蛭弧菌游泳体菌液在斑节对虾养殖中的应用

摘要

本发明特别涉及蛭弧菌游泳体在斑节对虾等海产品养殖中的应用，其通过在水体和饲料中添加蛭弧菌游泳体实现。具体包括养殖池塘条件，放养前的准备工作，虾苗选择和放养，投饲管理和养殖期的水环境管理。关键技术是在水体中添加蛭弧菌游泳体菌液，使水体中蛭弧菌游泳体浓度为10

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌的应用，特别涉及蛭弧菌游泳体菌液在斑节对虾等海产品养殖中的应用。 

背景技术

斑节对虾(Penaeus monodon)俗称鬼虾、草虾、花虾、竹节虾、斑节虾、牛形对虾，联合国粮农组织通称大虎虾。是对虾中个体最大的一种，成熟个体一般体长22cm-32cm，体重137g-211g，为当今世界上虾类养殖最普遍的品种之一。 

近年来，由于养殖者为了追求高产量，对虾的放养密度过大。在养殖过程中因过量投饵和对虾排泄物引起底质极端恶化，水质发生突变，极易引起虾体的免疫力下降，从而引发虾病的发生。 

传统方法具有低成本的优点的同时，缺点也比比皆是。中草药对斑节对虾生长性能具有无药物残留、经济效益高的优点，但有见效慢的缺点。抗生素对抑制病原微生物的繁殖，减少其代谢毒素对虾的毒害作用等方面起到了积极的作用，但是长期使用抗生素，特别是滥用抗生素，其种种弊端也逐渐显露出来。如破坏虾塘中自然生态平衡，对虾的机体免疫力产生不良影响，产生耐药性和药物残留等副作用，给养殖业和作为消费者的人类的健康都带来了潜在的危害。因此，开发一种简便易行、安全、优质的无公害健康的斑节对虾养殖新技术已经成为当今社会的共识。 

蛭弧菌是寄生于其他细菌，并能导致宿主细菌裂解的一类细菌；比一般细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用；革兰氏染色呈阴性，可以裂解包括副溶血弧菌、溶藻弧菌等引发对虾病害的潜在致病菌。 

蛭弧菌游泳体是指蛭弧菌侵入宿主细菌前的生长形式。蛭弧菌游泳体侵入宿主细菌的过程非常快，一般几秒钟内即可完成。与蛭质体相比，游泳体具有起效快、活力强的优点。这些特性使得蛭弧菌游泳体同样适合作为一种微生物制剂。笔者通过实验，证明了蛭弧菌游泳体在成虾养殖过程中能够显著地提高虾的存活率以及促进虾生长。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的弊端，提供蛭弧菌游泳体菌液在斑节对虾养殖中的应用方法。其特征按照养殖生态学原理，海洋生物的生长环境要求，生物之间的相互关系及无公害养殖标准，人工营造良好的养殖环境，减少投入成本，提高斑节对虾免疫力，促进其快速生长，提高经济效益。 

本发明的目的通过下述方案实现： 

蛭弧菌游泳体菌液在斑节对虾养殖中的应用。 

所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 209172。 

所述蛭弧菌游泳体菌液在斑节对虾养殖中的应用是将饲料在蛭弧菌游泳体菌液中浸泡15-45min。 

所述蛭弧菌游泳体菌液在斑节对虾养殖中的应用是在水体中添加蛭弧菌游泳体菌液，使水体中蛭弧菌游泳体浓度为10¹～10⁷pfu/mL。 

所述蛭弧菌游泳体菌液的制备方法为： 

接种宿主于营养肉汤液体培养基中，在35℃和200rpm摇床培养12h，培养液经4℃，5000～8000rpm离心10～20min后，沉淀加入至DNB液体培养基中，接入蛭弧菌BDFM05，在温度25～35℃下，以150～300rpm摇床培养36～48h，得到含蛭弧菌蛭质体和蛭弧菌游泳体的培养液，培养液在4℃温度下以6000～8000rpm离心15～20min后，上清经16000～18000rpm离心15～20min后，沉淀用DNB液体培养基、水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为10¹¹～10¹²pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌液。 

