催眠睡茄植物提取物及其制备方法

摘要

本发明涉及催眠睡茄植物提取物和组合物，其包含用于治疗例如阿尔茨海默病(AD)的神经退行性疾病和/或失调的提取物。本发明进一步提供制备所述提取物的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及催眠睡茄(Withania somnifera)植物提取物组合物及其在治疗神经退行性疾病或失调，例如阿尔茨海默病(AD)中的用途。

背景技术

各种神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和老年性痴呆的发生率随着年龄而增加。PD的特征在于震颤、僵化和运动迟缓，AD的特征在于短期记忆丧失，然后是认知的(智力的)损伤，其影响更高的认知功能，例如语言域、熟练动作和识别，它们分别导致失语症、失用症和失认症。它还会影响例如与脑的额骨和颞叶密切相关的决策和计划功能。

阿尔茨海默病的流行病学显示2006年全球2600万以上的人口患有阿尔茨海默病，并且到2050年该数字将增加至1.06亿以上(Brookmeyer R，Johnson E，Ziegler-Graham K，Arrighi HM，“Forecasting the Global Burden of Alzheimer′s Disease.Alzheimer′s and Dementia，”3：186-191(2007))。AD患病率最大的增长将发生在亚洲，目前世界阿尔茨海默病例的48％存在于这里。据预计亚洲病例数目将从2006年的1265万增长至2050年的6285万。

阿尔茨海默病是进行性的和不可逆的神经退行性疾病，并且目前无法治愈，因为对这种疾病的发病机理知之甚少。可得的用于AD的市售药物不能预防或治疗这种疾病，其被许可只用于症状的控制(Melnikova，2007)。迫切需要早期检测和治疗干预以最小化这种毁灭性疾病的不良作用。传统的医学体系，例如阿育吠陀(Ayurveda)提供了广泛的资源，其可以被用于对这些疾病治疗的治疗干预策略的发展。

目前植物物种被广泛地用于医药目的。草药是天然的并较合成药物安全，并且它们在治疗许多神经系统的复杂疾病方面有效。例如，银杏(Ginkgo biloba)提取物已显示能够阻止AD小鼠模型中空间学习和记忆的损伤(Quinn等人.2003)。同样地，过去的研究显示南非醉茄(ashwagandha)可有助于促进记忆。

催眠睡茄(南非醉茄)，传统上也被称为印度人参(Indian ginseng)，是印度医学体系中提到的老年补养药的主要草药成分之一。众所周知南非醉茄用于多种疾病的治疗和预防。该草药的传统用途是作为补药和强壮剂。其被认为延长寿命、促进脑力和体力并改善性功能(这就是其得到草药万艾可的绰号的原因)。它还有助于改善学习能力和记忆能力。

睡茄内酯A(Withanolide-A)，该植物提取物的成分之一，在体外实验中已显示可以使严重损坏的神经细胞中的神经突再生和突触重建。(Kuboyama T，Tohda C，Komatsu K，“Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A，”Br J Pharmacol.2005 Apr；144(7)：961-71)。

Ghoshal(US 6713092，2004)公开了从1-2年生植物的根和叶中制备催眠睡茄提取物的方法。该方法包括在外源的多糖存在下水-酒精提取。

Ghoshal(US 7318938，2008)公开了稳定的草本粉末形式的催眠睡茄提取物组合物，其为使用者提供增强的认知增加效果。该组合物包含8-25％的睡茄内酯苷类和甾醇苷(sitoindosides)、25-75％的寡糖、多糖(10％以下)和游离睡茄素A(withaferrinA)(2％以下)。

