用于在表达HBx的哺乳动物细胞中生产重组蛋白的方法和组合物

摘要

本发明的方法提供了在具有编码乙肝X蛋白和异源蛋白质的核酸的哺乳动物宿主细胞中生产异源蛋白质，其通过培养选自下组的哺乳动物宿主细胞：HKB11、CHO、BHK21、C2C12、和HEK293细胞，通过以非粘附悬浮培养方式培养哺乳动物宿主细胞，或者通过培养含有提供外源X框结合蛋白，即XBP1s的核酸的哺乳动物宿主细胞来进行。条件应当使得哺乳动物细胞表达HBx、内源XBP1s(若存在的话)、和异源蛋白质。本发明包括用于实施该方法的组合物。

说明书

提及相关申请

本申请要求2008年5月28日提交的美国临时申请号61/056,634的优先权。

序列表

本申请包括纸印本和电子本的序列表两者。申请人保证电子本的序列表中含有的主题与纸印本中呈现的相同。

发明领域

一般而言，本发明涉及通过表达乙肝病毒X蛋白(HBx)的重组哺乳动物宿主细胞来生产异源蛋白质的组合物和方法。

发明背景

对重组蛋白(包括治疗性蛋白质)的需要是迫切的(acute)，而且持续需要改善重组蛋白的生产效率。在商业生产过程中提高蛋白质产量仍是一项有意义的挑战。

已经报告了用HBx质粒的瞬时转染可以导致上调Huh7和Chang肝癌细胞表达异源淋巴毒素alpha。Lee等，Biochim Biophys Acta 1741，75-84(2005)。另外，用HBx稳定转染的Chang肝癌细胞可以具有淋巴毒素alpha的上调表达。

还已经报告了在哺乳动物肝癌悬浮细胞中，用HBx的转染可以以剂量依赖性方式降低E-钙粘着蛋白表达水平。Lee等，Oncogene 24，6617-6625(2005)。

分泌型和膜蛋白质通常在宿主细胞的内质网(ER)-高尔基系统中经历折叠和其它翻译后修饰。未折叠蛋白质响应(UPR)信号传导途径的功能是感测未折叠蛋白质水平，并随环境变化诸如ER应激调节细胞的蛋白质折叠和分泌能力。Bernales等，Annu.Rev.Cell Develop.Biology 22，487-506(2006)。ER应激是ER折叠蛋白质的能力变为饱和的条件。IRE1(肌醇需要酶1(inositol-requiring enzyme 1))和ATF6(转录激活因子6)是细胞内部的未折叠蛋白质的两种主要的感应物，并且目前了解为是UPR的关键转导物。Credle等，Proc Natl Acad Sci USA 102，18773-18748(2005)；Nadanaka等，Mol.Cell.Biology 27，1027-1043(2007)。

这些代谢途径是由许多病毒基因激活的，所述病毒基因包括：a)人巨细胞病毒27kDa ER驻留的I型膜糖蛋白(在短的独特区11(US11)内)，其靶向主要组织相容性复合体(MHC)I类分子以自ER变位至胞质溶胶；b)由丙肝病毒(HCV)编码的非结构蛋白NS4B，其在物理上与CREB-RP/ATF6β相互作用，而且通过诱导XBP1剪接来激活ATF6和IRE1途径。Zheng等，J.Microbiology43，529-536(2005)；和c)小的可读框X基因内的乙肝病毒17kDa蛋白(HBx)，其是调节多种细胞事件诸如细胞周期、存活、和凋亡的多功能转录激活物。

IRE1(即一种内源外切核酸酶)可以修饰X框结合蛋白mRNA(XBP1)以形成剪接的XBP1mRNA(XBP1s)，这导致翻译移码，其产物激活经由UPR途径的蛋白质分泌升高。Tigges等，Metab.Eng.8，264(2006)。Tigges等进一步披露了用XBP1和XBP1s转染细胞以提高分泌能力，用于分泌性蛋白质治疗剂的生物药物制备。Tigges等还教导了用XBP1s质粒和编码分泌性胚胎碱性磷酸酶(hSEAP)、分泌性激素VEGF、或分泌性α-淀粉酶的基因瞬时转染可以分别导致hSEAP、VEGF、和α-淀粉酶的蛋白质生成。

通过多种技术来生产重组蛋白，包括在固体基质上、在悬浮的微载体上、和对于不依赖贴壁细胞以非粘附悬浮培养方式培养宿主细胞。粘附培养包括在可以在悬浮液中维持的微载体上培养。在不依赖贴壁细胞的悬浮培养中，不将细胞附着至基质，而是以悬浮方式在合适的反应容器内在含有营养物的培养基中维持。

利用各种悬浮方法来生产并维持特定的宿主细胞。对于微载体和不依赖贴壁细胞的典型悬浮细胞培养方法使用摇动器、滚筒、搅拌器、或气升系统，它们搅动培养中或生物反应器中的细胞培养基和细胞。可以控制并调节通风、温度、搅动率等条件以提供对培养物生长和重组蛋白的高生产有利的条件。

发明概述

本发明利用关于使用HBx来提高由哺乳动物细胞的细胞培养物进行的异源(重组)蛋白质生产的某些意想不到的发现。在其各个实施方案中，本发明提供了用于生产重组蛋白的方法和组合物，其通过在也表达重组蛋白的哺乳动物宿主细胞中表达HBx来进行，由此与不表达HBx的相当的重组细胞相比在此类细胞中提高重组蛋白的生成。

在第一个实施方案中，本发明包括一种在哺乳动物宿主细胞中生产异源蛋白质的方法，包括在使得所述哺乳动物宿主细胞表达HBx和所述异源蛋白质的条件下培养选自下组的哺乳动物宿主细胞：HKB11细胞、CHO-S细胞、BHK21细胞、C2C12细胞、和HEK293细胞，其中所述哺乳动物宿主细胞含有编码HBx的核酸和编码所述异源蛋白质的核酸。

在另一实施方案中，本发明包括一种在哺乳动物宿主细胞中生产异源蛋白质的方法，包括在使得所述哺乳动物宿主细胞表达HBx和所述异源蛋白质的条件下以非粘附悬浮培养方式培养哺乳动物宿主细胞，其中所述哺乳动物宿主细胞含有编码HBx的核酸和编码所述异源蛋白质的核酸。

在另一实施方案中，本发明包括一种在哺乳动物宿主细胞中生产异源蛋白质的方法，包括：a)提供含有编码HBx的核酸并含有提供外源XBP1s的核酸的哺乳动物宿主细胞；并b)在使得所述哺乳动物细胞表达HBx、外源XBP1s、和所述异源蛋白质的条件下培养所述哺乳动物细胞。编码HBx和异源XBP1s的核酸的共表达的效果可以是协同的。

在另一个实施方案中，本发明是组合物，其包含含有编码异源蛋白质的核酸和编码HBx的核酸的哺乳动物宿主细胞，其中所述哺乳动物宿主细胞衍生自选自下组的细胞系：HKB11细胞、CHO-S细胞、BHK21细胞、和HEK293细胞，且其中所述细胞表达或能诱导表达HBx和所述异源蛋白质。在另一个实施方案中，发明是一种组合物，其包含不依赖贴壁哺乳动物宿主细胞的悬浮培养物，所述哺乳动物宿主细胞含有编码HBx的核酸和编码异源蛋白质的核酸，且所述哺乳动物宿主细胞表达或能诱导表达HBx和所述异源蛋白质。

在另一个实施方案中，本发明是一种包含哺乳动物宿主细胞的组合物，所述哺乳动物宿主细胞含有编码HBx的核酸、提供外源XBP1s的核酸、和编码异源蛋白质的核酸，其中所述哺乳动物宿主细胞表达或能诱导表达HBx、外源XBP1s和所述异源蛋白质。

在别的实施方案中，本发明是自上述组合物之一获得的稳定转染的细胞系，例如如下的克隆，其自哺乳动物细胞的组合物分离(例如高生产克隆)，并用于基于所述克隆寻找哺乳动物细胞的新的培养物或其它群体。