本发明的优点及效果：发展无公害养殖，提高斑节对虾的免疫力，促进斑节对虾的快速生长，降低生产成本，提高经济效益，是我国海水养殖业发展的必由之路。蛭弧菌能改善养殖生物肠道环境，提高免疫力，促进生长。对虾类无毒性作用，对人类无致病性。蛭弧菌游泳体侵入宿主细菌的过程非常快，一般几秒钟内即可完成。相对于蛭弧菌蛭质体而言，虽然存在着制备繁琐、不易保存的弱点，但蛭弧菌游泳体控制和消除弧菌及其它致病菌起效快、活力强的优点，使得它同样适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子。 

由于蛭弧菌对水产养殖生物的致病或潜在致病菌，特别是弧菌有强的裂解力，对水质也有一定的净化作用，用蛭弧菌游泳体浸泡饲料，并在池水中泼洒一定浓度的蛭弧菌游泳体菌液，既能促进斑节对虾的生长，提高免疫力，又能净化水质，最长可达到30天不换水。从而克服了抗生素滥用带来的副作用和养殖废水污染环境，为人类提供安全、绿色、无公害的水产品，提高养殖户的收入。 

具体实施方式

下面结合实施例及表格对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 

实施例1蛭弧菌游泳体菌液的制备 

所述的蛭弧菌游泳体菌液通过以下方法制备：接种1mL浓度为10⁷cfu/mL嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172)于1L营养肉汤液体培养基中，28℃培养20h，培养液经6000rpm离心15min后，沉淀加入至1L DNB液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000mL蒸馏 水中，pH值为7.6)中，接入1mL浓度为10³pfu/mL蛭弧菌BDFM05，28℃培养48h，培养液经6000rpm离心15min后，将上清液经16000rpm离心15min后，沉淀用100mL DNB液体培养基悬浮，得到蛭弧菌游泳体菌液，蛭弧菌BDFM05游泳体菌液的浓度为10⁹pfu/mL。 

实施例2蛭弧菌游泳体菌液在斑节对虾普通养殖中的应用实验 

本发明的具体实施地点为华南地区某养殖场，实施时间为3个月。 

(1)养殖池塘条件，养殖池底面积为10亩，池深2m，池底为泥沙质，池底平整，养殖池配备水泵、增氧机，并配备泵站闸门和较完备的进排水系统； 

(2)放养前的准备，试验地海域的水源水质符合中华人民共和国国家标准渔业水质标准(GB11607-89)要求，海水经过砂滤、沉淀处理后进入养殖池，符合农业部《无公害食品海水养殖用水水质》(NY5052-2001)要求。放苗前10天，用80目的袖状网过滤后进水，同时施氮、磷、钾复合肥培养饵料生物，使池水透明度达到40cm，养殖池水盐度10‰； 

(3)虾苗选择与放养，虾苗选择个体大小整齐，体长1.1-1.3cm的黑壳虾苗，群体发育整齐，肌肉饱满透明，附肢中色素正常，胃肠充满食物，虾苗活动活泼，对水流刺激反应灵敏，无外部寄生物及附着污物，放苗时水温20℃，3月20日放苗。养成池水色为黄绿色、透明度30cm，pH在8.5，投放密度为5万只/亩。虾苗运至养殖池边，用充氧气头向苗袋内充氧半小时，同时逐步加入养殖池水，使逐步缩小温差和醒苗； 

(4)投饲管理，配合饲料1号(购买于广东恒兴集团有限公司，下同)为常规的对虾养殖饲料，符合中华人民共和国农业行业标准《无公害食品渔用配合饲料安全限量》(NY5072-2002)的规定。每次投饵前，将饲料用蛭弧菌游泳体菌液浸泡30min，菌液中的蛭弧菌游泳体的浓度达到10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL，养殖前期和中期，虾体长平均6cm以下时，日投2次，日投放量控制在虾重的15％；养殖后期，平均体长达到6cm时，日投5次，日投放量控制在虾重的8％； 

