一种真核表达载体以及在制备抑制白血病细胞增殖药物中的应用

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，本发明的目的在于提供一种将LIFRα-CT3与TAT-PTD技术结合起来的真核表达载体以及在制备抑制白血病细胞增殖药物中的应用，本发明提供了一种真核表达载体，它含有如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列，本发明还提供了上述真核表达载体转染的CHO细胞系，本发明还涉及利用上述CHO细胞系生产的多肽190CT3具有很高的稳定性和穿膜性，可以显著改善临床早幼粒白血病治疗中全反式维甲酸+常规化疗带来的靶向性差，易抗药，药物入胞/入核难的问题。体外实验证实，190CT3多肽直接作用于急性粒系白血病细胞，可迅速穿透细胞膜和核膜，进而抑制其增殖，促进朝成熟粒细胞方向分化。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种真核表达载体，以及该真核表达载体在制备抑制白血病细胞增殖药物中的应用。

背景技术

白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)作为的IL-6细胞因子家族的一员，能够抑制白血病细胞，例如人HL-60、U937、小鼠M1系的增殖。然而，白血病细胞增长快速并对LIF感应能力差的特性，使得机体内有限的LIF无法有效抑制白血病细胞的生长[T.Maekawa，D.Metcalf，Clonalsuppression of HL60 and U937 cells by recombinant human leukemia inhibitoryfactor in combination with GM-CSF or G-CSF，Leukemia 3(1989)270-276；D.P.Gearing，N.M.Gough，J.A.King，D.J.Hilton，N.A.Nicola，R.J.Simpson，E.C.Nice，A.Kelso，D.Metcalf，Molecular cloning and expression of cDNA encoding amurine myeloid leukaemia inhibitory factor(LIF)，EMBO J 6(1987)3995-4002；T.Maekawa，D.Metcalf，D.P.Gearing，Enhanced suppression of human myeloidleukemic cell lines by combinations of IL-6，LIF，GM-CSF and G-CSF，Int JCancer 45(1990)353-358.]。而外源性、非生理剂量的LIF对脂肪细胞、生殖细胞和内分泌细胞等正常细胞具有显著的细胞毒性，同时干扰了细胞因子间的正常协调作用，所以LIF的药用价值也不能得到有效地体现[D.Metcalf，N.A.Nicola，D.P.Gearing，Effects of injected leukemia inhibitory factor onhematopoietic and other tissues in mice，Blood 76(1990)50-56.]。

LIF是一种多功能、作用广泛的细胞因子。它的广泛生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体(LIFR)来实现的。LIFR包括两个亚基，LIFRα(gp190)和LIFRβ(gp130)。其中，LIFRα含有1239个氨基酸，胞外区由789个氨基酸构成，跨膜区由26个疏水氨基酸组成，胞内去由238个氨基酸构成。LIFRα的胞内区共有三个功能域(Box1、Box2和Box3)，这一官能的主要作用结构为YXXQ(Y为酪氨酸，X为任意氨基酸，Q为谷氨酰胺)，是激活细胞内信号分子的必须序列，在LIF-LIFR的信号通路激活过程中，LIF首先与LIFRα结合，并使之与另一受体亚基β结合形成异源性二聚体，进而启动细胞内信号转导，引导胞外的信号转入核内，调控特定基因的表达，使细胞产生一系列的生理或病理变化[Y.Zhang，T.Willson，D.Metcalf，D.Cary，D.J.Hilton，R.Clark，N.A.Nicola，The box-1 region of the leukemia inhibitory factor receptoralpha-chain cytoplasmic domain is sufficient for hemopoietic cell proliferation anddifferentiation，J Biol Chem 273(1998)34370-34383.]。