附图简述

图1显示了由渐变量的三种病毒基因(如显示的)进行的瞬时转染对C2C12和BHK21宿主细胞系中的分泌性MF-J抗体生成的影响。

图2显示了用渐变量的编码HBx的核酸瞬时转染重组BHK21和HBK11细胞后获得的分泌性MF-J抗体或萤光素酶(Gluc)生成的升高。

图3显示了从用渐变量的编码HBx的核酸瞬时转染的重组C2C12骨骼肌细胞生成分泌性胚胎碱性磷酸酶、分泌性抗体、或萤光素酶。

图4显示了用HBx稳定转染的BHK21细胞集合(小图A)和HKB11细胞集合(小图B)中的分泌性抗体或萤光素酶生成。

图5显示了用HBx稳定转染的5个BHK21克隆：克隆21、22、18、13、和42中的HBx表达(小图A)和分泌性抗体或萤光素酶生成(小图B)。

图6显示了与非转染的细胞相比经瞬时转染的依赖贴壁卵巢(DG44)细胞和经瞬时转染的不依赖贴壁悬浮培养适应性卵巢(DG44sus)细胞中的萤光素酶生成。

图7显示了BHK21亲本(BHK21p)、HBx10集合、和用HBx稳定转染的5个克隆：13、18、22、31、和42中的内源XBP1s和Erdj4 mRNA水平的表达。

图8显示了由各用每孔0、0.1μg、0.2μg、0.4μg、或0.6μg pCMV-XBP1s转染的BHK21p、HBx10集合细胞、和BHK21/HBx细胞的克隆42或克隆22生成两种分泌性产物蛋白质。小图A描绘了MF-J抗体水平(ng/ml)。小图B以相对光单位(RLU)描绘了Gluc活性。

图9显示了XBP1s、HBx单独表达或XBP1s和HBx共表达后相对于BHK21p细胞的MF-J或Gluc生成的倍数变化。

图10显示了与未转染的细胞相比经瞬时转染的HEK293细胞系和经瞬时转染的不依赖贴壁悬浮培养适应性293F细胞系中的萤光素酶生成。

发明详述

术语“包含”和“具有”以开放的且包括的方式使用。

可用于商业规模生产蛋白质诸如治疗性蛋白质的培养细胞一般具有包括稳定的表型、定义明确的营养物需要、适当地使蛋白质糖基化的能力、和缺乏感染性病毒的特性。数种哺乳动物宿主细胞和品系已经以此方式表征，而且可用于本发明的背景。

宿主细胞类型包括HKB11细胞(人肾和人B细胞之间的体细胞融合物)、CHO-S细胞(中国仓鼠卵巢细胞系)、BHK21(幼仓鼠肾细胞系)、和HEK293细胞(人胚肾细胞系)。适合于依赖贴壁生长(即表面粘附)的细胞和那些适合于在悬浮液中生长的细胞可用于各个实施方案。在一些实施方案中，利用不依赖贴壁悬浮培养适应性细胞。在其它实施方案中，包括仅某些哺乳动物宿主细胞，即HKB11、CHO-S、BHK21、和HEK293细胞、和其重组形式。结合不同实施方案，也可以使用其它生产细胞，包括CHO细胞、FRhL-2、MRC-5二倍体成纤维细胞、SP2/0(鼠骨髓瘤)、和NS0(也是鼠骨髓瘤)。

一般而言，重组哺乳动物宿主细胞的细胞培养是重组蛋白生产领域中的技术人员已知的，而且除非结合本发明的具体实施方案另有规定，本发明涵盖任何形式的细胞培养。

在一个具体的实施方案中，本发明在其范围内包括使用依赖贴壁培养物中的宿主细胞，所述培养的细胞通过将核酸导入宿主细胞中的任何方法来制备，由此表达所述核酸以在所述依赖贴壁细胞培养物内生成重组蛋白。

重组宿主细胞的悬浮细胞培养也是重组蛋白生产领域中的技术人员已知的，并且在一个实施方案中，本发明涵盖任何形式的不依赖贴壁细胞的悬浮培养。在此具体的实施方案中，本发明在其范围内包括使用不依赖贴壁悬浮培养物中的宿主细胞，其通过将核酸导入宿主细胞中的任何方法来制备，由此表达所述核酸以在所述不依赖贴壁悬浮培养物内生成重组蛋白。

将核酸导入细胞中的方法包括但不限于用病毒或不完全病毒的转染、质粒的掺入、和基因枪。

“异源蛋白质”一般指与XBP1或XBP1s产物不同的蛋白质，除非本文中另有指明。异源蛋白质是通常与宿主细胞无关的或者不由宿主细胞天然表达的蛋白质，包括通过将外源核酸转移入细胞中来引入的蛋白质。

符号XBP1/XBP1s表示XBP1、XBP1s、或XBP1和XBP1s两者。虽然本发明不应受限于推定的作用机制，但是目前理解的是，表达XBP1以形成mRNA，该mRNA由宿主细胞剪接以形成XBP1s(即剪接的XBP1)mRNA，其被翻译成调节细胞功能的蛋白质。一些作者将未剪接的XBP1称为XBP1u。术语“提供XBP1s的核酸”明确包括在转染入宿主细胞中并表达时提高XBP1s水平的任何核酸。此类核酸本质上是外源的。在一个实施方案中，编码XBP1s的核酸是优选的。在其它实施方案中，包括编码XBP1(未剪接的)的核酸，条件为IRE1在细胞中不是限速的。此外，涵盖编码XBP1和IRE1的核酸组合。还包括具有增强XBP1s表达的调节元件的核酸。在牵涉在宿主细胞中提供XBP1s的本发明实施方案中，因此，可以以如下形式提供XBP1s，所述形式表达原位剪接的前体转录物或者表达不要求剪接的XBP1s转录物。

可以瞬时地或稳定地表达转染入宿主细胞中的核酸。在一个实施方案中，发生宿主细胞稳定表达异源XBP1s。在另一个实施方案中，发生宿主细胞稳定表达HBx。在又一个实施方案中，发生宿主细胞稳定表达异源蛋白质，所述宿主细胞还稳定表达HBx和/或XBP1s。

或者，宿主细胞可以瞬时表达HBx和/或XBP1s、和/或异源蛋白质。

可以使用本领域技术人员熟悉的方法来将编码HBx和异源产物蛋白质的核酸在不同载体上或作为同一载体上的不同盒导入宿主细胞中，并可以使用合适的选择来鉴定经转染的细胞。

可以在相同的时间、在基本上相同的时间或任选地在不同的时间，且以任意次序将编码HBx的核酸和编码异源产物蛋白质的核酸导入宿主细胞中。

可以使用本领域技术人员熟悉的方法来将编码HBx、XBP1或XBP1s、和异源产物蛋白质的核酸在不同载体上或作为同一载体上的不同盒导入宿主细胞中。

可以在基本上相同的时间或任选地在基本上不同的时间，且以任何次序将编码HBx、XBP1/XBP1、和异源产物蛋白质的核酸导入宿主细胞中。在一个实施方案中，用编码XBP1s的核酸转染宿主细胞。可以对调节元件进行调节以针对工业规模生产优化条件。可以组合性地或在可诱导条件下发生HBx、XBP1s、和异源蛋白质的表达。在可诱导条件下，可以响应外源剂来诱导基因表达。此类药剂可以包括但不限于四环素(Baron等，MethodsEnzymol.327：401(2000))、蜕皮激素(Pollock等，Curr Opin Biotechnol.13：459(2002))、雷怕霉素(No等，Proc Natl Acad Sci USA 93：3346(1996))、和米非司酮(Nordstrom，Curr Opin Biotechnol.13：453(2002))。

在一些实施方案中，将编码HBx的核酸和/或编码XBP1或XBP1s的核酸导入表达产物蛋白质的前体细胞中。在其它实施方案中，将编码异源产物蛋白质的核酸导入表达HBx和/或XBP1/XBP1s的前体细胞中。

此外，可以将编码HBx的核酸和编码XBP1或XBP1s的核酸导入前体细胞中，所述前体细胞是表达所述异源蛋白质的转基因哺乳动物细胞。

HBx基因序列可以获自Genebank，例如AM282986。或者，HBx基因可以获自乙肝病毒的任何毒株、基因型或亚基因型，只要其HBx基因编码功能性X蛋白，而且具有或者可以修饰为含有可对于操作入如本文中所涵盖的表达载体中所必需的任何限制酶位点。乙肝病毒的毒株、基因型和亚基因型记载于例如Hayashi等，J.Med.Virology 79：366-373(2007)。

XBP1核酸和XBP1s核酸是本领域工作人员可获得的，而且在下列登录号下鉴定例子：

XBP1核酸可以是任何起源的，但是在一些实施方案中是人或鼠起源的。在一个的实施方案中，编码XBP1s的核酸可以编码前体(XBP1，含有内含子)，其容易被宿主细胞原位加工以产生剪接形式(XBP1s)。宿主细胞中存在的外切核酸酶IRE1自XBP1转录物除去26bp内含子，导致赋予XBP1s蛋白转录活性的翻译移码。因此，可以通过用编码前体的核酸转染宿主细胞来生成重组XBP1s。或者，核酸可以编码缺乏内含子的转录物，并直接编码剪接形式。