(5)养殖期的水环境管理，养殖期间正常曝气，使水中溶解氧达到5mg/L。采取不同换水周期，5、10、15、20、25、30天换水一次，每次换掉25cm深的水(量)，透明度保持在30cm，每次换水后加蛭弧菌游泳体菌液，使水体中的菌体浓度达到10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL，加菌方法为：用相应的池水稀释菌液后，均匀泼洒全池，使菌液混合均匀。 

实验分组 

采用随机区组试验设计，平均分为A-D 4个试验组，B、C、D、每个试验组有6个小组，分别为B1、C1、D1；B2、C2、D2；B3、C3、D3、；B4、C4、D4；B5、C5、D5；B6、C6、D6；B1-D6每小组再分为4组，即B1-1-B1-4...D6-1-D6-4，每组2个重复。对4组试验对虾初始体重进行方差整齐性检验，组间差异不显著(P＞0.05)。四组试验组的处理如下： 

A组：工厂生产的养殖方式，池塘水透明度低于20cm时进行换水， 每次换水换掉50cm深的水(量)，维持池水透明度在35cm，投放颗粒配合饲料1号 

B组：在水中泼洒蛭弧菌游泳体菌液，使水体中游泳体菌体浓度分别达到10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL，投放颗粒配合饲料1号 

C组：投喂浓度为10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌体浸泡后的配合饲料1号 

D组：在水中加入蛭弧菌游泳体菌液，使菌体浓度分别达到10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL，同时分别投喂浓度为10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌液浸泡后的配合饲料1号； 

B1、C1、D1组每5天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B2、C2、D2组每10天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B3、C3、D3组每15天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B4、C4、D4组每20天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B5、C5、D5组每25天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B6、C6、D6组每30天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B1-1、C1-1、D1-1...D6-1换水后加入蛭弧菌游泳体使水体中菌体浓度为10¹pfu/mL 

B1-2、C1-2、D1-2...D6-2换水后加入蛭弧菌游泳体使水体中菌体浓度为10³pfu/mL 

B1-3、C1-3、D1-3...D6-3换水后加入蛭弧菌游泳体使水体中菌体浓度为10⁵pfu/mL 

B1-4、C1-4、D1-4...D6-4换水后加入蛭弧菌游泳体使水体中菌体浓度为10⁷pfu/mL 

斑节对虾实验效果检测 

(1)生长指标的测定 

每组随机抽取50尾对虾检测生长情况，对虾长度测定采用精度为0.1mm的游标卡尺度量，体重采用电子天平称量。试验生长指标按如下公式计算： 

成活率(％)＝N_t/N_o×100％； 

增重率(％)＝(W_t-W_o)/W_o×100％； 

体长增长率(％)＝(L_t-L_o)/L_o×100％； 

式中N_o为试验开始时斑节对虾总尾数；N_t为试验结束时斑节对虾总尾数；W_o为试验开始时斑节对虾体重；W_t为试验结束时斑节对虾体重；L_o为试验开始时斑节对虾体长；L_t为试验结束时斑节对虾体长； 

试验测得的斑节对虾各项生长指标见表一-表四：与A组相比，B、C、D组的成活率、增重率、体长增长率均有明显提高，B、C、D组成活率的增加值分别≥25.38％、26.28％、28.55％；增重率的增加值分别≥40.54％、65.62％、86.3％；体长增长率增加值分别≥1.89％、2.97％、2.99％。 

