咔唑桥基新型荧光菁染料探针及其制备方法

摘要

本发明提供一种咔唑桥基荧光菁染料探针，该菁染料探针结构包括有咔唑桥基分别键合在噻唑橙及噁唑黄的苯并噻(噁)唑和4-甲基喹啉盐之间而形成的菁染料探针；所述咔唑环的3位侧链一端与苯并噻(噁)唑的2位碳相连，咔唑另一端的6位甲酰基与4-乙烯基喹啉盐化合物相连。本发明同时还提供一种咔唑桥基荧光菁染料探针的制备方法。本发明的效果是该荧光染料生物探针制备方法简单，原料易得，使得新合成的荧光染料探针的最大发射波长发生红移，荧光强度增大，Stocks位移增大，荧光量子产率提高，光稳定性增强。本发明保留了噻唑橙和噁唑黄嵌入式荧光染料的优点，有利于进一步提高灵敏度、减少用量、提高稳定性。具有光谱范围广、摩尔消光系数大、两资产率高和灵敏度高等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及从化学领域出发并应用于生物领域的荧光染料技术，特别是咔唑桥基新型荧光菁染料探针及其制备方法。

背景技术

众所周知，癌症已成为威胁人类健康的第一杀手，如何有效地控制其发生和发展已成为当务之急。多数学者认为，在肿瘤的防治中，肿瘤得到二级预防，即早查、早诊、早治将是未来相当长时期实体瘤获得大幅度提高疗效的方向。由于分子生物标记具有价廉、安全、准确等优点，在医学早期诊断方面越来越受到人们的关注。目前该技术已在癌症和艾滋病的识别方面有较好的应用。

生物荧光探针在生物领域的相关检测方法和技术与传统的同位素检测相比具有速度快、重复性好、用量少及无辐射等特点。目前用于细胞标记的生物荧光颜料探针主要有吖啶、菲啶类、荧光素类，二氟烷硼类，二苯乙烯类、萘酰亚胺类、菁染料类等。菁染料作为生物大分子的标记染料，具有快速、灵敏和安全等特点，已经成为新一代的生物分子荧光标记染料。而噻唑橙(TO)和噁唑黄(YO)作为嵌入式荧光染料已成为菁染料的两个重要分支，这种不对称菁染料具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点，并且在游离状态下几乎没有荧光，但与核酸结合后荧光显著增强，从而在荧光检测时没有染料自身的荧光干扰，提高了检测的灵敏度，减少了标记过程中除去游离染料的复杂步骤。但是由于噻唑橙(TO)和噁唑黄(YO)本身的荧光强度较弱，最大荧光发射波长小、Stocks位移小等缺点，制约了这两种荧光染料在生物标记中的应用。

荧光染料探针的荧光特能与探针的共轭体系大小、共轭∏键体系的共平面性和刚性程度等因素有关，咔唑及衍生物是一个富电子体系，由于其具有大的共轭体系、强的分子内电子转移能力、特殊的刚性平面稠环结构、强的荧光及咔唑环易于进行结构修饰引入多种官能团等优点而广泛应用于染料、生物、药物、光电材料等领域。因此将咔唑环这种特殊的刚性环键合在噻唑橙(TO)或噁唑黄(YO)中，增大了原有荧光染料的共轭体系和平面刚性结构，将有利于荧光染料的最大荧光发射波长发生红移，荧光强度增大，Stocks位移增大，提高荧光量子产率。

发明内容

本发明的目的是提供咔唑桥基荧光菁染料探针及其制备方法，以增大原有荧光染料探针的共轭体系和平面刚性结构，将有利于荧光染料的最大荧光发射波长发生红移，荧光强度增大，Stocks位移增大，提高荧光量子产率和光稳定性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是提供一种咔唑桥基荧光菁染料探针，其中：该菁染料探针结构包括有咔唑桥基分别键合在噻唑橙(TO)及噁唑黄(YO)的苯并噻(噁)唑和4-甲基喹啉盐之间而形成的菁染料探针；所述咔唑环的3位侧链一端与苯并噻(噁)唑的2位碳相连，咔唑另一端的6位甲酰基与4-乙烯基喹啉盐化合物相连。