在一些实施方案中，本发明的方法牵涉悬浮培养宿主细胞，并且在一些实施方案中悬浮培养不依赖贴壁细胞。“不依赖贴壁细胞的悬浮培养”或“非粘附悬浮培养”指培养重组细胞培养物，其中细胞对培养物内的任何基质是基本上非粘附的。“基本上非粘附的”指小于10％，和在一些实施方案中为小于5％的细胞在培养1小时、2小时或更长后粘着到培养容器的表面(例如壁)。可以例如通过在温和旋涡后在没有胰蛋白酶、没有钙和没有镁的培养基中或者在另一个实施方案中在含有胰蛋白酶的培养基中比较非粘附细胞与总细胞产量来测量粘附。在一方面，宿主细胞的悬浮培养发生在生物反应器系统中，其中可以在生产重组蛋白过程中将细胞维持为基本上非粘附细胞。可以通过本领域中已知的方法(包括气升和搅拌)或者通过旋转或涡旋生物反应器容器来搅动悬浮的细胞。

用于实施不依赖贴壁悬浮细胞培养的设备和方法是熟练技术人员熟悉的，并且披露于例如美国专利号7,294,484；7,157,276；6,660,501；和6,627,426，通过提及而收录每篇的公开内容。一般而言，用于不依赖贴壁悬浮细胞培养的原则、方案、设备、和实践技术可参见Chu等，Industrial choices for proteinproduction by large-scale cell culture，2001，Curr Opin Biotechnol.12，180-7；Warnock等，Bioreactor systems for the production of biopharmaceuticals fromanimal cells，2006，Biotechnol Appl Biochem.45，1-12，通过提及而将它们收入本文。

涵盖的是，可以依照本发明的方法使用任何如下的哺乳动物宿主细胞，其可以适应于不依赖贴壁悬浮细胞培养并以不依赖贴壁悬浮细胞培养方式维持，并用HBx转染以提高蛋白质生成。宿主细胞的具体例子是DG44、中国仓鼠卵巢(CHO细胞)细胞、通过复制起点区缺陷的SV40转化的猿成纤维细胞CV-1细胞(COS细胞)、和人细胞系(HEK293，CEM)。也涵盖小鼠、犬、和干细胞系。目前，在一些实施方案中，细胞系包括悬浮适应型式的DG44、CHO、CV-1、COS、和HEK 293细胞。特定类型的DG44细胞可以是DG44sus细胞。用于使粘附细胞适应于以非粘附悬浮培养方式生长的手段是熟练技术人员熟悉的。

在本发明的一些方面，宿主细胞具有非肝细胞起源。例如，优选地，细胞可以是肾细胞、卵巢细胞、淋巴细胞、肝巨噬细胞(Kupffer cell)、体细胞融合细胞、干细胞、或任何其它非肝细胞起源细胞。

任何与哺乳动物宿主细胞相容且能够维持哺乳动物宿主细胞的细胞培养基是合适的。细胞培养基的选择取决于特定的重组系统，并且确定合适的培养基不是至关重要的，而且技术人员可以容易地进行。合适的培养基包括MEM、DME-高葡萄糖、DME-低葡萄糖、Iscove氏MDME、培养基199、McCoy氏、Ham氏F10、Ham氏F12、RPMI 1640、NCTC-109、和L-15(Leibovitz)。此外，可以使用培养基的混合物，例如DME/F12或DME/M199。也可以使用专门的培养基，其不限于AthenaES^TM细胞培养基BRFF-BMZERO^TM、BRFF-EPM2^TM、BRFF-HPC1^TM、和BRFF-P4-8F^TM。可以在没有血清的情况中实现细胞生长。也可以在没有动物产物的情况中实现细胞生长。在预期供人施用的重组治疗性蛋白质的情况中，在培养基制备和使用的任何阶段不使用动物产物。对于生产治疗性蛋白质，培养基可以没有血清和/或动物衍生的蛋白质，所述培养基的例子披露于例如美国专利号5,804,420和7,094,574；WO 97/05240；和EP 0 872 487。

FreeStyle^TM(Invitrogen，Carlsbad，CA)是一种有用的细胞培养基，其不含动物起源成分，因此其期望结合表达预期作为人治疗剂使用的蛋白质使用。

在一些方面，细胞培养基可具有有效浓度降低的钙。即，游离钙浓度可以比相应的标准培养基的游离钙浓度小约50％、60％、70％、80％或至少90％。在一个实施方案中，钙降低的培养基与不依赖贴壁悬浮培养物一起使用。

在其它方面，细胞培养的培养基可以与大气空气或优选地含有CO₂(例如空气中5-10％(vol/vol)的空气一起使用。

悬浮液中不依赖贴壁细胞的培养降低生成生物学蛋白质产物所要求的物理空间。不依赖贴壁粘附悬浮培养在生物生产中也具有优点。可以调节不依赖贴壁悬浮培养的条件以优化重组蛋白生产，这基于特定类型的宿主细胞和所生成的重组蛋白进行。

哺乳动物细胞培养可用于表达供研究用和供临床使用的人生物学蛋白质。在一些实施方案中，表达HBx的BHK21或HKB11细胞具有增强表达的异源产物蛋白质。DG44sus宿主细胞结合本发明的悬浮培养实施方案可用作宿主细胞，其中经HBx转染的细胞表明异源产物蛋白质在重组哺乳动物细胞的不依赖贴壁悬浮培养中生成升高。在又一个实施方案中，表达HBx和异源XBP1s的人HKB11细胞容许异源产物蛋白质生成升高，并且在一些实施方案中为协同升高。

一般地，适合于将异源基因导入哺乳动物宿主细胞中的表达载体是提供与编码异源基因的核酸序列可操作连接的控制或调节序列的载体。调节序列能够组成性地或可诱导地指导异源基因在宿主细胞中的表达。合适的载体和调节序列是本领域技术人员公知的。

例如，合适的载体可以是选自下组的病毒载体，或者含有来自选自下组病毒载体的构件：猿病毒SV40、逆转录病毒、牛乳头状瘤病毒、牛痘病毒、和腺病毒、或常用的细菌病毒或常用的昆虫和/或哺乳动物表达载体、或整合型载体，其导致表达重组蛋白产物的稳定细胞系。

用于将载体诸如质粒导入哺乳动物细胞中的方法是公知的。合适方法的例子包括但不限于右旋糖苷介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中的多核苷酸包囊、病毒转导和将DNA直接微注射入细胞核中。此外，提供转染方法详情的参考文献包括：Wigler等，Cell14：725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52：456，1973；Neumann等，EMBO J.1：841-5，1982；Hawley-Nelson等，Focus 15：73，1993；Ciccarone等，Focus 15：80，1993；Miller和Rosman，BioTechniques 7：980-90，1989；及Wang和Finer，Nature Med.2：714-6，1996，通过提及而将每篇的公开内容收入本文。在培养的哺乳动物细胞中生产重组多肽披露于美国专利号4,713,339；4,784,950；4,579,821；和4,656,134等，通过提及而将其公开内容收入本文。

在一些实施方案中，本发明的方法涵盖使用包含一种或多种启动子序列的载体中编码产物蛋白质的核酸表达构建体。实际上，启动子可以与或不与特定的编码序列结合。在一些实施方案中，将编码HBx的核酸和编码异源产物蛋白质的核酸可操作连接至启动子，从而引起宿主细胞表达异源蛋白质产物，而且在一些实施方案中，将蛋白质产物分泌入培养基中。合适的启动子是熟练技术人员已知的，包括强的组成性启动子诸如CMV启动子。还涵盖使用本领域中已知的诱导型启动子。

还可以将含有选择标志的序列转染入细胞系中。这些标志物可以包含在含有异源蛋白质的载体上，或者可以使用常规技术诸如那些本文中所描述的技术来分开转染。供哺乳动物细胞用的选择标志是本领域中已知的，包括例如，胸苷激酶、氨基糖苷磷酸转移酶、潮霉素B磷酸转移酶、天冬酰胺合成酶、和腺苷脱氨酶。根据需要，本领域技术人员可以容易地选择其它标志物。

在一些实施方案中，宿主细胞是具有改善的转染或转导简易性或其它想要的质量的快速生长细胞系，其可以用HBx和编码异源蛋白质的核酸转染。

本发明的产物蛋白质可以包括食物蛋白质，特别是供应必需营养物的食物蛋白质、用于药物开发或分析的蛋白质、食物加工蛋白质、和治疗性蛋白质。产物蛋白质可以是分泌性的或非分泌性的。分泌性蛋白质由于其回收简易而是合适的。在一些实施方案中，作为分泌性产物生成的治疗性蛋白质是特别合适的。可以生成产物蛋白质的变体(即突变体型式的蛋白质，其保留野生型蛋白质的所有或部分功能，诸如例如人凝固因子VIII的B域缺失型变体)。