从表一-表四可以看出，在对虾养殖过程中，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌游泳体的浓度升高，成活率、增重率、体长增长率都明显升高，且都明显高于工厂生产对照A组，说明采用新型的添加蛭弧菌游泳体的方法，能明显提高斑节对虾的成活率、增重率、体长增长率，这在实际生产过程中，不仅大大节约了用水量，而且节省了大量的人力，物力资源，节约了养殖成本；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组对虾成活率、增重率、体长增长率没有显著的变化。说明新型养殖方法下，5-30天不换水蛭弧菌游泳体均可促进对虾的生长。就B、C、D三组不同处理方式而言，均提高对虾的养殖成活率、增重率和体长增长率，但同时在水体与饲料中添加蛭弧菌游泳体菌液效果最佳。 

因此，无论在水中添加蛭弧菌游泳体菌液，使水体蛭弧菌游泳体菌体浓度为10¹-10⁷pfu/mL，或者饲料用浓度为10¹-10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳质体菌液浸泡，或是两者兼用，虽长达30天不换水，均可促进斑节对虾的快速生长，并且同时在水中与饲料中添加菌液的效果最好。 

表一斑节对虾生长指标的检测 

表二斑节对虾生长指标的检测 

表三斑节对虾生长指标的检测 

表四斑节对虾生长指标的检测 

(2)、免疫指标的检测 

用1mL的无菌注射器自对虾心脏抽取血液，每组抽取50尾对虾血液合并置于无菌离心管中4℃静置过夜后，3000r/min离心10min，取上层血清置于-80℃超低温冰箱保存待测。 

1、溶菌酶活力测定血清溶菌酶活性通过浊度比色法测定(Ellis A E.Lysozyme assays.[M]//Stolen J S，Fletcher T C，Anderson D P，et al.Techniques in Fish Immunology I.USA：SOS Publications，1990：101-103.)实验条件下，每mL血清每min吸光值减少0.001为1个酶活性单位(U)。 

2、酚氧化酶(PO)活力的测定 

酚氧化酶活性测定采用Hernández-López等(Hernández-López J，Gollas-Galvan T.Vargas-Albores F.Activation of the prophenoloxidase systemof the brown Penaeus californiensis Holmes[J].Comp Biochem Physiol，1996.113C：61-66.)的方法。以实验条件下，每mL血清每min吸光增加0.001，定义为1个酶活性单位(U)。 

3、超氧化物歧化酶(SOD)活力 

超氧化物歧化酶(SOD)活力测定采用YI Sun等(A Simple Method forClinical Assay of Superoxide Dismutase[J].Clin.Chem.1988：497-500)的方法。一个酶活力单位定义为：在试验条件下，硝基四氮唑溶液(NBT)被SOD抑制50％所需的酶蛋白量。 

斑节对虾各项免疫指标的测定结果见表五～表八： 

从表中可以看出，与A组相比，B、C、D组的溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力均有明显提高。B、C、D组溶菌酶活力增加值分别≥8.09U/mL、9.18U/mL、9.8U/mL；超氧化物歧化酶活力增加值分别≥53.58U/mL、79.98U/mL、97.48U/mL；酚氧化酶活力增加值分别≥10.1U/mL、10.8U/mL、11U/mL。 

从表五～表八可以看出，在斑节对虾养殖过程中，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌游泳体的浓度升高，成活率都明显升高，且都明显高于工厂生产对照A组，说明采用新型的添加蛭弧菌游泳体的方法，能明显提高斑节对的免疫力，增强酶的活力，这在实际生产过程中，不仅节约了养殖成本，而且增强对虾的免疫能力，促进生长；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组对虾酶活力没有显著差异，说明新型对虾养殖方法下，5-30天不换水蛭弧菌游泳体都能提高对虾免疫力。就B、C、D三组不同处理方式而言，均可提高免疫力，但同时在水体与饲料中添加蛭弧菌游泳体菌液效果最佳。 

因此，无论在水中添加蛭弧菌游泳体菌液，使水体蛭弧菌游泳体菌体浓度为10¹-10⁷pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为10¹-10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，均可提高斑节对虾的溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力等免疫指标，在水体中和饲料中同时添加，效果更佳。5-30天之间换水，对溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力均无明显影响。 

