一种从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法

摘要

本发明公开一种从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，包括：将柱层析硅胶分散在磷酸-乙醇溶液中，抽真空，再超声浸润，然后回收乙醇，烘干得磷酸-硅胶固定相；磷酸-硅胶固定相装填至已通入高纯氮气保护的层析柱管中，得到磷酸-硅胶层析柱；将迷迭香叶提取物溶于乙酸乙酯中，加入磷酸-硅胶固定相，充分搅拌后回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香叶提取物的固定相，将吸附迷迭香叶提取物的固定相加入到磷酸-硅胶层析柱中，洗脱，收集馏分并真空干燥后得到鼠尾草酸。本发明只需一次过柱就将鼠尾草酸单独分离出来，过柱时间短，纯度可达92％，有利于产品在市场中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法。

背景技术

迷迭香(Rosmarinus offoconalis L.)为唇形科迷迭香属植物，富含多种高效、安全的抗氧化成分。迷迭香提取物是一类新型优良的天然抗氧化剂，能够有效清除体内自由基，防止食品变质，并且具有消炎、抗肿瘤、抗艾滋病毒等功效([1]杨燕.迷迭香抽提物的性质与应用[J].中国食品工业，1999，(3)：38-39.[2]OffordEA，MacéK，Avanti O，et al.Cancer Letters[J].1997，114(12)：275-281.)。鼠尾草酸(Carnosic Acid，CA)是迷迭香脂溶性抗氧化剂中最主要的有效成分，不仅具有抗氧化活性，而且具有抗癌特性，在化妆品、药物和保健品等领域有广泛的应用。

目前国内外对分离鼠尾草酸的研究中主要存在以下难点：1、鼠尾草酸在众多溶剂中稳定性很差，易被氧化，溶剂分离方法几乎不可能获得高含量产品；2、普通硅胶柱层析方法分离鼠尾草酸的时间均较长，鼠尾草酸组分流出慢，效率低；3、大多数分离的后续步骤包含重结晶过程中，鼠尾草酸不仅溶剂稳定性差，而且热稳定性同样不好；4、成本高，不具有实际经济效益。因此，国际国内市场上能够提供的鼠尾草酸标准品的最高含量为92％。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，利用该方法鼠尾草酸组分流出快，时间短，且含量高。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，包括以下步骤：

(1)将柱层析硅胶分散在由无水乙醇∶磷酸＝200∶2.5～200∶7.5v/v制成的磷酸-乙醇溶液中，所述磷酸∶硅胶为1∶40～3∶40v/w，抽真空，再超声浸润，然后回收乙醇，烘干得到磷酸-硅胶固定相；

(2)将迷迭香叶提取物溶于乙酸乙酯中，将迷迭香叶提取物∶磷酸-硅胶固定相＝1∶4～1∶6w/w，加入磷酸-硅胶固定相，充分搅拌后回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香叶提取物的固定相；

(3)将步骤(1)的磷酸-硅胶固定相填充至已通入高纯氮气保护的层析柱管中，得到磷酸-硅胶层析柱；

(4)将步骤(2)的吸附迷迭香叶提取物的固定相加入到步骤(3)的磷酸-硅胶层析柱中进行分离，采用乙酸乙酯∶正己烷＝5∶95～18∶82v/v的混合溶液作为洗脱液，收集洗脱组分；

(5)将洗脱组分减压蒸馏至溶液变浑浊，冷藏至晶体析出，倾出溶剂，晶体经真空干燥后，充高纯氮气保存，即得鼠尾草酸。

优选地，所述步骤(1)中磷酸∶硅胶为2∶40。

优选地，所述步骤(2)中迷迭香叶提取物∶磷酸-硅胶固定相＝1∶5。如果磷酸-硅胶固定相过少，迷迭香叶提取物超出硅胶的担载量，分离的色带易重叠，影响分离效果；过多，会造成磷酸-硅胶固定相的浪费，因此，迷迭香叶提取物∶磷酸-硅胶固定相＝1∶5最为适宜。用少量磷酸-硅胶固定相来吸附迷迭香叶提取物，提高了鼠尾草酸在样品处理过程中的利用率。

优选地，所述步骤(4)中乙酸乙酯∶正己烷＝10∶90v/v，乙酸乙酯含量过多，洗脱液极性太大，会使洗脱速度过快，鼠尾草酸和其他较高极性的物质不能得到很好的分离；乙酸乙酯含量过少，洗脱速度过慢，分离时间长导致鼠尾草酸被氧化，因此，乙酸乙酯∶正己烷＝10∶90v/v最为适宜。