可用于本发明的治疗性蛋白质包括但不限于通常在血液中找到的蛋白质诸如血液因子；血液中找到的响应应激、感染、或疾病的蛋白质；哺乳动物乳中找到的蛋白质；通常在淋巴中找到的蛋白质；淋巴中找到的响应应激、感染、或疾病的蛋白质；通常在脑脊液中找到的蛋白质；脑脊液中找到的响应应激、感染、或疾病的蛋白质；通常在肠中找到的蛋白质；或来自微生物的蛋白质；或这些蛋白质的突变蛋白质。此外，可以使治疗性蛋白质突变，诸如通过截短或删除一部分诸如一个或多个域来实现。此外，突变蛋白质可以包含1、2、3、或更多处氨基酸替代。在一些实施方案中，氨基酸替代是保守的，如本领域中所了解的。

“治疗性蛋白质”或“治疗性多肽”指拥有生物学活性的多肽或其前体，其可以用于预防和/或治疗疾病。治疗性多肽的例子包括那些能够预防、抑制、稳定或反转代谢中的遗传性或非遗传性遗传缺陷、免疫调节、激素调节、酶缺陷、或膜相关的结构功能的多肽。例如，治疗性蛋白质可以替换缺乏的或有缺陷的细胞蛋白质或酶，或者补充有缺陷的或低表达的细胞蛋白质或酶的生成。治疗性蛋白质可以包括融合蛋白、抗体、抗体片段、和抗体模拟物、和具有增强的活性的改组蛋白质变体。

治疗性蛋白质可以包括凝固因子、抗体、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原、和代谢调节物。代谢调节物可以包括肽激素、趋化因子、细胞因子、和生长因子。在某些实施方案中，治疗性蛋白质可以是肿瘤阻抑物、细胞因子、促凋亡因子、或自微生物衍生的蛋白质。

术语“血液蛋白质”指正常人血液中找到的一种或多种蛋白质或其生物学活性片段，包括但不限于血红蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、血纤蛋白原、人血清清蛋白、凝血酶原/凝血酶、抗体、血液凝固因子、和其生物学活性片段。凝固蛋白包括凝血因子V、凝血因子VI、凝血因子VII、凝血因子VIII和其衍生物诸如B域缺失型FVIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、Fletcher因子、Fitzgerald因子、和von Willebrand因子。

术语“乳蛋白质”指正常人乳中找到的一种或多种蛋白质或其生物学活性片段，包括酪蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶、α-1抗胰蛋白酶、抗体、蛋白质因子、免疫分子、和其生物学活性片段。

在一些实施方案中，在治疗性蛋白质是抗体时，涵盖任何编码此类抗体的核酸。包括单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、和其它抗体变体分子，其可以以重组粘附或悬浮细胞培养方式生成。

本发明范围内的抗体包括但不限于：西妥昔单抗(cetuximab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥单抗(trastuzumab)、吉姆单抗(gemtuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、托西莫单抗(tositumomab)、贝伐单抗(bevacizumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、HuPAM4、3F8、G250、HuHMFG1、Hu3S193、hA20、SGN-30、RAV12、达珠单抗(daclizumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、阿昔单抗(abciximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、艾库组单抗(eculizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、抗HER2抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)、美国专利号5,725,856)；抗CD20抗体诸如嵌合抗CD20“C2B8”，如美国专利号5,736,137中的；2H7抗体的嵌合或人源化变体，如美国专利号5,721,108，B1中的；或抗IL-8(St John等，Chest，103：932(1993)，WO 95/23865)；抗VEGF抗体，包括人源化的和/或亲和力成熟的抗VEGF抗体诸如人源化抗VEGF抗体huA4.6.1 AVASTIN^TM(Kim等，Growth Factors，7：53-64(1992)、WO 96/30046、和WO 98/45331)；抗PSCA抗体(WO01/40309)；抗CD40抗体，包括S2C6和其人源化变体(WO00/75348)；抗CD11a(美国专利号5,622,700、WO 98/23761、Steppe等，Transplant Intl.4：3-7(1991)，及Hourmant等，Transplantation 58：377-380(1994))；抗IgE(Presta等，J.Immunol.151：2623-2632(1993)，WO 95/19181)；抗CD18(美国专利号5,622,700或WO 97/26912)；抗IgE(包括E25、E26和E27；美国专利号5,714,338或美国专利号5,091,313、WO 93/04173或PCT/US98/13410、美国专利号5,714,338)；抗Apo-2受体抗体(WO 98/51793)；抗TNF-α抗体，包括cA2(REMICADE^TM)、CDP571和MAK-195(参见美国专利号5,672,347、Lorenz等，J.Immunol.156(4)：1646-1653(1996)、及Dhainaut等，Crit.Care Med.23(9)：1461-1469(1995))；抗组织因子(TF)(欧洲专利号0 420 937 B1)；抗人α4β7整联蛋白(WO 98/06248)；抗EGFR(嵌合的或人源化的225抗体，如WO96/40210中的)；抗CD3抗体诸如OKT3(美国专利号4,515,893)；抗CD25或抗tac抗体诸如CHI-621(SIMULECT^TM)和(ZENAPAX^TM)(参见美国专利号5,693,762)；抗CD4抗体诸如cM-7412抗体(Choy等，Arthritis Rheum39(1)：52-56(1996))；抗CD52抗体诸如CAMPATH-1H(Riechmann等，Nature332：323-337(1988))；抗Fc受体抗体诸如针对FcγRI的M22抗体，如在Graziano等，J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)中的；抗癌胚抗原(CEA)抗体诸如hMN-14(Sharkey等，Cancer Res.55(23 Suppl)：5935s-5945s(1995)；针对乳房上皮细胞的抗体，包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani等，Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；及Richman等，Cancer Res.55(23 Supp)：5916s-5920s(1995))；结合结肠癌细胞的抗体诸如C242(Litton等，Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；抗CD38抗体，例如AT 13/5(Ellis等，J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；抗CD33抗体诸如Hu M195(Jurcic等，Cancer Res55(23 Suppl)：5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；抗CD22抗体诸如LL2或LymphoCide(Juweid等，Cancer Res 55(23 Suppl)：5899s-5907s(1995))；抗EpCAM抗体诸如17-1A(PANOREX^TM)；抗GpIIb/IIIa抗体诸如阿昔单抗(abciximab)或c7E3 Fab(REOPRO^TM)；抗RSV抗体诸如MEDI-493(SYNAGIS^TM)；抗CMV抗体诸如PROTOVIR^TM；抗HIV抗体诸如PRO542；抗肝炎抗体诸如抗Hep B抗体OSTAVIR^TM；抗CA 125抗体OvaRex；抗独特型GD3表位抗体BEC2；抗α v.γ3抗体VITAXIN^TM；抗人肾细胞癌抗体诸如ch-G250；ING-1；抗人17-1A抗体(3622W94)；抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；针对GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24；抗人鳞状细胞癌(SF-25)；和抗人白细胞抗原(HLA)抗体诸如Smart ID10；抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)或阿达木单抗(adalimumab)或其活性片段。本文中抗体优选的靶抗原是：HER2受体、VEGF、IgE、CD20、CD11a、和CD40。

在治疗性蛋白质是代谢调节物时，涵盖任何蛋白质或多肽代谢调节物。要理解的是，可以使用本发明的方法来表达治疗性蛋白质的任何突变体或变体。

作为非限制性例子，此类治疗性蛋白质包括红细胞生成素、人生长激素、粒细胞集落刺激因子、干扰素-α、-x2b、-β、-β1a、-β1b和-γ、凝血因子IX、促卵泡激素、白介素-2、红细胞生成素、抗TNF-α、和溶酶体水解酶。治疗性蛋白质还可以包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF、FGF1、FGF2、和FGF5)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、神经细胞生长因子(NGF)和肝细胞生长因子(HGF))。

在治疗性蛋白质是细胞因子时，涵盖任何细胞因子。在具体的实施方案中，细胞因子是GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-10、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TNF-β、TNF-α、TNF-β、角质形成细胞生长因子、TGF-α、TGF-β、VEGF、或MDA-7。