表五免疫指标的测定结果 

表六免疫指标的测定结果 

表七免疫指标的测定结果 

表八免疫指标的测定结果 

(3)、水质检测 

1、氨态氮用次溴酸纳氧化法测定(GB12763.4-91)； 

2、亚硝酸盐氮用重氮-偶氮光度法测定(GB12763.4-91) 

3、H₂S用对二甲氨基苯胺分光光度法测定(GB16489-1996) 

经过测定，A组水池中的各项水质测定值均高于试验组B、C、D的。其中，A组氨态氮的检测结果为0.506mg/L，高于B组的0.431-0.456mg/L，C组的0.467-0.492mg/L，D组的0.403-0.441mg/L；A组亚硝酸盐氮检测结果为0.015mg/L，高于B组的0.008-0.009mg/L，C组的0.011-0.013mg/L，D组的0.007-0.008mg/L；A组H₂S检测结果为0.2mg/L，高于B组的0.056-0.137mg/L，C组的0.114-0.179mg/L，D组的0.024-0.106mg/L；由以上结果分析可知，应用浓度为10¹-10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳体可有效改善养殖水体环境，控制水中氨态氮、亚硝酸盐氮、H₂S的浓度，从而提供有利于斑节对虾生存的水体环境，并且同时在水体和饲料中添加蛭弧菌游泳体的效果最佳。 

(4)、细菌数检测： 

1、菌落总数用营养琼脂培养基检测(GB4789.2-2010) 

2、弧菌总数用TCBS培养基检测(SN/T 0173-2010) 

3、pH用PHB-3便携式pH计测定 

工厂生产A组的总细菌数和总弧菌数分别高达4.51×10³cfu/mL和6.13×10²cfu/mL。B、C、D组的总细菌数分别为5.34×10²cfu/mL、4.96×10²cfu/mL、4.21×10²cfu/mL；总弧菌数8.5×10cfu/mL、7.6×10cfu/mL、6.1×10cfu/mL，与B组比明显都降低了1个数量级。说明蛭弧菌游泳体能有效控制水体的细菌数，改善水质。综合来看，添加蛭弧菌游泳体，能明显提高对虾的体质，增强斑节对虾的免疫力，而且能够改善水质，达到节水节能、提高成活率的良好效果。 

同时，由实验数据可知无论在水中添加蛭弧菌游泳体菌液，使水体蛭弧菌游泳体菌体浓度为10¹-10⁷pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为10¹-10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，但也可促进对虾养殖成活，增强免疫力，提高养殖期抗病能力，并且在水体和饲料中同时添加蛭弧菌游泳体菌液效果最佳。 

实施例3蛭弧菌游泳体在斑节对虾高位池养殖中的应用实验 

一、养殖步骤 

(1)虾池结构为88m×83m×2.2m，四角为圆角，每个虾池面积为10亩， 

呈东西方向水平一字型排列。虾池之间距离为5m，海拔高度为10m，虾池四周采用水泥混凝土护坡，池底铺设塑料薄膜，然后在膜上再覆盖沙35cm。 

海区最低低潮线挖井，铺设管道至泵，房距离为72m，采用100cm混凝土管；泵房采用3台型号为8BA18、功率为22kW/台的抽水泵，抽水至虾池，距离为110m，采用60cm×70cm明渠，再通过40cm×60cm明渠引水进入各个虾池。采用水车式增氧机，功率为1·1kW/台，每亩水面放置1台。 

(2)放苗前1个月，用高压水枪冲洗塘底淤泥，并进行清理，然后干塘晒池15d后，每亩泼洒生石灰150kg，进水30cm浸泡消毒，继续加水90cm，并同时进行施肥，主要投放尿素15kg/亩，磷肥10kg/亩，进行肥水，约3d，水体透明度达到35cm便可放苗。 

