猪圆环病毒Ⅱ型-猪肺炎支原体表达菌株的构建及应用

摘要

本发明涉及猪圆环病毒II型-猪肺炎支原体表达菌株的构建及应用，属于生物技术领域。本发明方法构建的表达猪圆环病毒II型-猪肺炎支原体主要抗原蛋白的原核表达工程菌株，该菌株能够同时表达猪肺炎支原体的主要抗原蛋白R1蛋白及猪圆环病毒的主要抗原蛋白CAP蛋白，纯化得到的重组蛋白能够刺激机体产生抵抗猪圆环病毒II型及猪肺炎支原体攻击的保护性免疫反应，能够有效的防止猪圆环病毒及猪肺炎支原体的感染。

说明书

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒II型-猪肺炎支原体表达菌株的构建及应用，属于生物技术领域。 

背景技术

猪圆环病毒II型(Porcine circovirus 2，PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)，包括猪皮炎与肾炎综合症(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道综合症(PRDC)等疾病；主要的临床特点为进行性消瘦，衰弱及呼吸困难和淋巴结肿大，有时可见腹泻，苍白，黄疸。该病的发病率及死亡率差异很大，急性暴发时死亡率可达15％以上；主要的病理变化为淋巴细胞缺失，淋巴样组织的组织细胞浸润、间质性肺炎、不同程度的肝炎及间质性肾炎。目前PCV2已经在全世界广泛流行，我国的PMWS抗体阳性率随猪的年龄的增长而上升。王忠田等和孙泉云等对国内规模化猪场的血清学调查表明，我国规模化猪场中已经广泛存在PCV2的感染，该病的发生会引起混合感染，给我国的养猪业造成很大的经济损失。 

目前国际上对该病的防控已经研发出几种疫苗可以使用，其中有PCV2灭活疫苗，PCV1-2嵌合疫苗，PCV2亚单位疫苗。但是灭活疫苗存在抗原含量低，生产成本高的缺陷。 

猪肺炎支原体可引起猪支原体肺炎，又称猪喘气病或猪地方性流行性肺炎，普遍存在于世界各地。患病猪的主要临床症状为咳嗽和气喘，体温基本正常，生长迟缓，饲料转化率低。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。几乎所有的肺炎支原体都极易继发感染。国内猪肺炎支原体的感染率已达70％，该病的控制目前有药物治疗及疫苗免疫，抗生素治疗有耐药性的问题，目前主要的防控措施是疫苗免疫，国际主要的疫苗为灭活疫苗，但是该疫苗的使用不能够完全的抵御肺炎支原体的再次感染，国内主要的疫苗为弱毒疫苗，该疫苗的免疫效果明显，但是主要的问题是该疫苗的生产成本高，并且免疫途径特殊，严重的制约着该疫苗的推广使用。 

发明内容

本发明提供猪圆环病毒II型(PCV2)-猪肺炎支原体(Mhp)表达菌株的构建方法，该方法构建的菌株为大肠杆菌表达宿主菌，其所表达重组蛋白免疫猪的效果明显，可以产生针对重组蛋白的抗体，能够有效的抵抗猪圆环病毒及猪肺炎支原体的攻击，该菌株还可用来生产猪圆环病毒II型-猪肺炎支原体的防治疫苗，该疫苗免疫安全性好，免疫效果明显。 

本发明的目的是通过如下技术方案实现的： 

本发明提供猪圆环病毒II型(PCV2)-猪肺炎支原体(Mhp)表达菌株的构建方法，其特征在于步骤如下： 

(1)PCV2CAP基因和Mhp R1基因的扩增及克隆 

分别以PCV2和Mhp毒株提取的DNA为模板，用特异性引物，PCR扩增，得到PCV2的CAP蛋白的核酸片段及猪肺炎支原体的主要抗原决定区R1的核酸片段，其大小分别为718bp和246bp，然后将得到的克隆片段CAP及R1分别克隆到克隆载体pMD-18-T上，得到克隆载体pMD-18-T-CAP和pMD-18-T-R1； 