可以依照本发明生成的其它蛋白质和多肽包括但不限于胰岛素、促胃动素、胃泌素、促乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、红细胞生成素、生长激素(GH)、干细胞因子(SCF)、促血小板生成素、骨保护素(OPG)、和肥胖蛋白、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、胰岛素样生长因子(IGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、集落刺激生长因子(CSF)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、神经营养生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT3)、神经营养因子4(NT4)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、骨形态生成蛋白(BMP)、巨核细胞生长分化因子(MGDF)、超氧化物歧化酶(SOD)、组织血纤维蛋白溶酶原激活物(TPA)、尿激酶、链激酶、激肽释放酶、α-半乳糖苷酶、胰RNA酶、血小板激活因子乙酰水解酶、白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)、REMICADE(英夫利昔单抗：一种阻断循环性TNFα的生物学活性的单克隆抗体)、α-1抗胰蛋白酶、抗血管发生剂、降钙素和类似物、趋化因子、脑啡肽和其它阿片样肽、胰高血糖素、格拉司琼、生长激素拮抗肽、IgE阻抑物、促胰岛素和类似物、黄体生成素、黄体生成素释放激素和类似物、甲状旁腺素和类似的肽、甲状旁腺素拮抗肽、重组可溶性受体、组织血纤维蛋白溶酶原激活物、治疗性抗原、和ENBREL(依那西普：由与人IgG1的Fc部分连接的人75千道尔顿(p 75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分组成的嵌合融合蛋白)。

在治疗性蛋白质是肿瘤阻抑物时，涵盖任何肿瘤阻抑物。在具体的实施方案中，编码肿瘤阻抑物的核酸是APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、MDA-7、Rb、子宫珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、基因26(CACNA2D2)、PL6、Beta*(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、基因21(NPRL2)、或编码SEM A3多肽的基因。

涵盖糖蛋白IIb/IIIa血小板膜受体拮抗剂抗体、重组水蛭素和凝血酶、凝血酶抑制剂诸如Angiomax、血管肽素、成纤维细胞生长因子(FGF)拮抗肽、和单克隆抗体诸如那些对血小板衍生的生长因子(PDGF)受体、超氧化物歧化酶、超氧化物歧化酶模拟物、及其组合特异性的。

合适的疫苗抗原包括那些白喉、破伤风、HIB、莱姆病(Lyme disease)、脑膜炎球菌(meningococcus)、腮腺炎、风疹(rubella)、水痘(varicella)、黄热病(yellow fever)、呼吸道合胞病毒、蜱携带的日本脑炎、肺炎球菌(pneumococcus)、链球菌(streptococcus)、伤寒、流行性感冒、肝炎(包括甲肝、乙肝、丙肝)和中耳炎(E.otitis media)、狂犬病、脊髓灰质炎、副流行性感冒、轮状病毒、埃巴病毒、CMV、衣原体、不可分型嗜血杆菌(haemophilus)、粘膜炎莫拉氏菌(moraxella catarrhalis)、人乳头瘤病毒、结核病(包括BCG)、淋病、哮喘、动脉粥样硬化、疟疾、大肠杆菌(E.coli)、阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s Disease)、沙门氏菌(salmonella)、糖尿病、癌症、单纯疱疹、人乳头状瘤、HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、FeLV、马感染性腺病毒、贫血病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、裂谷热病毒(riftvalley fever virus)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagicfever virus)、SARS冠状病毒、猴痘病毒、腺病毒、天花、日本(蚊子携带的)脑炎、黄热病、登革热、西尼罗河脑炎、肠产毒性大肠杆菌、幽门螺杆菌(Campylobacter H.pylori)、艰难梭菌(C.difficile)、和麻疹(measles)的(包括但不限于亚基蛋白、肽和类毒素)。蛋白质可以是腺病毒死亡蛋白。

在治疗性蛋白质是促凋亡因子时，涵盖任何编码此类因子的核酸。在一些实施方案中，促凋亡因子核酸是CD95、胱天蛋白酶-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、或BID。

在一些实施方案中，治疗性蛋白质衍生自微生物。虽然涵盖任何来自微生物的蛋白质，但是在一些实施方案中，蛋白质是自病毒、细菌、真菌、或原生动物衍生的蛋白质。

抗原也可以源自并选自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、恰菲埃里希氏体(Ehrlichia chaffeensis)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)和布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)。

在一些实施方案中，衍生抗原的微生物选自以下列表：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovate)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、和肠贾第鞭毛虫(Giadaria intestinalis)。

在一些实施方案中，衍生抗原的微生物选自以下列表：组织胞浆菌属(Histoplasma)、Ciccidis、Immitis、曲菌(Aspergillus)、放线菌属(Actinomyces)、芽生菌属(Blastomyces)、念珠菌属(Candida)和链霉菌属(Streptomyces)。

胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶家族(S1)包括诸如下列的成员：胰蛋白酶(形式I、II、III、IV、Va和Vb)；胰蛋白酶样酶；hepsin；TMPRSS2；venombin；尾蚴弹性蛋白酶；brachyurin；C因子；凝固酶原(Proclotting enzyme)；easter基因产物；蛇基因产物；残梗(stubble)基因产物；卵黄磷蛋白降解内肽酶；hypodermin C；丝氨酸蛋白酶1和2；achelase；胰凝乳蛋白酶(形式A、B、II、和2)；蛋白酶RVV-V(形式α和γ)；flavoboxin；venombin A；Crotalase；肠激酶；顶体蛋白；安克洛酶(ancrod)；精囊素(seminin)；semenogelase；组织激肽释放酶；肾激肽释放酶；下颌下激肽释放酶；7S神经生长因子(链α和γ)；表皮生长因子结合蛋白(形式1、2、和3)；紧张肽(tonin)；精氨酸酯酶；胰弹性蛋白酶I；胰弹性蛋白酶II(形式A和B)；胰内肽酶E(形式A和B)；白细胞弹性蛋白酶；medullasin；天青杀素(azurocidin)；组织蛋白酶G；蛋白酶3(成髓细胞蛋白酶)；糜蛋白酶(chymase)(形式I和II)；γ-肾素；类胰蛋白酶(形式1、2、和3)；粒酶A；天然杀伤细胞蛋白酶1；gilatoxin；粒酶B、C、D、E、F、G和Y；羧肽酶A复合物成分III；补体因子D、B、I；补体成分C1r、C1s、和C2；钙依赖性丝氨酸蛋白酶；hypodermin A、B、和C；触珠蛋白(形式1和2)；触珠蛋白相关蛋白；纤溶酶；载脂蛋白(a)；肝细胞生长因子；medullasin；凝血酶；t-血纤维蛋白溶酶原激活物；u-血纤维蛋白溶酶原激活物；唾液血纤维蛋白溶酶原激活物；血浆激肽释放酶；凝固因子VII、IX、X、XI、和XII；及蛋白C和Z、以及迄今未鉴定的成员。所有胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶家族成员蛋白可以本发明的蛋白质产物。

本发明的其它产物蛋白质包括但不限于受体配体、酶、粘着肽、凝固抑制剂或凝块溶解剂诸如链激酶和组织纤溶酶原激活物、基质金属蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶的组织抑制剂、和上述任意组合。

可用于本发明的溶酶体水解酶包括但不限于β-糖苷酶、α-半乳糖苷酶-A、β-己糖胺酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、α-糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶、和酸性磷酸酶。

包括所有主要多肽治疗剂诸如针对感冒(common cold)的药剂的治疗性抗原也是治疗性蛋白质。

本发明的方法和重组细胞培养物还可以包含商业蛋白质、例如那些在表1中所列的。

表1

编码上述蛋白质的核酸是本领域中已知的或者可以使用熟练技术人员熟悉的方法来获得。例如，可以通过筛选噬菌体文库来获得编码高亲和力抗体的核酸。

通过本发明方法生产的异源蛋白质可以包括多肽原。多肽原可以缺乏N端信号序列和/或起始甲硫氨酸，而且可以由编码此类氨基酸序列的核苷酸序列编码。本发明的方法还涵盖生产前多肽原，即多肽原的前体。

可以通过本领域中公知的方法来回收通过本发明方法生产的异源蛋白质，所述方法包括溶解细胞以回收非分泌性蛋白质或者自培养基分离以获得分泌性蛋白质。此外，可以通过任何有用的手段来纯化蛋白质，所述手段包括但不限于沉淀、结合离子交换或亲和树脂或膜、和大小排阻层析。用于表达并回收由哺乳动物细胞系统所生成的重组蛋白的通用方法由例如，Etcheverry，Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture，于Protein Engineering：Principles and Practice，Cleland等(编)，第163页(Wiley-Liss，Inc.1996)披露。

在一些实施方案中，与没有用HBx或用HBx和XBP1s转染的其它细胞中的生成水平相比，治疗性蛋白质的生成水平可以是约1.1×、1.2×、1.4×、1.6×、1.8×、2×、2.2×、2.4×、2.6×、2.8×、3×、3.2×、3.4×、3.6×、3.8×、4×、4.2×、4.4×、4.6×、4.8×、5×、或更大，或其中可导出的任何范围。