发明内容

本发明提供催眠睡茄植物提取物组合物和所述提取物的制备方法。本发明公开的植物提取物用于治疗神经退行性疾病或失调，例如阿尔茨海默病。

本发明的一个方面提供催眠睡茄提取物，其包含约70-80％的睡茄内酯和约15-25％的睡茄皂苷(withanoside)。

本发明的一个方面提供催眠睡茄提取物，其包含75％的睡茄内酯和20％的睡茄皂苷。

本发明的另一方面提供药物组合物，其包含催眠睡茄提取物和药学可接受载体，所述提取物包含约75％的睡茄内酯和约20％的睡茄皂苷。

本发明的另一具体实施方案提供营养组合物，其包含催眠睡茄提取物，所述提取物包含约75％的睡茄内酯和约20％的睡茄皂苷。

本发明的另一方面提供一种草药组合物，其包含催眠睡茄提取物，所述提取物包含约75％的睡茄内酯和约20％的睡茄皂苷。

本发明的另一方面提供制备催眠睡茄植物提取物的方法，所述方法包括提供睡茄根，用有机溶剂在室温提取所述根约60-75小时得到根提取物；从根提取物中除去溶剂得到干燥的根提取物；用10％的甲醇-氯仿混合物处理干燥根提取物得到根提取物的活性部分。

本发明另一方面提供催眠睡茄提取物(包含约75％睡茄内酯和约20％睡茄皂苷)在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病(AD)、帕金森(PD)病或老年性痴呆。

本发明另一方面提供改善神经退行性疾病的方法，所述方法包括给予需要它的患者治疗有效量的催眠睡茄植物提取物，所述催眠睡茄植物提取物包含约75％的睡茄内酯和约20％的睡茄皂苷。

附图说明

图1显示植物提取物(PE)处理改善放射臂迷宫(RAM)中Tg小鼠的学习和记忆性能。

图2显示用植物提取物处理的Tg小鼠(9月龄)(剂量：1gm/kg体重)显示了斑块和泛素化蛋白质聚集体的完全消除：

(a)连续切割冠状脑切片，用Bielschowsky银染法(Bielschowsky’s Silver staining)对斑块染色(每10天)，对β-淀粉体和泛素(泛素-IHC)免疫染色。

(b)描述了在脑皮层和海马体中被斑块覆盖、被淀粉体和泛素化蛋白质聚集体免疫染色的百分比表面积的定量评价。所有数据是平均值±标准差(mean±S.D，n＝4)。星号表示值与对照组有显著性差异(p＜0.001)。处理组被分为载体处理组(V/Veh)、植物提取物处理组(T/Trt)，并且图像取自脑皮层(CT)、海马体(HP)。

图3显示催眠睡茄植物提取物(1g/kg体重)降低9月龄Tg雄性小鼠中β-淀粉体负荷。使用ELISA(酶联免疫吸附试验)定量淀粉体负荷为Aβ(1-42；a)、Aβ(1-40；b)，并且c描述了Aβ42和Aβ40之间的比例。数据是平均值±标准差(n＝6)。星号表示值与对照组有显著性差异(p＜0.001)。

图4显示催眠睡茄植物提取物(1g/kg)降低9月龄Tg雌性小鼠中β-淀粉体负荷。使用ELISA定量淀粉体负荷。板块I、II、III分别描述了在脑皮层、海马体和血清中Aβ负荷。a、d、g代表Aβ(1-42)的定量；b、e、h代表Aβ(1-40)的定量；c、f、i代表Aβ42和Aβ40的比例。所有数据是平均值±标准差(n＝5)。星号表示值与对照组有显著性差别(p＜0.001)。

图5显示在用催眠睡茄植物提取物(剂量：0.1gm/kg和0.5gm/kg)处理的Tg小鼠(9月龄)中斑块和泛素化蛋白质聚集体的减少。(a)连续切割冠状脑切片并用Bielschowsky银染法对斑块染色(每10天)。(b)描述了在脑皮层和海马体中被斑块覆盖的百分比表面积的定量评价。所有数据为平均值±标准差(n＝5)。星号表示值与对照组有显著性差异(p＜0.001)。动物被分为载体处理组(V/Veh)、植物提取物处理组(T/Trt)，并且图像取自脑皮层(CT)、海马体(HP)。