(2)含有PCV2CAP基因和Mhp R1基因的原核表达载体的构建 

通过限制性内切酶将克隆片段CAP及R1分别连接到原核表达载体pET-28a(+)中，得到原核表达质粒pET-28a(+)-R1-CAP； 

(3)含有原核表达质粒pET-28a(+)-R1-CAP的表达菌株的获得 

通过转化的方法将原核表达质粒pET-28a(+)-R1-CAP通过热击转化方法转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，然后通过卡那霉素抗性筛选的方法得到阳性克隆菌株，后小量提取质粒进行双酶切鉴定，最后进行测序鉴定，得到阳性原核表达菌株。 

其中，PCR扩增中用的PCV2和Mhp1的特异性引物，其序列分别如下： 

CAP-P1：5‘AAGCTTGCATGACGTATCCAAGGAG’3 

CAP-P2：5‘GTGCGGCCGCAGGGTTAAGTGGGGG’3 

R1-P1：5‘GCGGATCCGCAGCAAAACCAGAAGC’3 

R1-P2：5‘GCAAGCTTGAGCAACTGGTTTTGCT’3。 

本发明还提供了该猪圆环病毒II型(PCV2)-猪肺炎支原体(Mhp)表达菌株 的构建方法所得到的表达菌株。 

本发明的猪圆环病毒II型(PCV2)-猪肺炎支原体(Mhp)表达菌株的构建方法所得到的表达菌株可以用于制备疫苗，在疫苗的制备过程中，利用表达菌株所表达的重组蛋白作为抗原，抗原与油佐剂的比例为1∶1～1∶5；其中，油佐剂包含90-98wt％的白油、2-10wt％的司本-80；将重量百分比为90-98％白油与2-10％司本-80混合，100毫升混合液中加入1-2克硬脂酸铝即得本发明的油佐剂。 

本发明疫苗的制备，其步骤如下： 

(1)生产用抗原的制备 

大量培养表达菌株，得到抗原蛋白，作为生产用抗原； 

(2)生产用抗原的乳化 

按比例加入油佐剂，乳化配制成疫苗。 

其中，本发明所用的猪圆环病毒II型(PCV2)毒株可为当前中国国内公开的任何一株PCV2毒株，其基因序列已在Genebank中公开，也可参见本说明书的序列表部分，含有ORF1和ORF2编码区，不同的猪圆环病毒II型毒株基因序列会有一些差异，但都可以扩增得到CAP基因。本发明中的猪肺炎支原体(Mhp)株，可为当前中国公开的任何一流行株，其基因序列已在Genebank中公开，也可参见本说明书的序列表部分，不同的猪肺炎支原体株基因序列会有一些差异，但都可以扩增得到R1基因。 

本发明首次将猪圆环病毒II型及猪肺炎支原体的主要抗原蛋白构建在原核表达载体pET-28a(+)上，得到一个重组表达菌株，该菌株可突破PCV2常规疫苗的局限性及Mhp常规灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性。用该菌株表达的重组蛋白制备疫苗，成本低，具有更好的免疫安全性，并且免疫效果显著。该基因工程菌的表达量高，后期可以采用生物发酵罐进行生产，可以大大的降低生产成本，并且达到了一针防两病的目的，比目前常规疫苗具有更多的优势，会节约人力、物力和财力。 

附图说明

图1扩增的CAP片段电泳图 

图2扩增的R1片段电泳图 

图3构建的原核表达载体pET-28a(+)-R1-CAP的质粒电泳图 

图4双酶切原核表达载体pET-28a(+)-R1-CAP的电泳图 

图5克隆质粒pMD-18-T-CAP的构建图谱 

图6克隆质粒pMD-18-T-R1的构建图谱 

图7原核表达质粒pET-28a(+)-R1-CAP的构建图谱 

具体实施方式

实施例1猪圆环病毒II型-猪肺炎支原体原核表达菌株的构建 

(1)PCV2CAP基因和Mhp R1基因的扩增及克隆 

A、引物的设计 

根据Genebank中PCV2的全基因组序列设计表达CAP蛋白的ORF2基因序列的引物，并且根据所选择的原核表达载体pET-28a(+)的酶切位点在所设计的引物中加入酶切位点，其引物序列具体如下 

CAP-P1：5‘CAAGCTTGCATGACGTATCCAAGGA’3 

CAP-P2：5‘GTGCGGCCGCTTAAGGGTTAAGTGG’3 

根据Genebank中Mhp的全基因组序列设计重复序列区R1的基因序列的引物，并且根据所选择的原核表达载体pET-28a(+)的酶切位点在所设计的引物中加入酶切位点，其引物序列具体如下 