本发明的方法可以包括特定量的生成异源蛋白质。在一些实施方案中，每升细胞培养物非粘附悬浮液所生成的治疗性蛋白质量可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、或20mg或潜在地更高，或其中可导出的任何范围或组合。如此，本发明的组合物包括此类量的治疗性蛋白质，其可以进行或不进行进一步地纯化。可以通过本领域中已知的手段来进一步纯化自非粘附悬浮培养物回收的所收获的一种或多种异源蛋白质。纯化可以牵涉本领域中已知的任何方法，包括但不限于浓缩、通过切向流超滤进行的渗滤、层析或大小解析纯化、亲和纯化、和离子交换层析。在一些实施方案中，可以在异源蛋白质纯化中采用层析。在一些实施方案中，层析可以是亲和层析或离子交换层析。在又一些实施方案中，通过亲和层析纯化的异源蛋白质可以进一步进行离子交换层析。在本发明的一些实施方案中，所收获的异源蛋白质可以进行大小解析纯化。在一些实施方案中，大小解析纯化可以牵涉蛋白质凝胶或大小排阻柱。可以用一种或多种载体、赋形剂等药学配制依照本发明生成的异源蛋白质，并且可以使用惯常的方法来施用此类配制剂。

实施例

实施例1：HBx而不是US11和NS4B提高BHK21细胞中的蛋白质生成质粒构建

将用于瞬时转染的所有转基因克隆入表达载体pZac2.1(基因疗法项目(Gene Therapy Program)，Penn载体中心(Penn Vector core)，宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania))中，所述表达载体pZac2.1含有全长人CMV启动子、Promega嵌合内含子、MCS(多克隆位点)和SV40多聚A(基因疗法项目)。

从pBS质粒中含有的HBV株ADW2基因组获得HBx基因。在质粒中，HBx侧翼有MluI和XbaI限制性位点，并通过使用两种引物(正向引物GER270：GATCACGCGTGCCACCATGGCTGCTAGGCTG，SEQ ID NO.1和反向引物GER271：GTCGACTCTAGATTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTG，SEQ ID NO.2)的PCR来扩增。将扩增的HBx插入表达载体pZac2.1中以生成pHBx质粒。

通过使用两种引物(正向引物GER275：GATCACGCGTGCCACCATGAACCTTGTAATG，SEQ ID NO.3和反向引物GER276：GTCGACTCTAGATCACCACTGGTCCGAAAAC，SEQ ID NO.4)的PCR来扩增如Gretch和Stinski Virology，174(2)522-532(1990)中所描述的人CMV US11基因，并插入pZac2.1中以生成质粒pUS11。

HCV的NS4B基因(Gene bank：M588335)是经由Invitrogene(BlueHeronBiotechnology)合成的。该基因侧翼有MluI和XbaI，并克隆入pZac2.1中以创建质粒pNS4B。

使用全长人抗体MF-J(其特异性结合人间皮素(mesothelin))作为代表性异源蛋白质。在MF-J中，重链和轻链是由弗林蛋白酶/2A切割位点连接的。为了生成供瞬时转染用的pMF-J/fu/2A的终产物，创建模板质粒pMorphH.Fur2A.kappanlight(pGT149)。为了构建pGT149，如下自pMORPH hIg kappa 1(来自MorphoSys AG，德国的HuCal技术)中的人kappa恒定区消除BlpI位点，即用BbvC1和BlpI消化，并与退火的寡聚物GER212(5’-TCAGCAGCACCCTGACCC-3’)SEQ ID NO.5和GER213(5’-TCAGGGTCAGGGTGCTGC-3’)SEQ ID NO.6连接。然后通过三片段连接来生成pGT149。一个片段是pZac2.1，其已经用NheI+NotI打开主链。第二片段是自pMORPH h IgG1-1质粒(含有NheI位点-VH前导-EcoR1/BlpI填塞物(stuffer)-hH恒定的-以Ngo MIV结尾的fur2A序列的N端部分)用寡聚物GER204(5’-GGAGACCCAAGCTGGCTAGC-3’，SEQ ID NO.7)和GER205(5’-ACGTCGCCGGCCAGCTTCAGCAGGTCGAAGTTCAGGGTCTGCTTCACGGGGGCTCTCTTGGCCCGTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’，SEQID NO.8)得到并用NheI和Ngo MIV消化的PCR产物。第三片段也是自pMORPH h Ig kappa 1质粒(缺乏BlpI位点)(含有Fur2A序列C端末端的NgoMIV-Vkappa前导-EcoRV/BsiWI填塞物-人kappa恒定区-NotI片段)用寡聚物GER206(5’-GAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGTCCAACCCCGGCCCCATGGTGTTGCAGACCCAGGTC-3’，SEQ ID NO.9)和GER 207(5’-ATCAGTGCGGCCGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3’，SEQ IDNO.10)得到并用NgoMIV和NotI消化的PCR产物。

为了构建pMF-J/fu/2A，通过四向连接(four-way ligation)将MF-J抗体可变重(VH)和轻链(VL)插入pGT149模板中，因为抗体具有Kappa轻链。分别通过MfeI-BlpI或EcoRV-BsiWI消化自pMORPH9 MF-J获得MF-J VH和VL片段。用EcoRI和BlpI打开pGT149作为主链。还用BlpI和EcoRV消化pGT149以获得连接VH和VL的中间片段。

自pCMV-Gluc质粒(Sigma，St.Louis，MO)获得分泌性Gaucissa萤光素酶基因(图中的“Gluc”)，并通过KpnI+NotI的限制酶消化来亚克隆入pZac2.1中以生成pGluc。

通过Sal I和Not I限制酶自质粒pGT36(记载于Szymanski等，MolecularTherapy 15(7)1340-1347(2007)切割鼠SEAP(分泌性碱性磷酸酶)基因，然后亚克隆入用Not I和Sal I打开的pZac2.1中以产生pmuSEAP质粒。

细胞培养

将BHK21细胞在补充有5％胎牛血清、非必需氨基酸、和丙酮酸钠的生长培养基中维持。将HKB11细胞在补充有5％胎牛血清的生长培养基中维持以粘附培养。

瞬时转染

对于pHBx与pMF-J/fu/2A或pGluc的共转染，通过Fugene6法(Roche，Indianapolis，IN)瞬时转染BHK21和HKB11细胞两者。将细胞接种入12孔板中，24小时后以对于BHK21的约1.5x10⁵个细胞/孔和对于HKB11的约2x10⁵个细胞/孔的细胞密度转染。对于每种转基因，用不同量的质粒转染6孔，如表2中所显示的。将靶基因质粒的量保持恒定，而改变pHBx量。使用pBlueScript(pBS)来平衡每孔的总量DNA，使得转染条件在各孔间一致。将期望量的DNA混合入具有4.8μl Fugene6的50μl opti-MEM中。96小时后收集细胞培养上清液或细胞。重复每项实验至少三次。

表2

  孔#  1  2  3  4  5  6  pTransgene(ug)  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  0.5  pHBx(ug)  0  0.1  0.2  0.4  0.6  0.8  pBS(ug)  0.8  0.7  0.6  0.4  0.2  0

对于用Fugene6的单一质粒转染，将DNA∶Fugene6比率保持在约1∶6(每12孔0.8μg DNA：4.8μl Fugene6)。若仅将pMF-J/fu/2A或pGluc转染入细胞中，则质粒是约0.8μg/孔。一式两份或一式三份实施每次转染，并重复转染组2-3次。若将pHBx转染入细胞中，则pHBx量自约0μg变化至0.8μg，并使用pBS来控制每孔转染的总量DNA。转染方法与上文所描述的相同。

通过ELISA来检测全长抗体MF-J/fu/2A

用碳酸氢盐缓冲液中的25ng/50μl/孔间皮素(c-端Flag标签，SEC集合，储液中的1.41mg/ml浓度)于4℃包被Immulon 4 HBX板过夜。用200μl/孔封闭缓冲液(PBS中的3％ BSA)封闭平板达1小时，期间进行摇动。将标准的MF-J抗体(1.66mg/ml)和样品制备为想要百分比的培养基内的50μl/孔，并于RT温育2小时。MF-J抗体标准曲线的起始点是1μg/ml，然后是总共11个点的1∶3连续稀释。对于细胞培养上清液，进行每份样品的2至4个稀释点，使得至少2个点落入标准曲线的线性范围内。然后使用洗板机(Bio-tek)用0.05％ PBST(PBS缓冲液中的0.05％ TWEEN 20)清洗缓冲液清洗平板4次。将50μl/孔经HRP偶联的山羊抗人IgG(Pierce，1∶5000稀释)于RT温育1小时，之后用PBST(0.05％TWEEN)清洗四次。添加100μl/孔ABTS(Sigma)后测量405nm处的吸光度。通过Softmax pro 4.3.1软件来计算每种样品的抗体浓度。