图6显示用催眠睡茄植物提取物(0.5g/kg)处理的9月龄Tg雄性小鼠的脑皮层中β-淀粉体负荷的减少。进行ELISA以定量(a)Aβ(1-42)、(b)Aβ(1-40)，并且(c)描述了Aβ42和Aβ40的比例。数据为平均值±标准差(n＝6)。星号表示值与对照组有显著性差异(p＜0.001)。

图7显示通过放射臂迷宫(RAM)测试的用催眠睡茄植物提取物(PE)处理后的23月龄Tg小鼠的学习和记忆能力的改善。用PE(1g/kg)和载体处理雌性APP/PS1小鼠(23月龄)，总期限为30天，评价在这期间它们在RAM上的行为。(a)评价实验时间作为完成任务所需时间；(b)评价参考记忆误差(RME)作为第一次进入非诱饵臂(unbaited arm)的次数；(c)评价正确工作记忆误差(CWE)作为再次进入诱饵臂(baited arm)的次数；(d)评价不正确工作记忆误差(ICWE)作为再次进入非诱饵臂的次数。数据为平均值±标准差(n＝5)。星号表示值与对照组有显著性差异(p＜0.001)。动物被分为载体处理转基因组(Tg-Veh)、植物提取物处理转基因组(Tg-Trt)。

图8显示用植物提取物(剂量：1gm/kg体重)处理的23月龄Tg小鼠中斑块和泛素化蛋白质聚集体的减少。(a)连续切割冠状脑切片并用Bielschowsky银染法对斑块染色(每10天)，对β-淀粉体和泛素(泛素-IHC)免疫染色。(b)描述了在脑皮层和海马体中被斑块覆盖、被淀粉体和泛素化蛋白质聚集体免疫染色的百分比表面积的定量评价。所有数据为平均值±标准差(n＝5)。星号表示值与对照组有显著性差异(p＜0.001)。处理组被分为载体处理组(V/Veh)、植物提取物处理组(T/Trt)，并且图像取自脑皮层(CT)、海马体(HP)。

图9显示用催眠睡茄植物提取物(1g/kg)处理的23月龄Tg雌性小鼠中β-淀粉体负荷的减少。使用ELISA定量淀粉体负荷。板块I、II、III分别描述了脑皮层、海马体和血清中Aβ负荷。a、d、g代表Aβ(1-42)的定量；b、e、h代表Aβ(1-40)的定量，并且c、f、i描述Aβ42和Aβ40的比例。所有数据为平均值±标准差(n＝5)。星号表示值与对照组有显著性差异(p＜0.001)。

具体实施方式

本文使用的术语“催眠睡茄提取物”、“睡茄根提取物”、“根提取物”、“植物提取物”和“草药提取物”可以被交换使用。

本发明提供催眠睡茄植物提取物组合物及其在治疗神经进行性疾病或失调，例如阿尔茨海默病中的用途。本发明进一步提供制备所述提取物的方法。

本发明进一步提供从催眠睡茄根中制备植物提取物的方法，所述方法包括通过常规方法制备干燥睡茄根粉末，向根粉末中加入CHCl₃/MeOH(1∶1)；室温搅拌约72小时；将内含物过滤并在减压下使用旋转蒸发仪在35-40℃将溶剂从澄清的滤液中除去；向提取的植物材料中加入新鲜的CHCl₃/MeOH(1∶1)并重复提取操作四次，检查提取物的同质性，从合并的提取物中除去溶剂并在室温用空气干燥法除去溶剂痕迹得到纯的植物提取物，其包含催眠睡茄根的生物活性成分。

本发明涉及催眠睡茄植物提取物和组合物，该组合物包含催眠睡茄提取物，例如根提取物的生物活性成分。

本发明涉及催眠睡茄提取物和药物组合物，该药物组合物包含催眠睡茄提取物的生物活性成分。

本发明一方面提供催眠睡茄提取物在预防和治疗神经性疾病中的用途。

本发明一方面提供催眠睡茄提取物在预防和治疗神经退行性疾病中的用途。

本发明另一方面提供催眠睡茄提取物在预防和治疗阿尔茨海默病中的用途。

本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含用于预防和治疗神经性疾病的催眠睡茄提取物的生物活性成分。