R1-P1：5‘GCGGATCCGCAGCAAAACCAGAAGC’3 

R1-P2：5‘GCAAGCTTGAGCAACTGGTTTTGCT’3 

B、目的片段的克隆 

通过PCR的方法，分别以PCV2和Mhp所提取的DNA为模板，扩增目的片段CAP及R1。PCR的反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。 

反应结束后，制备1％的TAE琼脂糖凝胶，将PCR产物与10μl6×上样缓冲液均匀混合后加样，100V电压电泳30分钟左右，然后将凝胶放在紫外灯下观察，并在凝胶成像系统中成像并分析，在紫外灯下，切下目的片段的胶块，放于一个eppendorf管内。然后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收。分别得到克隆片段CAP和R1。 

C、克隆质粒pMD18T-CAP和pMD18T-R1的构建 

通过TA连接的方法将克隆片段CAP和R1分别连接到pMD18T克隆载体上。具体的步骤：回收产物加A。加A反应体系：回收PCR产物30μL，dATP1μL，10xbuffer3.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL。将所有的物质混匀后放于PCR反应仪中72℃作用15min。然后进行凝胶电泳，对产物进行回收。然后连接构建T载体克隆质粒，反应体系为：加A后回收的产物4.5μL，pMD-18T载体0.5μL，Solution I 5μL，Total 10μL。然后轻轻混匀后，于16℃连接过夜。然后通过抗性筛选得到阳性质粒即为所构建成功的克隆质粒pMD18T-CAP和pMD18T-R1。 

(2)含有PCV2CAP基因和Mhp R1基因的原核表达载体的构建 

原核表达载体pET-28a(+)双酶切，根据扩增片段R1所选择的酶切位点HindIII和BamH I对表达载体进行双酶切，然后将目的片段R1同样进行HindIII和BamH I双酶切，然后进行连接反应，将目的片段插入到表达载体上得到pET-28a(+)-R1质粒。同理根据扩增片段CAP所选择的酶切位点HindIII和Nco I对pET-28a(+)-R1质粒进行双酶切，然后将目的片段CAP同样进行HindIII和Nco I双酶切，同理进行连接反应。得到pET-28a(+)-R1-CAP原核表达质粒。通过卡那霉素抗性筛选得到阳性质粒。 

(3)含有原核表达质粒pET-28a(+)-R1-CAP的表达菌株的获得 

将构建得到的阳性表达质粒pET-28a(+)-R1-CAP转化到表达宿主菌BL21(DE3)中，构建得到原核表达菌株。 

实施例2猪圆环病毒II型-猪肺炎支原体原核表达菌株表达产物的诱导及大量生产 

(1)原核表达菌株的诱导表达 

将筛选出的阳性菌进行诱导筛选。方法：a将保存的菌液按1∶1000的比例接种加有Kan抗性的5mL2xYT培养基，37℃过夜培养14h。其中要接种一管空质粒菌作为对照。b次日将过夜培养的新鲜菌以1∶1000的比例接种到加有Kan抗性的5mL2xYT培养基中，每个菌接种两管其中一个用于诱导，一个用于非诱导对照，于37℃培养3h。使OD_600nm值达到0.4～0.5。c然后其中一管加入诱导剂IPTG使终浓度为1mmol/l，于37℃培养5h。d每个菌取1.5mL到eppendorf管中，12000rpm离心，弃去上清得到沉淀，然后每管中加入100μL的PBS洗 涤一次，最后加入300μLPBS和100μL4x蛋白上样buffer，充分混匀，冰上作用15min，100℃煮沸3～5min。e煮沸后于12000rpm离心10min。f取离心后的上清液进行SDS-PAGE，诱导和非诱导样一组，检测每个菌的诱导能力。比较表达的目的蛋白的大小及表达的蛋白条带的宽度来判断每个菌的表达能力。g每个蛋白挑选表达能力高的两个菌。准备用于大量的蛋白的表达。 