和现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明使用磷酸-硅胶固定相来分离鼠尾草酸，通过酸性环境在一定程度上保持了鼠尾草酸的稳定性；只需一次过柱就将鼠尾草酸单独分离出来，过柱时间短，鼠尾草酸在第一个色带前已出峰，即在分离时组分最先流出，可以节省洗脱液的用量，提高经济效益；操作时间短，有效地提高了鼠尾草酸的纯度，通氮气保护结晶后含量可达92％，抗氧化活性好，达到市售标准品含量指标。

具体实施方式

以下结合具体实施例来详细说明本发明。

以下实施例所用试剂与仪器如下：

柱层析硅胶(200-300固，青岛海洋化工厂)、正己烷、乙酸乙酯、磷酸(均为市售分析纯试剂)、石英双蒸水(由申请人实验室自制)、含60％鼠尾草酸的迷迭香叶提取物(市售)。

LC-10AT vp plus高效液相色谱仪(日本岛津公司)：由两台LC-10AT vp plus输液泵、一台SPD-10A vp plus紫外检测器、一台CBM-10A vp plus系统控制仪、一只77251六通进样阀和Lcsolution lite色谱工作站组成；色谱柱：DELTAPAKC18(5μm，150x 3.9mmID，Waters)。操作条件为80％甲醇(B溶液)和20％含0.5％磷酸的磷酸溶液(A溶液)等度洗脱，流量为1ml/min。检测波长284nm。进样量20μl。

RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

实施例1

从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，包括以下步骤：

(1)在500ml圆底烧瓶内加入200ml无水乙醇和2.5ml的磷酸，制成磷酸-乙醇溶液，称取100克柱层析硅胶分散于磷酸-乙醇溶液中，抽真空15min，以去除硅胶颗粒间的空气，防止过柱过程中鼠尾草酸被氧化，再超声浸润20min，置于旋转蒸发仪内回收乙醇，于120℃烘干8小时得磷酸-硅胶固定相，备用；

(2)称取2克含60％鼠尾草酸的迷迭香叶提取物，溶于乙酸乙酯中，加入10克磷酸-硅胶固定相，充分搅拌，于旋转蒸发仪内回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香叶提取物的固定相；

(3)空柱管通以高纯氮气将其中空气排出，在通氮保护的条件下按下述步骤装柱：称取90克磷酸-硅胶固定相，加入500ml无水正己烷，超声浸润20min，再抽真空15min，得到磷酸-硅胶正己烷分散液，备用；将磷酸-硅胶正己烷分散液搅拌，使磷酸-硅胶固定相均匀悬浮在正己烷中(装柱过程均保持分散状态)，缓慢倒入层析柱管中，打开柱管旋塞，使溶剂均匀流下。在磷酸-硅胶固定相完全沉积前加入后续磷酸-硅胶正己烷分散液，保证柱床层致密均匀。磷酸-硅胶固定相形成理想床层后保证磷酸-硅胶固定相上部至少有1cm以上的正己烷，不使柱头变干，从而得到磷酸-硅胶层析柱；

(4)将吸附迷迭香叶提取物的固定相用无水正己烷分散，按装柱方法装于柱床层的上部，在样品上部用少量脱脂棉固定；

用含5％乙酸乙酯的正己烷溶液作为洗脱液进行洗脱，洗脱液流量每分钟3-5ml。当色层距滤板约3cm时开始收集，每100ml收集一次。用含5％乙酸乙酯的正己烷洗脱色层至无色后，增加乙酸乙酯的比例至15％，继续洗脱，至鼠尾草酸的检测为阴性。对每批接收液，采用高效液相色谱法分析鼠尾草酸的最高含量为83％。

(5)将洗脱组分减压蒸馏至溶液变浑浊，添加少量脱气溶剂，冷藏至晶体析出，倾出溶剂，晶体经40℃真空干燥后，转入样品瓶，充高纯氮气保存，即得鼠尾草酸，晶体重0.5克，HPLC测定鼠尾草酸含量为85％。

实施例2

从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，包括以下步骤：

(1)在500ml圆底烧瓶内加入200ml无水乙醇和5ml的磷酸，制成磷酸-乙醇溶液，称取100克柱层析硅胶分散于磷酸-乙醇溶液中，抽真空15min，以去除硅胶颗粒间的空气，防止过柱过程中鼠尾草酸被氧化，再超声浸润20min，置于旋转蒸发仪内回收乙醇，于120℃烘干8小时得磷酸-硅胶固定相，备用；