分泌性Gaussia萤光素酶(Gluc)测定法

通过海肾(Renilla)萤光素酶试剂盒(Promega，Madison，WI)来测定分泌性Gluc活性。将细胞上清液在1x被动溶解缓冲液(Promega)中在10⁴和10⁵之间稀释。使用20μl稀释样品来测量。结果表示为相对光单位(RLU)。

muSEAP活性测定法

通过化学发光活性测定试剂盒(Applied Biosystems，Bedford，MA)来测定muSEAP活性。

Western印迹

将细胞在RIPA缓冲液(Sigma，St.Louis，MO)或1xLDS缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)中溶解。然后将溶解材料上样，并在12％ Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分开。将凝胶经由iBlot(Invitrogen，Carlsbad，CA)印迹到硝酸纤维素膜上，并立即在PBS中的5％乳中于4℃封闭过夜。然后将膜与兔抗人HBx多克隆抗体(Abcam，Cambridge，MA.0.05％ PBST中的1∶2000)于RT一起温育2小时，接着与经HPR偶联的山羊抗兔IgG(Jackson Labs，0.05％ PBST中的1∶5000)一起再温育1小时。使用ECL Plus(Amersham Biosciences，Pittsburgh，PA)来检测条带。

以瞬时转染方式在许多不同细胞系中筛选三种病毒基因对蛋白质生成的影响。将增加量的pUS11、pNS4B和pHBx表达质粒与恒定量的pMF-J/fu/2A(0.5μg)共转染入C2C12和BHK21中(图1)。培养96小时后收集上清液。通过ELISA来检测功能性全长抗体MF-J表达水平。倍数变化计算为相对于具有0.5μg靶基因质粒但没有病毒基因添加的对照孔的蛋白质表达比率。图1中呈现的结果显示了HBx的表达而不是US11或NS4B的表达在C2C12和BHK2细胞两者将蛋白质生成提高约2-3倍。用MF-J抗体或分泌性Gluc的共表达来测试CHO-K1细胞中的US11基因和CHO-S和HKB11细胞中的NS4B基因。没有观察到US11或NS4B提高这些细胞系中的蛋白质生成。

实施例2：靶基因与HBx的瞬时共转染增强生产细胞系BHK21和HKB11中的蛋白质生成

在某些哺乳动物宿主细胞系中以瞬时转染形式进一步评估HBx对蛋白质生成的影响。将增加量的pHBx表达质粒与恒定量的pMF-J/fu/2A或pGluc共转染入BHK21和HKB11细胞中(图2)。转染后96小时时溶解细胞，并进行Western印迹分析以确认HBx以剂量依赖性方式表达。图2显示了用BHK21细胞的结果。在HKB11细胞中看到相似的结果。在HKB11细胞中看到相似的结果。

进行对与pMF-J/fu/2A瞬时共转染的BHK21细胞中的HBx表达的Western印迹分析。将全细胞提取物在12％ Bis-Tris凝胶上分开，并用抗人HBx抗体探查。在每道中上样等量的蛋白质。在所有经转染的孔中而不是对照孔中观察到17.5kDa条带。对于用于转染的0.1至0.8μg pHBx，所表达的HBx量以近似单调(momotonic)方式增加。

实施例3：与HBx的瞬时共感染提高蛋白质生成。

还自与对实施例2中的Western印迹分析所使用相同的样品在96小时时收集上清液。结果揭示了HBx与MF-J Ab的共转染导致广泛范围的pHBx∶pMF-J比率(0.2∶1至1.6∶1)里在BHK21和HKB11细胞两者中MF-J抗体表达升高2.5-3.5倍(图2A和2C)。HBx与报告基因Gluc的共转染引起BHK21和HKB11细胞两者中Gluc表达升高1.5-2.5倍。

图2显示了HBx在瞬时共转染中增强蛋白质生成。用增加量的pHBx和固定量(0.5μg)的pMF-J/fu/2A全长抗体(2A和2C)或报告基因pGluc(2B和2D)来共转染BHK21(2A和2B)和HKB11(2C和2D)细胞。96小时后通过针对MF-J抗体的ELISA(2A和2C)或针对Gluc的海肾萤光素酶试剂盒(2B和2D)来测量分泌入上清液培养基中的蛋白质生成。倍数变化计算为相对于具有0.5μg靶基因质粒但没有HBx添加的对照孔的蛋白质表达比率。图表示三次实验的平均值。

实施例4：靶基因与HBx的瞬时共转染提高C2C12细胞中的蛋白质生成

还在小鼠骨骼肌C2C12细胞中评估HBx对蛋白质表达的影响。再次与0.5μg pMF-J/fu/2A、pGluc或pmuSEAP共转染一定范围的pHBx质粒(量为0-0.8μg)。图3中呈现的数据显示了HBx以广泛范围的pHBx∶pTransgene比率(0.05∶1至1.6∶1)增强C2C12细胞中的蛋白质表达。

图3显示了HBx在瞬时共转染中在C2C12细胞中提高蛋白质生成。用组成性表达的HBx和MF-J全长抗体或报告基因Gluc或muSEAP共转染C2C12细胞。96小时后通过针对MF-J抗体的ELISA、针对分泌性Gluc活性的海肾萤光素酶试剂盒、或针对分泌性muSEAP活性的SEAP试剂盒来测量来自上清液的蛋白质生成。倍数变化计算为相对于具有0.5μg靶基因质粒但没有HBx添加的对照孔的蛋白质表达比率。图3中的图表示三次实验的平均值。

如此，HBx与异源核酸的共表达能显著提高某些宿主细胞和宿主细胞系中的产物蛋白质的产量。

实施例5：HBx在BHK21和HKB11细胞的稳定集合中的表达慢病毒生成

为了生成HBx慢病毒，用NheI和NotI自pHBx切割HBx基因，并亚克隆入慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-Puro(System Biosciences，Mountain View，CA)中以形成pCDH1-HBx质粒。此质粒具有最小的CMV启动子。将293T细胞以6x106个细胞的密度在细胞培养基(DMEM+10％ FBS+1X L-谷氨酰胺)中于37℃和5％ CO₂温育的15cm碟中接种。第二天，吸出培养基，并用含有包含质粒pLP1(编码gag-pol；Invitrogen)、pLP2(编码rev；Invitrogen)和pLP(编码VSV-G；Invitrogen)的opti-MEM(Invitrogen)、基因转移质粒(编码HBx蛋白)和Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)的转染培养基替换。24小时后用维持培养基(DMEM+5％ FBS+1X L-谷氨酰胺)替换转染培养基。转染后48小时，收集培养基，使用Millex-HV 0.45μm PVDF滤器(Millipore)过滤，并通过超速离心来浓缩病毒颗粒。

稳定集合和克隆的建立

为了生成携带HBx的集合和克隆，以1x10⁶个细胞/孔在6孔板中接种BHK21和HKB11细胞，一天后进行慢病毒转导。将200μl具有感染复数(MOI)0.1、1和10的慢病毒添加至细胞。温育4小时后，除去含有慢病毒的培养基，并用新鲜的培养基清洗细胞2-3次，之后添加最终2ml培养基。48小时后以对于BHK21的2μg/ml和对于HKB11的2.5至5μg/ml的浓度添加嘌呤霉素。

对于单克隆，在每孔中使用100μl含有选择药物的培养基在96孔板中以1个细胞/孔和0.1个细胞/孔接种合并的细胞。温育约1-2周后，在达到80-90％汇合时将细胞扩充入24孔板中。然后将克隆冷冻或培养，用于进一步分析。

以MOI为0.1、1和10用Lenti-HBx(表达全长HBx的慢病毒)转导BHK21和HKB11细胞。稳定的集合是嘌呤霉素选择后来自其相应的MOI的细胞混合物。通过Western印迹来证明BHK21和HKB11集合中的HBx表达水平。在提高病毒的MOI时，HBx表达水平升高。

将全细胞提取物在12％ Bis-Tris凝胶上分开，并用抗人HBx抗体探查。在每道中加样等量的蛋白质。对BHK21和HKB11稳定集合中的HBx表达的Western印迹分析揭示了对照转染中没有表达和0.1、1.0、和10个MOI的Lenti-HBx的情况中17.5kDa HBx表达逐渐升高。

实施例6：蛋白质生成在HBx表达稳定集合中升高

在引导实验中使用稳定的HBx集合以评估HBx对细胞生产率的总体代表和平均影响。将pMF-J/fu/2A和pGluc瞬时转染入表达不同水平的HBx的BHK21和HKB11稳定集合中。如图4中所显示的，BHK21/HBx和HKB11/HBx集合两者都产生升高超过2倍的蛋白质生成。