本发明同时还提供一种咔唑桥基荧光菁染料探针的制备方法。

本发明的效果为：

1.本发明荧光染料生物探针制备方法简单，原料易得。

2.咔唑桥基的引入，使得新合成的荧光染料探针的最大发射波长发生红移，荧光强度增大，Stocks位移增大，荧光量子产率提高，光稳定性增强。

3.本发明保留了噻唑橙(TO)和噁唑黄(YO)嵌入式荧光染料的优点，将有利于进一步提高灵敏度、减少用量、提高稳定性。

4.具有光谱范围广、摩尔消光系数大、两资产率高和灵敏度高等特点。

附图说明

图1为本发明的咔唑桥基荧光菁染料探针设计结构路线图；

图2为本发明的咔唑桥基荧光菁染料探针实验路线图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例进一步对本发明的咔唑桥基新型荧光菁染料探针及其制备方法加以说明。

如图1所示，本发明的咔唑桥基新型荧光菁染料探针是基于咔唑及衍生物是一个富电子体系，具有大的共轭体系、强的分子内电子转移能力、特殊的刚性平面稠环结构、强的荧光及易于进行结构修饰引入多种官能团等优点。因此将咔唑环这种特殊的刚性环键合在噻唑橙(TO)或噁唑黄(YO)分子结构中，增大了原有两类荧光染料探针的共轭体系和平面刚性结构，将有利于荧光染料的最大荧光发射波长发生红移，荧光强度增大，Stocks位移增大，提高荧光量子产率和光稳定性。

本发明的咔唑桥基荧光菁染料探针，该菁染料探针结构包括有咔唑桥基分别键合在噻唑橙(TO)及噁唑黄(YO)的苯并噻(噁)唑和4-甲基喹啉盐之间而形成的菁染料探针；所述咔唑环的3位侧链一端与苯并噻(噁)唑的2位碳相连，咔唑另一端的6位甲酰基与4-乙烯基喹啉盐化合物相连。

所述4-甲基喹啉盐是以Br^-为阴离子的4-甲基喹啉盐，在4-甲基喹啉盐的N位上的基团分别为-CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂Br、

所述咔唑桥基荧光菁染料探针的特性：

荧光发射波长：630nm-660nm；

荧光强度：30-55；

斯托克位移(Stocks)：130-151nm；

荧光量子产率：0.02-0.6。

本发明的咔唑桥基荧光菁染料探针的制备方法包括有以下步骤：

1)3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-乙基咔唑、3-苯并噁唑基-6-甲酰基-N-乙基咔唑、3-苯并噁唑基-6-甲酰基-N-苄基咔唑、3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-苄基咔唑的制备

分别向4个100mL圆底烧瓶中加入物质的量比为1∶1的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和三氯氧磷，滴毕，于室温搅拌至反应体系呈微红色后，分别滴加物质的量为DMF的17倍的3-苯并噻唑基-N-乙基咔唑、3-苯并噁唑基-N-乙基咔唑、3-苯并噁唑基-N-苄基咔唑、3-苯并噻唑基-N-苄基咔唑的1，2-二氯乙烷溶液，总体积在40-70mL，在温度为79-85℃时回流搅拌反应6h-12h，冷却至室温后倒入冰水中，用二氯甲烷萃取，柱层析分离提纯，分别得到3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-乙基咔唑、3-苯并噁唑基-6-甲酰基-N-乙基咔唑、3-苯并噁唑基-6-甲酰基-N-苄基咔唑、3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-苄基咔唑；

2)咔唑桥基荧光菁染料探针的制备

分别将经步骤1得出的1摩尔的3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-乙基咔唑、3-苯并噁唑基-6-甲酰基-N-乙基咔唑、3-苯并噁唑基-6-甲酰基-N-苄基咔唑、3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-苄基咔唑和四份1.5摩尔的N位上带有不同取代基的4-甲基喹啉盐溶于乙醇中，滴加与4-甲基喹啉盐等当量的哌啶，在温度为75-80℃时回流搅拌反应时间8-16h，冷却至室温，再加入乙醚析出红色固体，抽滤，得滤饼经柱层析分离，得到所述的咔唑桥基荧光菁染料探针。