(3)虾苗选择与放养，虾苗选择个体大小整齐，体长1.0-1.2cm的黑壳虾苗，群体发育整齐，肌肉饱满透明，附肢中色素正常，胃肠充满食物，虾苗活动活泼，对水流刺激反应灵敏，无外部寄生物及附着污物，放苗时水温20℃，养殖池水盐度10‰，放苗时间与普通养殖同步进行。养成池水色为黄绿色、透明度30cm，pH在8.5，投放密度为5.5万只/亩。虾苗运至养殖池边，用充氧气头向苗袋内充氧半小时，同时逐步向袋内加入养殖池水，使逐步缩小温差和醒苗； 

(4)投饲管理，饲料(配合饲料1号)为常规的对虾养殖饲料，符合中华人民共和国农业行业标准《无公害食品渔用配合饲料安全限量》(NY5072-2002)的规定。每次投饵前，将饲料用蛭弧菌游泳体菌液浸泡30min，菌液中的蛭弧菌游泳体的浓度达到10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL，养殖前期和中期，虾体长6cm以下时，日投2次，日投放量控制在虾重的15％；养殖后期，体长达到6cm时，日投5次，日投放量控制在虾重的8％； 

(5)养殖期的水环境管理，养殖期间正常曝气使水中溶解氧达到5mg/L。采取不同换水周期，5、10、15、20、25、30天换水一次，每次换掉25cm深的水(量)，透明度保持在30cm，每次换水后加蛭弧菌游泳体菌液，使水体中的菌体浓度达到10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL，加菌方法为：用相应的池水稀释菌液后，均匀泼洒全池，使菌液混合均匀。 

实验分组 

采用随机区组试验设计，平均分为A-D4个试验组，B、C、D每个试验组有6个小组，分别为B1、C1、D1；B2、C2、D2；B3、C3、D3、； B4、C4、D4；B5、C5、D5；B6、C6、D6；B1-D6每小组再分为4组，即B1-1-B1-4...D6-1-D6-4，每组2个重复。对4组试验对虾初始体重进行方差检验，组间差异不显著(P＞0.05)。四组试验组的处理如下： 

A组：工厂生产的养殖方式，饲养前期，每7d排污一次，饲养中期每2d排污一次，饲养后期增加排污次数，水色加深变为深褐色时便排污。为补足因蒸发及排污损失的水量，向试验池添加淡水。投放颗粒饲料(配合饲料1号) 

B组：在水中泼洒蛭弧菌游泳体菌液，使水体中游泳体菌体浓度分别达到10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL，投放颗粒饲料(配合饲料1号) 

C组：投喂浓度为10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌体浸泡后的颗粒饲料(配合饲料1号) 

D组：在水中加入蛭弧菌游泳体菌液，使菌体浓度分别达到10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL，同时分别投喂浓度为10¹、10³、10⁵、10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌液浸泡后的颗粒饲料(配合饲料1号)； 

B1、C1、D1组每5天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B2、C2、D2组每10天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B3、C3、D3组每15天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B4、C4、D4组每20天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B5、C5、D5组每25天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B6、C6、D6组每30天换水一次，换掉25cm深的水(量) 

B1-1、C1-1、D1-1...D6-1换水后加入蛭弧菌游泳体使水体中菌体浓度为10¹pfu/mL 

B1-2、C1-2、D1-2...D6-2换水后加入蛭弧菌游泳体使水体中菌体浓度为10³pfu/mL 

B1-3、C1-3、D1-3...D6-3换水后加入蛭弧菌游泳体使水体中菌体浓度为10⁵pfu/mL 

B1-4、C1-4、D1-4...D6-4换水后加入蛭弧菌游泳体使水体中菌体浓度为10⁷pfu/mL 

斑节对虾实验效果检测 

(1)生长指标的测定 

每组随机抽取50尾对虾检测生长情况，对虾长度测定采用精度为0.1mm的游标卡尺度量，体重采用电子天平称量。试验生长指标按如下公式计算： 

成活率(％)＝N_t/N_o×100％； 

增重率(％)＝(W_t-W_o)/W_o×100％； 

体长增长率(％)＝(L_t-L_o)/L_o×100％； 

式中N_o为试验开始时斑节对虾总尾数；N_t为试验结束时斑节对虾总尾数；W_o为试验开始时斑节对虾体重；W_t为试验结束时斑节对虾体重； L_o为试验开始时斑节对虾体长；L_t为试验结束时斑节对虾体长。 