(2)表达产物的鉴定 

按照常规的SDS-Page方法对表达产物进行鉴定。 

(3)表达产物的纯化 

用Ni-NTA His.Bind Resin纯化柱纯化融合蛋白。方法：将1mL50％的Ni-NTA His.Bind Resin填充材料于4mL1xNi-NTA Bind Buffer轻轻混匀。在重力作用下使树脂堆积，然后用枪头除去4mL的上清液。然后加入4mL的溶解物(表达的上清液)与填料混匀，在4℃摇床上混匀作用1h。然后将填料加到层析柱中，填料沉积下来后，打开柱子底下的帽，打开蛋白纯化仪进行纯化，收集流出的液体，留作SDS-PAGE。然后用2x4mL1xNi-NTAwash buffer洗柱子，收集洗出的液体，留作SDS-PAGE，接着用4x0.5mL1xNi-NTA Elution Buffer洗脱下来蛋白，收集洗脱液，留作SDS-PAGE。 

(4)表达产物的大量表达及表达产物的定量 

根据上述步骤大量诱导表达目的蛋白，同样对表达产物进行纯化，最后用NanoDrop ND-1000spectrophotometer蛋白定量仪器对表达产物进行蛋白含量的定量，得到2000mg/L的蛋白。 

实施例3猪圆环病毒II型-猪肺炎支原体原核表达菌株表达产物的疫苗制备 

(1)生产用抗原的制备 

按照实施例2制备的蛋白作为生产疫苗用的抗原。 

(2)抗原的乳化 

将生产用的抗原按照1∶1的比例(抗原∶油佐剂)加入油佐剂，乳化得到实验用疫苗。 

所用的油佐剂配制为90wt％白油和10wt％司本-80组成的油佐剂混合液中加入硬脂酸铝，其中硬脂酸铝加入量为1克/100毫升油佐剂混合液。本实施例共制备了1批猪圆环病毒II型-猪肺炎支原体疫苗，制备的疫苗物理性状检验、 安全检验、效力检验等均合格。 

所制备疫苗的质量标准： 

①性状 

外观  乳白色乳剂。 

剂型  为油包水型。取一个清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。 

稳定性  取疫苗10mL加入离心管中，以3000rpm离心15min，应不分层，管底析出的水相应不大于0.5mL。 

粘度  用1mL吸管(下口的内径1.2mm，上口内径2.7mm)吸取25℃左右的疫苗1mL，令其垂直自然流出，记录流出0.4mL所需的时间，应在8秒以内。 

②无菌检验  按《中国兽药典》进行，应无菌生长。 

③安全检验 

选取3-4周龄PCV2和Mhp抗原抗体阴性的健康仔猪10头，分为2组，每组各5头，分别进行一次超剂量(4mL)和单剂量重复(1mL×2)接种的安全性试验，同时设不进行接种的猪10头作为空白对照，同样条件下饲养。每次接种后观察14日。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。 

④效力检验 

选取3-4周龄PCV2和Mhp抗原抗体阴性的健康仔猪10头，其中5头耳后根肌肉注射疫苗1m1，免疫后15天，所有猪肌肉注射PCV2和Mhp菌毒培养液(PCV2病毒含量为10^5.0TCID₅₀/mL，Mhp菌株滴度为10^8.0CCU/mL)3mL，其中对照猪分别肌肉注射PCV2强毒(5头)和Mhp强毒(5头)，每天测温观察并隔周采集血清进行血清学检测，攻毒后21天迫杀解剖。攻击PCV2强毒的对照猪(≥3/5)在攻毒后应出现明显的PCV2病毒血症和一过性的体温升高，且攻毒后21天迫杀解剖可见多种淋巴组织出现不同程度的肿大和充血，肺出现不同程度的水肿和肉变，肾发黄表面有坏死灶等。免疫猪(≥4/5)免疫后15天PCV2ELISA抗体滴度应≥1∶1000，攻毒后应无明显临床症状、PCV2病毒血症及病理变化。攻击Mhp强毒的对照猪(≥3/5)在攻击强毒后应该出现明显的Mhp临床症状，并且于21日迫杀解剖可见肺部出现明显的肉样病变。免疫猪(≥4/5)免疫后15天的MhpELISA抗体滴度应≥1∶1000，攻毒后应无明显临床 症状及病理变化。 

表1  本发明疫苗免疫后PCV2和Mhp ELISA抗体检测结果