本发明的咔唑桥基荧光菁染料探针结构中的喹啉盐为以Br^-为阴离子的4-甲基喹啉盐，在N位上的基团分别为-CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂Br、

本发明的咔唑桥基荧光菁染料探针的制备方法通过以下实施例进一步说明，如图2所示，但不局限于此。

目标化合物a-e代表R₁是乙基，X为S，R₂分别为-CH₂CH₂COOH，-CH2CH₂CH₂Br，-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH等不同取代基团的N-乙基咔唑桥基噻唑橙菁染料探针；f-j代表R₁是乙基，X为O，R₂分别为-CH₂CH₂COOH，-CH2CH₂CH₂Br，-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH等不同取代基团的的N-乙基咔唑桥基噁唑黄菁染料探针；k-o代表R₁是苄基，X为S，R₂分别为-CH₂CH₂COOH，-CH2CH₂CH₂Br，-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH等不同取代基团的N-苄基咔唑桥基噻唑橙菁染料探针；p-t代表R₁是苄基，X为O，R₂分别为-CH₂CH₂COOH，-CH2CH₂CH₂Br，-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH等不同取代基团的的N-苄基咔唑桥基噁唑黄菁染料探针，实验路线及目标化合物见表1：

表1目标化合物a～t

实施例1N-乙基咔唑桥基噻唑橙菁染料探针的制备包括以下步骤：

1.3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-乙基咔唑

在100mL圆底烧瓶中加入DMF 7.7mL(100mmol)，冰水浴下滴加三氯氧磷9.5mL(15.2g，100mmol)，滴毕，于室温搅拌至反应体系呈微红色，缓慢滴加3-苯并噻唑基-N-乙基咔唑2g(6mmol)的1，2-二氯乙烷30mL的溶液，滴毕，83℃回流反应6h。冷却至室温后倒入冰水中，用二氯甲烷萃取，柱层析分离，得3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-乙基咔唑。

2.N-乙基咔唑桥基噻唑橙菁染料探针a的制备

将0.1g(0.28mmol)3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-乙基咔唑溶于30mL乙醇中，再将0.13g(0.42mmol)羧基喹啉盐溶于20mL乙醇中，将二者混合置于烧瓶中，滴加0.04mL(0.42mmol)哌啶，78℃回流反应12h，冷却至室温，加入乙醚析出红色固体，抽滤，滤饼柱层析分离，即得红色目标产物a。

分别取0.42mmol的N位上带有-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂Br、取代基的喹啉盐代替上述0.13g(0.42mmol)羧基喹啉盐，重复上述步骤2的化学反应，得本发明中的目标产物b～e。

实施例2N-苄基咔唑桥噻唑橙菁染料探针的制备包括以下步骤：

1.3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-苄基咔唑的制备

在烧瓶中加入DMF 7.7mL(100mmol)，冰水浴下滴加三氯氧磷9.5mL(15.2g，100mmol)，滴毕，于室温搅拌至溶液呈微红色，缓慢滴加3-苯并噻唑基-N-苄基咔唑2.34g(6mmol)的1，2-二氯乙烷30mL的溶液，滴毕，83℃回流反应16h。冷却至室温后倒入冰水中，用二氯甲烷萃取，柱层析分离，得3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-苄基咔唑。

2.N-苄基咔唑桥基噻唑橙菁染料探针k的制备

将0.1g(0.28mmol)3-苯并噻唑基-6-甲酰基-N-苄基咔唑溶于30mL乙醇中，再将0.13g(0.42mmol)羧基喹啉盐溶于20mL乙醇中，将二者混合置于烧瓶中，滴加0.04mL(0.42mmol)哌啶，78℃回流反应12h，冷却至室温，加入乙醚析出红色固体，抽滤，滤饼柱层析即得红色目标产物k。