申请人的前期工作中已证实，通过脂质体转染的方式，将LIFRα细胞内区全长序列(LIFRα-CT)和含Box3功能域的C末端序列(LIFRα-CT3)分别富集于人类急性早幼粒白血病细胞HL-60胞质中，可促进该系白血病细胞的粒细胞方向分化，并有效抑制其增殖潜力[H.Liu，J.Dan，S.Tang，S.Wu，Involving of the cytoplasmic region of leukemia inhibitory factor receptor alphasubunit，IL-6 related signal transducer-gp 130 or fas death domain for MAPKp42/44 activation in HL-60 cell with LIF or anti-Fas IgG，Mol Cell Biochem 217(2001)113-120；H.Liu，S.Liu，S.Tang，K.Ji，F.Wang，S.Hu，Molecular analysisof signaling events mediated by the cytoplasmic domain of leukemia inhibitoryfactor receptor alpha subunit，Mol Cell Biochem 258(2004)15-23；L.Yang，S.R.Liu，S.P.Tang，F.M.Wang，H.Q.Liu，[Effects of the box-3 region of theLIFRalpha-chain cytoplasmic domain(gp190CT3)on the proliferation anddifferentiation of HL-60 cells.]，Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi 25(2004)679-682.]，这与临床目前治疗急性早幼粒白血病经典方案，即全反式维甲酸+常规化疗药物的治疗原则是完全一致的。但脂质体转染的方式只能应用于体外实验，如何将LIFRα-CT3高效能地在病理性白血病细胞内乃至胞核内富集，仍需进一步探索。

蛋白质转导结构域(protein transduction domain，PTD)或称细胞穿膜肽(cellpenetrating peptides，CPPs)是一条以肽为载体的有效运输各种物质进入细胞及细胞核的系统[Y.Wang，H.Lin，S.Lin，J.Qu，J.Xiao，Y.Huang，Y.Xiao，X.Fu，Y.Yang，X.Li，Cell-penetrating peptide TAT-mediated delivery of acidic FGF toretina and protection against ischemia-reperfusion injury in rats，J Cell Mol Med(2009)；V.P.Torchilin，Cell penetrating peptide-modified pharmaceuticalnanocarriers for intracellular drug and gene delivery，Biopolymers 90(2008)604-610.]。通过不同途径，可经PTD携带入胞/核的物质有全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40nm磁珠和200nm脂质体等[L.N.Johnson，S.M.Cashman，R.Kumar-Singh，Cell-penetrating peptide for enhanced delivery ofnucleic acids and drugs to ocular tissues including retina and cornea，Mol Ther 16(2008)107-114；W.J.Ryves，A.J.Harwood，Use of a penetratin-linked peptide indictyostelium，Mol Biotechnol 33(2006)123-132.]。目前研究中最常用的PTD是人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)来源的TAT蛋白(TAT-PTD)片段，其全长翻译后仅为11个富含酸性氨基酸的寡肽，与其他PTD比较，TAT-PTD具有短小、高效、不影响下游分子生理功能的优良特性[L.Jiang，Y.Ma，J.Wang，X.Tao，D.Wei，The transduction of His-TAT-p53 fusion protein into the humanosteogenic sarcoma cell line(Saos-2)and its influence on cell cycle arrest andapoptosis，Mol Biol Rep 35(2008)1-8.]。

TAT可以有效地介导外源物质进入细胞。1998年，Nagahara等发现TAT-PTD与其他蛋白融合表达的蛋白质(TAT-蛋白质)能够高效地进入体外培养的细胞，并且表现出生物学功能，具有生物学活性[H.Nagahara，A.M.Vocero-Akbani，E.L.Snyder，A.Ho，D.G.Latham，N.A.Lissy，M.Becker-Hapak，S.A.Ezhevsky，S.F.Dowdy，Transduction of full-length TAT fusion proteins intomammalian cells：TAT-p27Kip1 induces cell migration，Nat Med 4(1998)1449-1452.]。近些时候，严世荣、李敬风等将TAT蛋白的PTD区段编码基因与外源蛋白基因连接表达融合蛋白，再将其转入小鼠体内，发现融合蛋白可以快速到达体内各组织，且表现出较强生物活性[严世荣，严洁，等，Tat-β-半乳糖苷酶对小鼠生物膜穿透性的研究，基础医学与临床22(2002)343-345；李敬风，严洁，方峰，陈宝芳，孙万群，严世荣，Tat融合蛋白在sd大鼠肾组织表达的研究，郧阳医学院学报22(2003)197-199.]。作为蛋白转导结构功能域，TAT-PTD全长仅含11个氨基酸(TAT-PTD_49-57：YGRKKRRQRRR)，却能将与之连接的近100％的融合物高效带入细胞膜和核膜。故其机制虽仍待进一步阐明，TAT-PTD依然得到了广大科研工作者的广泛应用。总体来说，TAT-PTD的生物学应用主要是通过融合蛋白的形式，利用细菌表达载体与靶基因、靶肽、靶氨基酸等连接来实现的。一般来说，TAT的融合蛋白也都含有某种蛋白“标签”，以利于进一步的纯化。纯化后的TAT融合蛋白可直接应用于体外培养的细胞体系内或实验动物体内。以上技术虽然实用、成熟、蛋白产量充足，但费时费力，经济性差[Barka T，Gresik ES，Henderson SC(2004)Production of celllines secreting tat fusion proteins.J Histochem Cytochem 52(4)：469-477]。且原核表达体系得到的融合蛋白缺乏转录后的剪切、翻译修饰，很大程度上存在无生物活性的可能性。

