×Taq PCRMasterMix 15μl，上游引物和下游引物各1μl(0.3μmol/L)，DNA模板2μl(0.1μg)和ddH₂O 11μl。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性1min；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸90s；步骤(2)～(4)循环30次；(5)72℃，延伸10min，冷却至4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收700～900bp区间的目标条带，如图2所示。

2、重组表达质粒pET-28a-ScCR的制备

在37℃下，将所得PCR产物用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切12h，同时在同样条件下双酶切pET-28a载体以制备线性pET-28a载体。将双酶切后的基因片段与线性pET-28a载体用T4DNA连接酶4℃连接过夜，得到重组表达质粒pET-28a-ScCR。质粒构建图如图1所示。

3、大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-28a-ScCR的构建

将重组表达质粒pET-28a-ScCR转入大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，即获得重组表达转化体大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-ScCR，菌落PCR验证阳性克隆(图3)。

实施例2重组氧化还原酶ScCR的制备

将实施例1所得的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-ScCR接种于含卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB培养基(包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L)中，37℃振荡培养8h。再按5％(v/v)的接种量将种子液接种到装有3L LB’培养基(包括酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L和NaCl 10g/L)的5L发酵罐中，37℃培养至OD₆₀₀约为8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃诱导12h。

将所得发酵培养液9000rpm离心去上清，收集湿细胞。取部分湿细胞用生理盐水洗涤两次，冷冻干燥，即得冻干细胞，备用。另取部分湿细胞悬浮于pH6.5、100mM的磷酸-磷酸钠缓冲液中(1g湿细胞/10ml缓冲液)得悬浮液，用超声波处理悬浮液(功率为400W，超声4s，间歇6s，重复99轮)，9000rpm离心取上清，即得粗酶液。将粗酶液冷冻干燥，即得粗酶粉，备用。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(图4)，重组蛋白绝大部分以可溶性形式存在。聚丙烯酰胺凝胶电泳图经BandScan软件分析得，表达的目的蛋白重组氧化还原酶ScCR约占粗酶液总蛋白的69％。

实施例3重组氧化还原酶ScCR的活力测定

氧化还原酶ScCR的还原反应活力测定：反应体系为1ml，包含pH 6.5、100mM磷酸钠缓冲液，0.1mM NADH，2mM COBE，在30℃下反应，使用分光光度计测定340nm处吸光值的下降。酶活定义为，每分钟氧化1μmolNADH所需的酶量为一个酶活单位U。蛋白含量采用Brandford法测定。

采用上述方法测定实施例2所得重组氧化还原酶活力，结果为：重组氧化还原酶ScCR的还原反应活力为10.4U/mg。

实施例4～17重组氧化还原酶ScCR催化制备光学活性手性醇

反应体系为1ml：按400U/g底物的比例称取实施例2制得的氧化还原酶ScCR的粗酶粉溶于0.85ml 100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中，分别加入各种底物，1μmol NAD⁺(1mM)，0.15ml的异丙醇，30℃，900rpm振荡反应12h。反应结束后加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥过夜，通过气相色谱(GC/CP-Chirasil-Dex CB)或液相色谱(手性OD-H柱)分析反应转化率以及产品的光学纯度，结果如表1所示。

转化率及产物光学纯度的检测方法如下：

实施例4～14及17使用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-Dex CB)分析转化率及产物光学纯度，载气氮气，进样口温度280℃，检测器FID温度280℃；实施例15～16使用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-Dex CB)分析转化率，载气氮气，进样口温度280℃，检测器FID温度280℃，使用液相色谱(手性OD-H柱)分析产物光学纯度。其他条件如下：

实施例4：柱温120℃。

实施例5和6：柱温150℃。

实施例7：柱温140℃。

实施例8：柱温160℃。

实施例9：柱温160℃。

实施例10：柱温90℃保留2min，以1℃/min升温至120℃，保留5min。

实施例11：柱温120℃。

实施例12：分析转化率时，柱温140℃；分析产物光学纯度时，乙酰化产物，柱温110℃保留2min，以2℃/min升温至126℃，保留2min，以2℃/min升温至160℃，保留2min。乙酰化方法为：取乙酸乙酯萃取液0.2ml，置于5ml具塞试管中，常温挥发干溶剂。然后滴入2滴乙酸酐和2滴吡啶，置于沸水浴中反应1小时，稍冷，加适量乙酸乙酯稀释。然后用用无水硫酸钠干燥过夜，待GC检测(Baker′s yeast：production of D-and L-3-hydroxy esters.Tetrahedron：Asymmetry，1998，9：4395-4417)。