图4显示了蛋白质生成在组成性表达HBx的BHK21和HKB11稳定集合中是升高的。在12孔板中用pMF-J/fu/2A或pGluc转染BHK21/HBx和HKB11/HBx稳定集合。96小时后收集上清液。分别通过ELISA和海肾萤光素酶试剂盒来测量MF-J抗体水平和Gluc活性。倍数变化计算为相对于亲本对照细胞的比率。

实施例7：稳定的BHK21/HBx和HKB11/HBx克隆的创建

自三种稳定的集合(MOI为0.1、1、和10)，将细胞以0.1个细胞/孔和1个细胞/孔的细胞浓度分配入96孔板中，所述孔具有嘌呤霉素选择下的100μl生长培养基。分离总共42个克隆。对二十四(24)个克隆进一步评估HBx表达水平和蛋白质生产率。没有观察到HBx表达水平与蛋白质生产率之间的明显相关性。因而，然后基于HBx表达的不同水平(低的、中等的和高的)和MF-J和Gluc表达的相当水平来选择5个克隆。克隆具有下列表观HBx表达：克隆31，低的；克隆22，中等的；克隆18，高的；克隆13，高的；和克隆42，高的。如图5中所显示的，这些BHK21/HBx克隆可以将MF-J抗体和Gluc报告基因蛋白质生产率提高约2至超过5倍。

图5显示了蛋白质生成在组成性表达HBx的BHK21稳定克隆中是升高的。对于来自各种克隆的HBx蛋白的Western印迹，将来自每种克隆的3x106个细胞在300μl 1xLDS样品缓冲液中溶解，加热并超声处理。将30μl(3x10⁵个细胞)在每道上加样，在12％ Bis-Tris凝胶上分开，并用抗人HBx抗体探查。图5显示了12孔板中用pMF-J/fu/2A或pGluc转染的BHK21/HBx稳定克隆。96小时后收集上清液。分别通过ELISA和海肾萤光素酶试剂盒来测量MF-J抗体水平和Gluc活性。倍数变化计算为相对于亲本对照细胞的比率。

如此，工程化改造成稳定表达HBx的某些细胞系可以提高异源产物蛋白质的产量。

实施例8：靶基因与HBx的瞬时共转染中非粘附DG44sus悬浮液对粘附DG44细胞对蛋白质生成的影响

DG44细胞系是一种自CHO pro3细胞衍生的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型细胞系。Urlaub等，1983，Cell，33：405-12(1983)。使DG44细胞系适应于非粘附悬浮培养以生成DG44sus系。在这两种细胞系中评估HBx对蛋白质表达的影响。用范围为0-0.8μg的pHBx质粒和0.5μg pGluc共转染DG44和DG44sus细胞。72小时后通过海肾萤光素酶试剂盒对来自上清液的蛋白质生成测量分泌性Gluc活性。倍数变化计算为相对于具有0.5μg靶基因质粒但没有HBx添加的对照孔的蛋白质表达比率。图表示三次实验的平均值。

图6显示了HBx可以在DG44sus细胞(标记为“DG44s”)中而不是DG44粘附细胞中提高Gluc表达2-2.5倍。这种升高指明即使在相同起源的细胞系中，细胞培养情况(非粘附悬浮液对粘附的)对蛋白质生成可以具有影响。

实施例9：在靶基因与Hbx的瞬时共转染中293F悬浮液对HEK293粘附细胞对蛋白质生成的影响

还在HEK293细胞系和293F细胞系(Invitrogen)中评估了HBx对蛋白质生成的影响。与0.5μg pGluc或pMF-J共转染范围为0-0.8μg的pHBx质粒。72小时后通过针对分泌性Gluc活性的海肾萤光素酶试剂盒和针对分泌性MF-J抗体的ELISA来测量来自上清液的蛋白质生成。倍数变化计算为相对于具有0.5μg靶基因质粒但没有HBx添加的对照孔的蛋白质表达比率。图表示2-3次实验的平均值。

图10显示了HBx可以将293F悬浮细胞中Gluc或MF-J抗体表达提高2-6倍，而在HEK293粘附细胞中提高约2倍。这再次指明即使来自相同起源的细胞系，细胞培养情况(非粘附悬浮液对粘附的)对蛋白质生成可以具有影响。

实施例10：HBx介导的生成升高不依赖于XBP1的激活。

通过测量XBP1s来检查HBx介导的蛋白质生成升高对激活XBP1s的影响，并通过定量PCR(qRT-PCR)来检查其推定的靶Erdj4 mRNA。数据指明HBx在此系统中不诱导XBP1s或其靶Erdj4 mRNA水平。参见图7。提取总RNA，并将相同量的总RNA进行每次反应。使用GAPDH作为内部对照。mRNA水平的倍数变化计算为相对于BHK21亲本细胞(BHK21p)的比率。另外，BHK21/HBx细胞系中的XBP1s蛋白质表达水平还显示与BHK21亲本细胞相比没有升高。

实施例10：XBP1s向BHK21/HBx稳定细胞系的添加提高蛋白质生成

本文所呈现的数据显示了单独的XBP1s表达升高可以通过瞬时共转染来提高BHK21亲本细胞中的异源蛋白质表达(图8A和图8B)。以与图3中所显示相同的方式完成HBx与XBP1s的组合工程实验。将固定量的pMF-J/fu/2A或pGLuc和渐进量的pXBP1s瞬时共转染入12孔板中的BHK21亲本细胞、BHK21/HBx稳定集合、和BHK21/HBx克隆中。在120小时时测量上清液培养基中的蛋白质表达水平，并显示于图8A(MF-J)和图8B(Gluc)中。通过将XBP1s添加入BHK21/HBx稳定细胞中，BHK21/HBx/XBP1s细胞与其相应的没有添加XBP1s的BHK21/HBx集合和克隆相比产生升高超过2.6至4.7倍的MF-J和升高1.9至3.4倍的Gluc。在使用用XBP1s瞬时转染的BHK21亲本细胞作为对照时，BHK21/HBx/XBP1s细胞产生升高超过2.5至6倍的MF-J抗体生成和升高1.4至3.6倍的Gluc生成。这些结果表明与用单独的HBx或XBP1s转染的细胞相比，XBP1s能进一步提高BHK21/HBx稳定转染子中的蛋白质生成。

实施例11：HBx和XBP1s共转染对蛋白质生成具有协同效应

在没有HBx或XBP1s的情况中用MF-J或Gluc瞬时转染BHK21亲本细胞以充当图8中所显示实验的对照。在12孔板中用0.2μg pXBP1s和0.5μgpMF-J/fu/2A全长抗体或pGluc报告基因共转染BHK21亲本细胞和BHK21/HBx#22克隆。转染后120小时通过ELISA对来自上清液的蛋白质生成测量MF-J，并在96小时后通过海肾试剂盒测量GLuc活性。倍数变化计算为相对于具有0.5μg靶基因质粒但没有HBx或XBP1s添加的BHK21亲本细胞的蛋白质表达比率。图显示了2-4次实验的均值和范围。这些结果显示了用编码HBx和XBP1s的核酸共转染在BHK21细胞中可以以协同方式提高蛋白质生成。

如图9中对MF-J抗体表达所显示的，以0.2μg pXBP1s剂量单独添加XBP1s产生3.76倍升高，而单独的HBx添加给出4.3倍升高。在用HBx和XBP1s两者转染BHK21细胞时，观察到15倍的MF-J抗体分泌。通过XBP1s转染将Gluc表达提高2.84倍，通过HBx转染提高4.37倍，而通过共转染提高10.53倍。

表3更为详细地显示了使用BHK21亲本细胞作为对照，独立地和共同地HBx和XBP1s核酸的效果的比较。产物蛋白质生成的升高在BHK21/HBx合并的稳定物和克隆两者中都适用(表3)。细胞的稳定集合显示了该效果不源自克隆。依照这些测量，HBx和XBP1s的共表达对BHK21细胞中的蛋白质生成具有协同影响。参见表3。例如，BHK21/HBx#22/XBP1s细胞在0.4μg至0.6μg的pXBP1s剂量达到其最大Gluc蛋白质生成，而BHK21/HBx#42细胞在0.1μg的pXBP1s剂量达到其最大Gluc蛋白质生成。

如此，与亲本细胞和用单独的HBx或XBP1s转染的细胞相比，与靶基因瞬时共表达入BHK21/HBx稳定细胞系中提高蛋白质生成。此外，与HBx和XBP1s的共转染对蛋白质生成具有协同影响。

在此以与描述、进行或使用如要求保护的发明相关的程度将本文中所公开的所有参考文献收入本文。