申请人已于2004年3月24日就含有gp190CT3基因的重组表达载体申请了中国专利，并获得授权，专利号为ZL200410017156.7，发明名称为：抑制白血病细胞增殖的重组表达载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种将LIFRα-CT3与TAT-PTD技术结合起来的真核表达载体以及在制备抑制白血病细胞增殖药物中的应用，该真核表达载体不仅能够得到高纯度融合蛋白LIFRα-CT3，而且表达的LIFRα-CT3能够高效地在病理性白血病细胞内乃至胞核内富集。

本发明是在申请人的中国专利ZL200410017156.7基础上，根据采用LIFRα-CT3能激活STAT3分子这一事实，将含有LIFRα的Box3基因的LIFRα-CT3与TAT-PTD紧密结合，构建成含有二者的重组真核表达载体；再通过设计相应引物，使用PCR的方法并插入相应的人体免疫球蛋白IgG重链来源的信号肽序列(N端)和cMyc蛋白纯化标签(C端)，本发明的pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc重组质粒及插入片段示意如图1所示。

本发明提供了一种真核表达载体，它含有以下序列-自N端至C端分别含有以下基因片段：人体免疫球蛋白IgG重链来源的信号肽增强子及序列、蛋白转导结构功能区HIV-1型病毒来源的TAT-PTD、gp190-CT3基因、cMyc蛋白纯化标签；具体序列如下：

GCCGCCACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGATATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAGGCGGTTATCAGCCTCAAGCAAAACCAGAAGAAGAACAAGAAAATGACCCTGTAGGAGGGGCAGGCTATAAGCCACAGATGCACCTCCCCATTAATTCTACTGTGGAAGATATAGCTGCAGAAGAGGACTTAGATAAAACTGCGGGTTACAGACCTCAGGCCAATGTAAATACATGGAATTTAGTGTCTCCAGACTCTCCTAGATCCATAGACAGCAACAGTGAGATTGTCTCATTTGGAAGTCCATGCTCCATTAATTCCCGACAATTTTTGATTCCTCCTAAAGATGAAGACTCTCCTAAATCTAATGGAGGAGGGTGGTCCTTTACAAACTTTTTTCAGAACAAACCAAACGATGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGTAG(如SEQ ID NO：1所示)；

上述真核表达载体是pcDNA3.0。

本发明还提供了上述真核表达载体转染入CHO细胞所得的细胞株CHO-190CT3。具体技术方案为：将以上重组载体转染入中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO细胞)后加G418筛选，挑取单克隆后大量扩增CHO细胞，得到含有融合蛋白细胞培养基上清。该上清经包被有抗cMyc凝胶的蛋白层析柱纯化，即可得到高纯度的190CT3(如图2所示)。

本发明还提供了上述细胞株CHO-190CT3所制备的蛋白190CT3。

本发明还提供了上述真核表达载体在制备抑制白血病细胞增殖药物中的应用。

本发明的技术方案主要包括以下几部分：

分别合成含有信号肽(ss)、cMyc标签(cMyc)，TAT-PTD(TAT)和LIFRα-CT3的相应引物；

经典分子生物学方法(参见《分子克隆实验指南》，美国冷泉港出版社)构建含有以上基因的重组真核质粒pcDNA3.0-190CT3；

转染pcDNA3.0-190CT3入CHO细胞并G418加压筛选，建立高表达pcDNA3.0-190CT3的真核表达细胞株。

收集CHO培养基上清，通过针对cMyc蛋白标签的特异性蛋白层析柱纯化得到融合蛋白190CT3。

本发明经体外实验发现，浓度30μg/ml时，190CT3针对人早幼粒白血病细胞HL-60具有高效穿膜性，可在30分钟内穿入透胞膜/核膜；进一步研究发现，190CT3可以替代LIF，启动信号转导，抑制早幼粒白血病细胞的生长，促进其朝粒细胞方向分化，且无明显毒副作用，因而可作为针对早幼粒白血病细胞的特异性蛋白治疗剂(如图3与图4的示)。