试验测得的斑节对虾各项生长指标见表九-表十二：与A组相比，B、C、D组的成活率、增重率、体长增长率均有明显提高。B、C、D组成活率的增加值分别≥43.58％、44.58％、48.55％；增重率的增加值分别≥55.54％、80.62％、101.3％；体长增长率增加值分别≥5.04％、4.99％、4.99％。 

在对虾养殖过程中，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌游泳体的浓度升高，成活率、增重率、体长增长率都明显升高，且都明显高于工厂生产对照A组，说明采用新型的添加蛭弧菌游泳体的方法，能明显提高斑节对虾的成活率、增重率、体长增长率，这在实际生产过程中，不仅大大节约了用水量，而且节省了大量的人力，物力资源，节约了养殖成本；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组对虾成活率、增重率、体长增长率没有大的变化。说明新型养殖方法下，5-30天不换水蛭弧菌游泳体均可促进对虾的生长。就B、C、D三组不同处理方式而言，均提高对虾的养殖成活率、增重率和体长增长率，但同时在水体与饲料中添加蛭弧菌游泳体菌液效果最佳。 

因此，无论在水中添加蛭弧菌游泳体菌液，使水体蛭弧菌游泳体菌体浓度为10¹-10⁷pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为10¹-10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳质体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，也可促进斑节对虾的快速生长，且同时在水体中与饲料中添加菌液的效果最好。 

表九斑节对虾生长指标的检测 

表十斑节对虾生长指标的检测 

表十一斑节对虾生长指标的检测 

表十二斑节对虾生长指标的检测 

(2)、免疫指标的检测 

用1mL的无菌注射器自对虾心脏抽取血液，每组抽取50尾对虾血液合并置于无菌离心管中4℃静置过夜后，3000r/min离心10min，取上层 血清置于-80℃超低温冰箱保存待测。 

1、溶菌酶活力测定血清溶菌酶活性通过浊度比色法测定 

(Ellis A E.Lysozyme assays.[M]//Stolen J S，Fletcher T C，Anderson D P，etal.Techniques in Fish Immunology I.USA：SOS Publications，1990：101-103.)实验条件下，每mL血清每min吸光值减少0.001为1个酶活性单位(U)。 

2、酚氧化酶(PO)活力的测定 

酚氧化酶活性测定采用Hernández-López等(Hernández-López J，Gollas-Galvan T.Vargas-Albores F.Activation of the prophenoloxidase systemof the brown Penaeus californiensis Holmes[J].Comp Biochem Physiol，1996.113C：61-66.)的方法。以实验条件下，每mL血清每min吸光增加0.001，定义为1个酶活性单位(U)。 

3、超氧化物歧化酶(SOD)活力 

超氧化物歧化酶(SOD)活力测定采用YI Sun等(A Simple Method forClinical Assay of Superoxide Dismutase[J].Clin.Chem.1988：497-500)的方法。一个酶活力单位定义为：在试验条件下，硝基四氮唑溶液(NBT)被SOD抑制50％所需的酶蛋白量。 

斑节对虾各项免疫指标的测定结果见表十三～表十六： 

从表中可以看出，与A组相比，B、C、D组的溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力均有明显提高。B、C、D组溶菌酶活力增加值分别≥11.09U/mL、12.18U/mL、12.8U/mL；超氧化物歧化酶活力增加值分别≥53.58U/mL、79.98U/mL、97.48U/mL；氧化酶活力增加值分别≥12.1U/mL、11.8U/mL、12U/mL。 

