在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法

摘要

本发明涉及一种在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，在反应器中用含有甘油的培养基培养哺乳动物细胞，每代次生长至24～30h后，将反应器迅速降温，使所述哺乳动物细胞在4℃下进行低温胁迫培养0.5～1h，随后将反应器升温，使低温胁迫培养后的哺乳动物细胞在37℃培养16～18h，获得基本处于细胞周期同步化生长状态的动物细胞。本发明操作简单，安全、方便、规模大，对研究细胞同步化生长、群体代谢、病毒增殖、蛋白表达有着重大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于动物细胞工程领域，具体涉及一种在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法。

背景技术

动物细胞的大规模培养已经广泛应用于生物医药制品的生产。近年来，代谢工程和代谢分析发展迅速，但是代谢分析基本上都基于细胞群体培养所得到的数据，由于细胞生长和代谢的不同步，部分掩盖了细胞的一些代谢行为。如果应用单个细胞进行研究，不仅存在技术上的困难，而且由于数量太少难以进行定量分析，可行的方法就是使得细胞群体同步生长，用同步化生长的群体细胞动力学特性来反映细胞真实的代谢行为。

动物细胞同步化生长的控制方法，主要有化学方法和物理方法。使用化学方法阻断细胞周期，可以获得较高的同步化效率，同时也有多种化学试剂可供选择，但是这类化学试剂价格极为昂贵，不适合于在生物反应器上对规模化培养的动物细胞大量使用，且该类化学试剂均具有一定的毒性，对操作人员健康存在安全隐患。通过物理方法进行细胞周期同步化控制也存在其自身弊端，因为需要使用一些特殊实验设备，如梯度离心设备等，此外物理方法制备同步化细胞耗时长，操作过程容易污染且制备量太小，往往不能满足研究的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，可安全、简单、方便地控制动物细胞的同步化生长，以适应对动物细胞大规模培养的需要。

本发明提供一种在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，包括如下步骤：

(1)在反应器中，用含有甘油的培养基培养哺乳动物细胞，每代次生长至24～30h后，将反应器迅速降温，使所述哺乳动物细胞在4℃下进行低温胁迫培养0.5～1h；

(2)将反应器升温，使低温胁迫培养后的哺乳动物细胞在37℃培养16～18h，获得基本处于细胞周期同步化生长状态的动物细胞。

所述哺乳动物细胞为HEK293细胞或Marc145细胞。

步骤(1)中低温胁迫培养时间为1h。

所述培养基中甘油的浓度为5～10g/L，优选8g/L。

经研究表明，HEK293细胞和Marc145细胞在4℃低温下，细胞代谢几近停止，而细胞膜却未出现损伤，但细胞存活率随着4℃低温时间的延长而明显下降；为能有效减缓甚至停止细胞的正常代谢活动，同时又能维持细胞的基本活力不变，本发明采用4℃下低温胁迫1小时，两种细胞的存活率基本可维持在92％以上。然后将反应器温度直接升到37℃，继续培养细胞，细胞逐步开始恢复生长代谢，但HEK293细胞恢复生长至18小时，细胞逐步出现G2/M期的阻滞，Marc145细胞恢复生长至16小时，细胞逐步出现G2/M期的阻滞。随后细胞即开始同步化生长。

本发明操作简单，安全、方便、规模大，能够应用于生物反应器上大规模悬浮培养的细胞，对研究细胞同步化生长、群体代谢、病毒增殖、蛋白表达有着重大的应用价值。

下面将结合附图和实施例，对本发明作进一步说明。

附图说明

图1(1)表示4℃低温胁迫的不同时间，对HEK293细胞存活率的影响。

图1(2)表示4℃低温胁迫的不同时间，对Marc145细胞存活率的影响。

图2(1)～图2(6)表示4℃低温胁迫1小时后，37℃恢复培养时间的不同，对HEK293细胞的细胞周期分布的影响；其中：

图2(1)表示正常培养细胞对照；

图2(2)～图2(6)表示4℃低温胁迫1小时，37℃恢复培养时间分别为0小时、6小时、12小时、18小时、24小时的HEK293细胞的细胞周期分布。

图3(1)表示HEK293细胞形态，图中箭头表示处于G2/M期的细胞；

图3(2)表示Marc145细胞形态，图中微载体培养的处于G2/M期Marc145细胞呈现出细胞个体增大、从微载体上突起的状态。

图3(1)表示经4℃低温胁迫处理1h后，悬浮培养的HEK293细胞在37℃恢复培养18h后的细胞形态图，观察条件为倒置显微镜下，20倍物镜观察并拍摄；

图3(2)表示经4℃低温胁迫处理1h后，微载体悬浮培养的Marc145细胞在37℃恢复培养16h后的细胞形态图，观察条件为倒置显微镜下，20倍物镜观察并拍摄。

具体实施方式

实施例1.4℃低温胁迫不同时间对HEK293细胞和Marc145细胞存活率的影响

用悬浮培养法培养HEK293细胞，用微载体悬浮培养法培养Marc145细胞，具体方

法如下：

1.悬浮培养HEK293细胞

以3×10⁵个细胞/毫升的初始密度接种于250ml摇瓶中，悬浮培养的培养基成分如下表所示：

培养基使用体积为60ml，摇瓶置于37℃、5％CO₂的培养箱中的摇床上，培养转速为60～100rpm。4天吸取一定量HEK293细胞接种于新摇瓶中进行传代，传代比例为1传3，补足培养液至60ml继续振荡悬浮培养。