本发明公开了表达抑制急性粒细胞白血病(M1和M3)增殖的190CT多肽的真核表达载体以及CHO细胞系，其含有蛋白转导结构功能域(HIV1-TAT)及白血病抑制因子(LIF)受体α亚基胞内区含功能域Box-3的C-末端序列的基因。本发明得到的多肽190CT3具有很高的稳定性和穿膜性，可以显著改善临床早幼粒白血病治疗中全反式维甲酸+常规化疗带来的靶向性差，易抗药，药物入胞/入核难的问题。体外实验证实，190CT3多肽直接作用于急性粒系白血病细胞，可迅速穿透细胞膜和核膜，进而抑制其增殖，促进朝成熟粒细胞方向分化。

附图说明

图1：pcDNA3.0-190CT3重组质粒及插入片段示意图。

图2：转染了pcDNA3.0-190CT3分泌的上清经纯化、浓缩后，考马斯亮蓝染色和免疫印迹染色的结果(其中ss-CT3-cMyc是转染了pcDNA3.0-ss-CT3-cMyc的CHO细胞株所做对照)。

图3：不同时间点下，免疫荧光术检测浓度为30μg/ml的融合蛋白加入HL-60培养基后，入胞和入核的效率对照，

其中A：PBS阴性对照；B：ss-CT3-cMyc组；C：ss-TAT-CT3-cMyc组。图4：同一时间点(1h)，免疫荧光术标记不同浓度的融合蛋白190CT3加入HL-60培养基后，入胞/入核量与剂量的对应关系。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1：构建pcDNA3.0-190CT3真核表达载体

1.1所需试剂

限制性内切酶Sal I，Nhe I，Xho I和BamH I均购于上海英骏公司(Invitrogen，上海)。DNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒购于宝生物工程有限公司(Takara，大连)。真核表达载体pcDNA3.0购于美国Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA)。鼠抗人cMyc表位(标签)单克隆抗体购于Santa Cruz公司(Santa Cruz，CA，USA)；FITC标记的荧光山羊抗鼠二抗购于上海康成公司(康成，上海)。以下所有引物合成均由上海英骏(Invitrogen，上海)完成。

1.2真核载体pcDNA3.0-190CT3的构建准备

以真核表达载体pcDNA3.0-gp190CT3为模板(制备方法参见中国专利ZL200410017156.7)，采用标准PCR扩增流程(94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环)，和以下引物完成：

上游引物：

5’-CGCGCCGCCACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGACGCTATCAGCCT-3’(如SEQ ID NO：2所示)

下游引物：

5’-CCGCTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCATCGTTTGGTTTGTTC-3’(如SEQ ID NO：3所示)

其中上游引物含有BamH I，Nhe I，Sal I三个酶切位点(方框)和人IgG重链来源的信号肽序列(下划线)；下游引物含有Xho I酶切位点(方框内)和cMyc蛋白纯化标签全长(下划线)。以上PCR产物约含492个碱基对(bp)

(序列为：CGCGGATCCGCCGCCACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGAGCTAGCCGCGTCGACTATCAGCCTCAAGCAAAACCAGAAGAAGAACAAGAAAATGACCCTGTAGGAGGGGCAGGCTATAAGCCACAGATGCACCTCCCCATTAATTCTACTGTGGAAGATATAGCTGCAGAAGAGGACTTAGATAAAACTGCGGGTTACAGACCTCAGGCCAATGTAAATACATGGAATTTAGTGTCTCCAGACTCTCCTAGATCCATAGACAGCAACAGTGAGATTGTCTCATTTGGAAGTCCATGCTCCATTAATTCCCGACAATTTTTGATTCCTCCTAAAGATGAAGACTCTCCTAAATCTAATGGAGGAGGGTGGTCCTTTACAAACTTTTTTCAGAACAAACCAAACGATGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGTAGCTCGAGCGG)，经常规电泳，胶回收后，测序正确率为100％。

针对TAT-PTD的插入片段(Genbank Accession No.AAT48070；TATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA)，首先，由Invitrogen公司合成两条核苷酸链，序列分别为

上游：5’-CTAGCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAG-3’(如SEQ ID NO：4所示)；

下游：5’-TCGACTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCGTGCCATAG-3’(如SEQ ID NO：5所示)。