在斑节对虾养殖过程中，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌游泳体的浓度升高，成活率都明显升高，且都明显高于工厂生产对照A组，说明采用新型的添加蛭弧菌游泳体的方法，能明显提高斑节对的免疫力，增强酶的活力，这在实际生产过程中，不仅节约了养殖成本，而且增强对虾的免疫能力，促进生长；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组对虾酶活力没有大的差异，说明新型对虾养殖方法下，5-30天不换水蛭弧菌游泳体均能提高对虾免疫力。就B、C、D三组不同处理方式而言，均提高免疫力，同时在水体与饲料用蛭弧菌游泳体菌液浸泡效果最佳。 

因此，无论在水中添加蛭弧菌游泳体菌液，使水体蛭弧菌游泳体菌体浓度为10¹-10⁷pfu/mL，或者是饲料用浓度为10¹-10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳体菌液浸泡，或是两者兼用，虽长达30天不换水，均能明显提高斑节对虾的溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力等免疫指标，在水体中和饲料中同时添加，效果更佳。5-30天之间换水，对溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力均无明显影响。 

表十三免疫指标的测定结果 

表十四免疫指标的测定结果 

表十五免疫指标的测定结果 

表十六免疫指标的测定结果 

(3)、水质检测 

1、氨态氮用次溴酸纳氧化法测定(GB12763.4-91)； 

2、亚硝酸盐氮用重氮-偶氮光度法测定(GB12763.4-91) 

3、H₂S用对二甲氨基苯胺分光光度法测定(GB16489-1996) 

经过测定，A组水池中的各项水质测定值均高于试验组B、C、D的。其中，A组氨态氮的检测结果为0.516mg/L，高于B组的0.441-0.466mg/L，C组的0.47-0.502mg/L，D组的0.413-0.451mg/L；A组亚硝酸盐氮检测结果为0.016mg/L，高于B组的0.009-0.01mg/L，C组的0.012-0.014mg/L，D组的0.008-0.009mg/L；A组H₂S检测结果为0.21mg/L，高于B组的0.066-0.147mg/L，C组的0.124-0.189mg/L，D组的0.034-0.116mg/L；由以上结果分析可知，应用浓度为10¹-10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳体可有效改善养殖水体环境，控制水中氨态氮、亚硝酸盐氮、H₂S的浓度，从而提供有利于斑节对虾生存的水体环境，并且同时在水体和饲料中添加蛭弧菌游泳体的效果最佳。 

(4)、细菌数的检测： 

1、菌落总数用营养琼脂培养基检测(GB4789.2-2010) 

2、弧菌总数用TCBS培养基检测(SN/T 0173-2010) 

3、pH用PHB-3便携式pH计测定 

工厂生产对照A组的总细菌数和总弧菌数分别高达5.33×10³cfu/mL和7.89×10²cfu/mL。B、C、D组的总细菌数分别为4.14×10²cfu/mL、3.79×10²cfu/mL、4.11×10²cfu/mL；总弧菌数6.5×10cfu/mL、6.4×10cfu/mL、6.1×10cfu/mL，与B组比明显都降低了1个数量级。说明蛭弧菌游泳体能有效控制水体的细菌数，改善水质。综合来看，添加蛭弧菌游泳体，能明显的提高对虾的体质，增强对虾的免疫力，而且能够改善水质，达到节水节能、提高成活率的良好效果。 

同时，由实验数据可知无论在水中添加蛭弧菌游泳体菌液，使水体蛭弧菌游泳体菌体浓度为10¹-10⁷pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为 10¹-10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，但也可促进斑节对虾成活，增强免疫力，提高养殖期抗病能力，并且在水体和饲料中同时添加蛭弧菌游泳体菌液效果最好。 

总之，无论是普通池塘养殖还是高位池养殖，在水中添加蛭弧菌游泳体菌液，使水体蛭弧菌游泳体菌体浓度为10¹-10⁷pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为10¹-10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳体菌液，或两者兼之，均能够提高虾的免疫力、促进快速生长，且能够裂解水体中的(潜在)致病菌，改善水质。本技术/方法可节约地下水资源，保护环境，节省成本，提高经济效益，促进对虾养殖业的快速发展。