2.微载体悬浮培养Marc145细胞

在250ml的摇瓶中，Marc145细胞以2×10⁵个细胞/毫升的初始密度接种于3g/L的cytodex1微载体上，加入250ml DMEM(其中添加了体积浓度为10％的新生牛血清和质量浓度为5～10g/L(优选8g/L)的甘油，于35rpm，37℃、5％CO₂的培养箱中培养。Marc145细胞在cytodex1微载体上贴壁生长，大致3天可基本长满微载体的表面，以加入新鲜微载体直接传代或经胰酶消化后传代均可，补足新鲜培养液继续微载体悬浮培养。

通过上述方法悬浮培养的HEK293细胞和微载体悬浮培养Marc145细胞在每代次生长到24～30h，进行4℃低温胁迫处理。考察低温处理不同时间对细胞存活率的影响。从低温处理0.5小时到8小时分别取样，用台盼蓝染色计数，确定存活率。结果如图1(1)和图1(2)所示。图中可见，随着4℃低温处理时间的延长，细胞存活率明显降低。4℃处理0.5、1小时，对两种细胞基本无影响，细胞存活率均高于92％。

实施例2.4℃低温胁迫1小时对悬浮培养的HEK293细胞的细胞周期分布的影响及诱导同步化生长

悬浮培养的HEK293细胞经4℃低温胁迫处理1小时，然后恢复37℃培养0h、6h、12h、18h及24h，分别按时取样进行细胞周期测定，方法如下：

1)以1000rpm离心10min收集2～4×10⁶个HEK293细胞于1.5ml无菌eppendorf离心管中，加入一定量磷酸缓冲液(PBS缓冲液：8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/LNa₂HPO₄和0.24g/L KH₂PO₄，pH7.2～7.4，121℃灭菌20min后使用)重悬HEK293细胞，轻轻吹打清洗细胞，再以1000rpm离心10min，弃去上清液；

2)在细胞沉淀中加入1ml预冷的70％乙醇于4℃固定过夜，此固定细胞可在4℃中保存一周；

3)以1000rpm离心步骤(2)获得的固定细胞10min，弃去乙醇，并加入一定量PBS重悬HEK293细胞，轻轻吹打清洗细胞，再以1000rpm离心10min，弃去上清，加入1ml碘化丙锭(Propidium Iodide，PI)工作液，室温下避光染色30～40min；

4)染色完毕后用PBS进行稀释，并吹散细胞呈单细胞悬液，进样2×10⁴个细胞于流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)中测定DNA含量，生成的结果由随机软件分别以Number和FL2-Area为纵坐标和横坐标作出细胞周期分布图形。

结果如表1和图2(1)-图2(6)所示。表1可以看出细胞在不同细胞周期内分布的原始数值。图2(1)-图2(6)是根据细胞周期分布的数值所画的细胞周期图，图中纵坐标Number是指细胞数量，横坐标channels(FL2-A)是指流式细胞仪测定中的限定门，该门使用的是近似于二倍体细胞的DNA荧光值的积分面积，用来表示通过检测器的细胞DNA含量。

结果表明，经4℃低温胁迫处理1小时，然后恢复37℃培养18h，可造成52.43％的HEK293细胞处于G2/M期阻滞。随后恢复培养24h，可见有32.88％的细胞处于G0/G1期、56.26％的细胞处于S期，只有10.86％的细胞处于G2/M期，说明大部分细胞(89.14％)均处于有丝分裂的前期，基本处于同步化生长的状态。

表14℃胁迫培养1小时后，37℃恢复培养不同时间，HEK293细胞的细胞周期分布

实施例34℃低温胁迫1小时对悬浮培养的HEK293细胞和微载体悬浮培养的Marc145细胞的细胞周期的影响

分别在7L动物细胞反应器中悬浮培养的HEK293细胞和微载体悬浮培养的Marc145细胞，培养24h后将培养温度设为4℃，此时温度控制单元开始进行降温处理，同时使用冰袋为冷却水单元和罐体进行降温，将培养温度快速降低至4℃，并保持4℃处理1小时。随后培养温度设定为37℃迅速恢复至正常培养温度(37℃)继续培养18h(HEK293细胞)和16h(Marc145细胞)。由此可获得有效的将细胞周期控制在G2/M期阻滞的效果，如图3(1)和图3(2)所示，此时可以观察到大量HEK293细胞处于G2/M期(图中箭头所示)，而Marc145细胞则在微载体上呈现出细胞个体增大、从微载体表面上突起的状态，这是微载体细胞培养过程中细胞处于G2/M期的典型形态。随着在37℃培养时间的进一步延长，细胞逐步统一从G2/M期出发开始新一轮细胞周期，同时进入G1期，达到实现至少一轮细胞周期同步化生长的目的。