分别取0.42mmol的N位上带有-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂Br、取代基的喹啉盐代替上述0.13g(0.42mmol)羧基喹啉盐，重复上述步骤2的化学反应，得本发明中的目标产物l～o。

实施例3N-乙基咔唑噁唑黄菁染料探针的制备包括以下步骤：

1.3-苯并噁唑基-6甲酰基-N-乙基咔唑的制备

在烧瓶中加入DMF 7.7mL(100mmol)，冰水浴下滴加三氯氧磷9.5mL(15.2g，100mmol)，滴毕，于室温搅拌至溶液呈微红色，缓慢滴加3-苯并噁唑基-N-乙基咔唑2.25g(6mmol)的1，2-二氯乙烷30mL的溶液，滴毕，83℃回流反应16h。冷却至室温后倒入冰水中，用二氯甲烷萃取，柱层析分离，得3-苯并噁唑基-6-甲酰基-N-乙基咔唑。

2.N-乙基咔唑噁唑黄菁染料探针f的制备

将0.11g(0.28mmol)3-苯并噁唑基-6-甲酰基-N-乙基咔唑溶于30mL乙醇中，再将0.13g(0.42mmol)羧基喹啉盐溶于20mL乙醇中，将二者混合置于烧瓶中，滴加0.04mL(0.42mmol)哌啶，78℃回流反应12h，冷却至室温，加入乙醚析出红色固体，抽滤，滤饼柱层析即得红色目标产物f。

分别取0.42mmol的N位上带有-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂Br、取代基的喹啉盐代替上述0.13g(0.42mmol)羧基喹啉盐，重复上述步骤2的化学反应，得本发明中的目标产物g～j。

实施例4N-苄基咔唑桥基噁唑黄菁染料探针包括以下步骤：

1.3-苯并噁唑基-6甲酰基-N-苄基咔唑的制备

在烧瓶中加入DMF 7.7mL(100mmol)，冰水浴下滴加三氯氧磷9.5mL(15.2g，100mmol)，滴毕，于室温搅拌至溶液呈微红色，缓慢滴加3-苯并噁唑基-N-苄基咔唑1.71g(6mmol)的1，2-二氯乙烷30mL的溶液，滴毕，83℃回流反应16h。冷却至室温后倒入冰水中，用二氯甲烷萃取，柱层析分离，得3-苯并噁唑基-6-甲酰基-N-苄基咔唑。

2.N-苄基咔唑桥基噁唑黄菁染料探针p的制备

将0.11g(0.28mmol)3-苯并噁唑基-6-甲酰基-N-苄基咔唑溶于30mL乙醇中，再将0.13g(0.42mmol)羧基喹啉盐溶于20mL乙醇中，将二者混合置于烧瓶中，滴加0.04mL(0.42mmol)哌啶，78℃回流反应12h，冷却至室温，加入乙醚析出红色固体，抽滤，滤饼柱层析即得红色目标产物p。

分别取0.42mmol的N位上带有-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂COOH、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂Br、取代基的喹啉盐代替上述0.13g(0.42mmol)羧基喹啉盐，重复上述步骤2的化学反应，得本发明中的目标产物q～t。

本发明的咔唑桥基荧光菁染料探针所表现出的性能是荧光发射波长：630nm-660nm；与TO发射波长547nm相比，红移80nm-110nm；荧光强度：30-55；与TO的0.77相比增大了39-71倍，因此荧光强度显著增强；斯托克位移(Stocks)：130-151mm，TO为67，位移增大2-3，荧光量子产率：0.02-0.6，与TO相比增大2-5倍，光稳定性增大1-6倍，同时保留了共轭体系的大平面分子结构，保留了噻唑橙(TO)和噁唑黄(YO)嵌入式荧光染料的结构特征，特别是能够嵌入NDA或RNA的亚甲基喹啉结构，因此具有嵌入式菁染料的优点，如本身荧光背景弱，与DNA或RNA结合后荧光大大增强，无毒，灵敏度高等优点。