此两条核苷酸链含有互补的TAT-PTD序列(下划线)，并在两端分别设计有针对Nhe I和Sal I的粘性末端。经常规去火程序(等体积混合两核苷酸链，95℃2min后在45min内冷却至25℃)后直接放入4℃保存。

1.3真核载体pcDNA3.0-190CT3的构建

按常规流程，用BamH I和Xho I内切酶分别酶切以上PCR产物和载体pcDNA3.0，用胶回收试剂盒回收酶切后的DNA片段，然后以基因片段与载体片段摩尔比约3∶1进行连接反应。反应体系(10μl)包括：T4连接酶缓冲液1μl，载体片段50ng，基因片段20ng，T4连接酶1μl，余用去离子水补足。反应混合物置于16℃连接过夜，然后取全部连接产物置于100μl的DH5α感受态细菌中，0℃冰浴30min，43℃热休克90s，二次冰浴2min，加入LB培养基800μl，37℃培养1h，5000rpm离心5min，弃掉800μl上清，将菌体均匀涂布于50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养18h。从转化的平皿中挑去若干独立菌落接种于3ml含相应抗性的LB培养基中，37℃震摇12h后送上海英骏公司测序。经测序鉴定，获得pcDNA3.0-ss-CT3-cMyc重组质粒。对真核载体pcDNA3.0-190CT3，则用Nhe I和Sal I内切酶酶切以上载体pcDNA3.0-ss-CT3-cMyc，用胶回收试剂盒回收酶切后的DNA片段，然后将以上去火后的TAT-PTD插入片段片段与载体片段以摩尔比约3∶1进行连接反应。连接后转化、涂板、挑克隆、测序操作与前述相同。经最终测序鉴定，可得pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc(pcDNA3.0-190CT3)重组质粒。

实施例2：建立稳定的pcDNA3.0-190CT3重组CHO细胞株

首先确定筛选培养基中合适的G418(Invitrogen)浓度，方法如下：24孔细胞培养板接种每孔1000个CHO细胞，并加G418使其浓度分别为500、1000、2000、3000μg/ml，选择能在10～14天把细胞彻底杀死的孔作为G418的筛选浓度。

参照转染试剂Fugene 6操作说明书转染pcDNA3.0-190CT3至CHO细胞。转染后24小时，按1∶10比例进行细胞传代，用含有3000μg/ml G418的压力筛选培养液筛选培养细胞，10～14天后，用克隆环圈住具有新霉素抗性的细胞克隆集落，胰酶消化下后依次于96孔、24孔和6孔细胞培养板扩大培养。筛选出的不同细胞克隆按照0.5×10⁶个细胞接种于6孔板中生长至密度为90％左右时，胰酶消化下细胞后，使用RT-PCR方法检测相关基因的表达，所用引物如下：

上游：5’-GGAGACAGCGACGAA-3’；

下游：5’-TTGTAAAGGACCACCC-3’；

所用内参为Hirp3，引物序列如下：

上游：5’-CGTTATATTCGGGCTTGTGG-3’；

下游：5’-GGTCGACCTGAACTGCTGAT-3’。

选择表达水平最高的克隆扩增并按常规方法冻存细胞，命名为CHO-190CT3。

实施例3：融合蛋白190CT3的分离与纯化

将以上CHO-190CT3细胞株按照以下培养基成分，在75cm²培养瓶中进行扩大培养：90％RPMI 1640培养基，9％胎牛血清(FBS)，1％青链霉素，并在传代细胞贴壁后添加3000μg/ml G418新霉素。培养条件为37℃+5％CO₂。待细胞融合至70～80％时，将培养基更换15ml 100％RPMI 1640培养基。72小时后回收上清，10000rpm离心20min去除细胞碎片，将剩余上清马上置于-20℃保存。重复以上上清回收程序直至回收量达到1L。在使用蛋白层析柱纯化相关蛋白前，将上清置于4℃，使其缓慢融化，然后通过0.45μm滤器去除可能的杂质、死细胞及细胞碎片，准备上样至蛋白层析柱。

使用Sigma-Aldrich公司生产的针对cMyc蛋白标签的凝胶(ANTI-c-MycAGAROSE CONJUGATE，A7470，Sigma Aldrich，USA)包被蛋白层析柱。包被完成后严格按照说明书冰上操作。得到的溶于氨水的融合蛋白溶液使用1N醋酸进行中和，使其pH值维持在约7.0。然后，使用4℃离心机和3000MWCO超滤管(Millipore，上海)，3500rpm离心浓缩至约2ml，分装后-80℃冻存备用。