实施例13：柱温130℃。

实施例14：柱温80℃。

实施例15：使用气相色谱分析转化率，柱温120℃；使用液相色谱分析产物光学纯度，流动相：正己烷/异丙醇＝98/2，流速0.5ml/min，检测器波长220nm。

实施例16：使用气相色谱分析转化率，柱温180℃；使用液相色谱分析产物光学纯度，流动相：正己烷/异丙醇＝97/3，流速1ml/min，检测器波长254nm。

实施例17：柱温160℃。

表1重组氧化还原酶ScCR催化制备光学活性手性醇

实施例18重组氧化还原酶ScCR催化COBE的不对称还原

反应体系为1ml：取40U(80U/g底物)的重组氧化还原酶ScCR的粗酶粉(实施例2制备)溶于0.85ml 100mM磷酸-磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，加入200mg底物COBE(200g/L反应溶液)，1μmol NAD⁺(1mM)，0.15ml的异丙醇(与底物的摩尔比值为1.6)，30℃下，900rpm振荡反应4h，转化率为96％，产物的光学纯度ee＞99％。

实施例19重组氧化还原酶ScCR催化COBE不对称还原

反应体系为1ml：取68U(340U/g底物)的ScCR冻干细胞(实施例2制备)悬浮于0.85ml 100mM磷酸-磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，加入200mg底物COBE(200g/L反应溶液)，1μmol NAD⁺(1mM)，0.15ml的异丙醇(与底物的摩尔比值为1.6)，30℃下，900rpm震荡反应4h，转化率为100％，产物的光学纯度ee＞99％。

实施例20重组氧化还原酶ScCR催化COBE不对称还原

反应体系为10ml：取680U(340U/g底物)的ScCR冻干细胞(实施例2制备)悬浮于8.5ml 100mM磷酸-磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，加入2g底物COBE(200g/L反应溶液)，10μmol NAD⁺(1mM)，1.5ml的异丙醇(与底物的摩尔比值为1.6)，25℃下，900rpm震荡反应4h，转化率为98％，产物的光学纯度ee＞99％。

实施例21水-甲苯两相体系中重组氧化还原酶ScCR催化COBE不对称还原

取1360U(227U/g底物)的ScCR冻干细胞(实施例2制备)悬浮于10ml 100mM磷酸-磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，加入6g COBE(600g/L水)，5ml异丙醇(与底物的摩尔比值为1.8)，3μmol NAD⁺(0.3mM)，20μmolMgCl₂(2mmol/L水)，10ml甲苯，30℃，180rpm振荡反应24h，转化率为100％，产物的光学纯度ee＞99％。

实施例22水-甲苯两相体系中重组氧化还原酶ScCR催化COBE不对称还原

取907U(227U/g底物)的ScCR冻干细胞(实施例2制备)悬浮于10ml 100mM磷酸-磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，加入4g COBE(400g/L水)，3.5ml异丙醇(与底物的摩尔比值为1.8)，3μmol NAD⁺(0.3mM)，20μmolMgCl₂(2mmol/L水)，10ml甲苯，30℃，180rpm振荡反应24h，转化率为100％，产物的光学纯度ee＞99％。

实施例23底物分批加入重组氧化还原酶ScCR催化COBE不对称还原

取1360U(227U/g底物)的ScCR冻干细胞(实施例2制备)10ml 100mM磷酸-磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中，加入3μmol NAD⁺(0.3mM)，20μmolMgCl₂(2mmol/L水)，10ml甲苯，加入2g COBE(200g/L水)和3ml的异丙醇，30℃下，180rpm振荡反应，反应至2h和5h时，补加2g COBE(200g/L水)和1ml的异丙醇。反应24h时转化率为100％，产物的光学纯度ee＞99％。

实施例24底物分批加入重组氧化还原酶ScCR催化COBE不对称还原

取1360U(227U/g底物)的ScCR冻干细胞(实施例2制备)10ml 100mM磷酸-磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中，加入3μmol NAD⁺(0.3mM)，20μmolMgCl₂(2mmol/L水)，10ml甲苯，加入1.5g COBE(150g/L水)和2ml的异丙醇，30℃下，180rpm振荡反应，1h，3h和6h时分别加入1.5g COBE(150g/L水)和1ml的异丙醇。反应20h时转化率为100％，产物的光学纯度ee＞99％。产物(S)-CHBE的产量为5.75g，得率达96％。