(2)称取2克含60％鼠尾草酸的迷迭香叶提取物，溶于乙酸乙酯中，加入10克磷酸-硅胶固定相，充分搅拌，于旋转蒸发仪内回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香叶提取物的固定相；

(3)空柱管通以高纯氮气将其中空气排出，在通氮保护的条件下按下述步骤装柱：称取90克磷酸-硅胶固定相，加入500ml无水正己烷，超声浸润20min，再抽真空15min，得到磷酸-硅胶正己烷分散液，备用；将磷酸-硅胶正己烷分散液搅拌，使磷酸-硅胶固定相均匀悬浮在正己烷中(装柱过程均保持分散状态)，缓慢倒入层析柱管中，打开柱管旋塞，使溶剂均匀流下。在磷酸-硅胶固定相完全沉积前加入后续磷酸-硅胶正己烷分散液，保证柱床层致密均匀。磷酸-硅胶固定相形成理想床层后保证磷酸-硅胶固定相上部至少有1cm以上的正己烷，不使柱头变干，从而得到磷酸-硅胶层析柱；

(4)将吸附迷迭香叶提取物的固定相用无水正己烷分散，按装柱方法装于柱床层的上部，在样品上部用少量脱脂棉固定；

用含10％乙酸乙酯的正己烷溶液作为洗脱液进行洗脱，洗脱液流量每分钟3-5ml。当色层距滤板约3cm时开始收集，每100ml收集一次。用含10％乙酸乙酯的正己烷洗脱色层至无色后，增加乙酸乙酯的比例至12％，继续洗脱，至鼠尾草酸的检测为阴性。对每批接收液，采用高效液相色谱法分析鼠尾草酸的最高含量为89％。

(5)将洗脱组分减压蒸馏至溶液变浑浊，添加少量脱气溶剂，冷藏至晶体析出，倾出溶剂，晶体经80℃真空干燥后，转入样品瓶，充高纯氮气保存，即得鼠尾草酸，晶体重0.6克，HPLC测定鼠尾草酸含量为92％。

实施例3

从迷迭香叶提取物中分离鼠尾草酸的方法，包括以下步骤：

(1)在500ml圆底烧瓶内加入200ml无水乙醇和7.5ml的磷酸，制成磷酸-乙醇溶液，称取100克柱层析硅胶分散于磷酸-乙醇溶液中，抽真空15min，以去除硅胶颗粒间的空气，防止过柱过程中鼠尾草酸被氧化，再超声浸润20min，置于旋转蒸发仪内回收乙醇，于120℃烘干8小时得磷酸-硅胶固定相，备用；

(2)称取2克含60％鼠尾草酸的迷迭香叶提取物，溶于乙酸乙酯中，加入10克磷酸-硅胶固定相，充分搅拌，于旋转蒸发仪内回收乙酸乙酯，得到吸附迷迭香叶提取物的固定相；

(3)空柱管通以高纯氮气将其中空气排出，在通氮保护的条件下按下述步骤装柱：称取90克磷酸-硅胶固定相，加入500ml无水正己烷，超声浸润20min，再抽真空15min，得到磷酸-硅胶正己烷分散液，备用；将磷酸-硅胶正己烷分散液搅拌，使磷酸-硅胶固定相均匀悬浮在正己烷中(装柱过程均保持分散状态)，缓慢倒入层析柱管中，打开柱管旋塞，使溶剂均匀流下。在磷酸-硅胶固定相完全沉积前加入后续磷酸-硅胶正己烷分散液，保证柱床层致密均匀。磷酸-硅胶固定相形成理想床层后保证磷酸-硅胶固定相上部至少有1cm以上的正己烷，不使柱头变干，从而得到磷酸-硅胶层析柱；

(4)将吸附迷迭香叶提取物的固定相用无水正己烷分散，按装柱方法装于柱床层的上部，在样品上部用少量脱脂棉固定；

用含12％乙酸乙酯的正己烷溶液作为洗脱液进行洗脱，洗脱液流量每分钟3-5ml。当色层距滤板约3cm时开始收集，每100ml收集一次。用含12％乙酸乙酯的正己烷洗脱色层至无色后，增加乙酸乙酯的比例至15％，继续洗脱，至鼠尾草酸的检测为阴性。对每批接收液，采用高效液相色谱法分析鼠尾草酸的最高含量为86％。

(5)将洗脱组分减压蒸馏至溶液变浑浊，添加少量脱气溶剂，冷藏至晶体析出，倾出溶剂，晶体经80℃真空干燥后，转入样品瓶，充高纯氮气保存，即得鼠尾草酸，晶体重0.5克，HPLC测定鼠尾草酸含量为87％。