融合蛋白的浓度测定使用上海生工公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒进行。

转染了pcDNA3.0-190CT3及其对照质粒pcDNA3.0-ss-CT3-cMyc的CHO分泌的上清经纯化、浓缩后，考马斯亮蓝染色和免疫印迹染色的结果显示，与空白对照PBS相比，pcDNA3.0-ss-CT3-cMyc与pcDNA3.0-190CT3组均在18kDa左右出现了明显蛋白条带；从左至右，第1～第4泳道，考马斯亮蓝染色；第5～第7泳道，使用cMyc标签特异性抗体标记的免疫印迹实验。

实施例4：急性早幼粒白血病细胞HL-60实验(体外实验)

利用免疫荧光、细胞计数、流式细胞仪、免疫印迹等分子生物学实验方法，从形态学、相关蛋白表达量、融合蛋白入胞/入核情况及磷酸化水平等方面分析细胞形态变化；STAT3分子磷酸化、Jak2分子磷酸化水平及粒细胞表明标志物CD14和CD15来分析融合蛋白对HL-60细胞分化与增殖的影响。

具体方法如下：

1)细胞生长状态的比较

按照30μg/ml的终浓度将以上纯化后的融合蛋白加入标准HL-60细胞培养体系中，用倒置相差显微镜观察按照不同时间点(1～7天)排列的HL-60细胞及野生型HL-60细胞(每24小时补充添加融合蛋白一次)，7天内可见加入融合蛋白后的HL-60细胞组与野生型HL-60细胞相比，细胞密度偏小，将2组分别计数后绘制细胞生长曲线。结果显示：添加有融合蛋白190CT3的HL-60细胞组增殖明显趋缓。

2)细胞分化水平的比较

将以上实验组和对照组HL-60细胞在7天时，通过流式细胞仪检测粒细胞表面分化抗原CD14和CD11b的表达差异。使用BD公司提供的(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ，USA)流式细胞仪和CD14，CD11b抗体，严格按照说明书操作，结果使用FACSCalibur和CELLQuest 3.0版本的软件进行分析处理(Becton Dickson，San Jose，CA，USA)。结果显示，与野生型HL-60细胞比较，实验组HL-60细胞的CD14与CD11b均显著提高，证实融合蛋白190CT3可在短时间内促进急性早幼粒白血病细胞朝粒细胞方向分化。

3)免疫荧光检测融合蛋白190CT3的入胞/入核情况

制备以上实验组与对照组HL-60的细胞图片，方法记述于(J.P.Bach，H.Borta，W.Ackermann，F.Faust，O.Borchers，M.Schrader，The secretory granuleprotein syncollin localizes to HL-60 cells and neutrophils，J Histochem Cytochem54(2006)877-888.)一文中。用免疫荧光术检测LIFRα的表达情况。一抗为兔抗人LIFRα抗体(Santa Cruz，USA)；二抗为FITC标记的山羊抗兔IgG(北京中山生物技术有限公司)。结果：经融合蛋白190CT3刺激后的HL-60细胞与野生型HL-60(LIFRα阴性)相比，30分钟内即可在1.0×10⁵个早幼粒白血病HL-60细胞、胞核内均显示LIFRα强阳性，且此阳性结果在8h后仍可检测到(图3)。而在同一时间点(1h)上，免疫荧光术标记不同浓度的融合蛋白190CT3加入HL-60培养基后，入胞/入核量与剂量的对应关系如下：随着融合蛋白浓度的不断增加，进入HL-60细胞的蛋白量(以荧光强度示)在30μg/ml 190CT3时达到顶峰，与之相比，即使190CT3量增至50μg/ml时亦未见荧光强度明显增强(图4)。这说明融合蛋白190CT3可高效进入HL-60细胞，并参与细胞的代谢和细胞通路变化。

上述实验证实：本发明的重组融合蛋白表达载体pcDNA3.0-190CT3通过真核表达体系CHO细胞的高效表达，可分泌重组融合蛋白190CT3；该重组融合蛋白在经过cMyc蛋白层析柱纯化后能在短时间内高效率的进入白血病细胞，并最终导致其增殖受抑制，粒系分化程度增高。这说明190CT3融合蛋白可代替LIF启动STAT3信号通路，抑制白血病细胞的增殖并促进其向粒细胞方向分化。

因而，本发明重组表达载体可用于制备抑制白血病细胞增殖的靶向性蛋白药物。