本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含用于预防和治疗神经退行性疾病的催眠睡茄提取物的生物活性成分。

本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含用于预防和治疗阿尔茨海默病的催眠睡茄提取物的生物活性成分。

本发明另一方面提供催眠睡茄提取物在制备用于预防和治疗神经性疾病的药物中的用途。

本发明另一方面提供催眠睡茄提取物在制备用于预防和治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

本发明另一方面提供催眠睡茄提取物在制备用于预防和治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

本发明另一方面提供处理神经性疾病的治疗方法，其包括提供有效量的具有睡茄根的生物活性成分的药物组合物。

本发明另一方面提供处理神经退行性疾病的治疗方法，其包括提供有效量的具有睡茄根的生物活性成分的药物组合物。

本发明另一方面提供治疗阿尔茨海默病的治疗方法，其包括提供有效量的具有睡茄根的生物活性成分的药物组合物。

本发明另一方面提供处理神经性疾病的预防方法，其包括提供有效量的具有睡茄根的生物活性成分的药物组合物。

本发明另一方面提供处理神经退行性疾病的预防方法，其包括提供有效量的具有睡茄根的生物活性成分的药物组合物。

本发明另一方面提供处理阿尔茨海默病的预防方法，其包括提供有效量的具有睡茄根的生物活性成分的药物组合物。

本发明涉及催眠睡茄提取物和组合物，该组合物包含催眠睡茄提取物的生物活性成分。

本发明的一个具体实施方案提供催眠睡茄提取物生物活性成分在预防和治疗疾病中的用途。

本发明另一具体实施方案提供催眠睡茄提取物在预防和治疗神经性疾病或失调中的用途。

本发明另一具体实施方案提供催眠睡茄提取物在预防和治疗神经退行性疾病或失调中的用途。

本发明另一具体实施方案提供催眠睡茄提取物在预防和治疗阿尔茨海默病中的用途。

本发明的一个具体实施方案提供睡茄根提取物作为保健或营养补充品的用途。

本发明一个具体实施方案提供一种药物组合物，其包含用于治疗和/或预防神经性疾病的催眠睡茄提取物的生物活性成分。

本发明一个具体实施方案提供一种药物组合物，其可以与其它药物和/或组合物联合给药用于疾病的治疗。

本发明另一具体实施方案提供一种组合物，其包含有效量的催眠睡茄提取物和药学可接受赋形剂。

本发明另一具体实施方案提供组合物作为保健或营养补充品的用途，该组合物包含有效量的催眠睡茄提取物和药学可接受赋形剂。

本发明另一具体实施方案为催眠睡茄提取物在制备用于治疗和/或预防神经性疾病或失调的药物中的用途。

本发明另一具体实施方案为催眠睡茄提取物在制备用于治疗和/或预防神经退行性疾病或失调的药物中的用途。

本发明另一具体实施方案为催眠睡茄提取物在制备用于治疗和/或预防阿尔茨海默病的药物中的用途。

可以通过一般提取方法进行提取，例如乙醇消化、蒸汽蒸馏、通过添加共溶剂的超临界液体萃取法和其它常规提取方法。

本发明提供处理神经性疾病的治疗方法，该方法包括提供有效量的具有睡茄根的生物活性成分的药物组合物。

本发明进一步提供处理神经性疾病的预防方法，该方法包括提供有效量的具有睡茄根的生物活性成分的药物组合物。

本发明一个具体实施方案提供催眠睡茄根的植物提取物的制备和纯化方法，该方法包括通过常规方法制备干燥睡茄根粉末，向根粉末中加入CHCl₃/MeOH(1∶1)；室温搅拌约72小时；过滤内含物并在减压下使用旋转蒸发仪在35-40℃从澄清滤液中除去溶剂；向提取的植物材料中加入CHCl₃/MeOH(1∶1)并重复提取操作四次；检测提取物均匀度，从合并提取物中除去溶剂并通过室温空气干燥法除去溶剂痕迹，得到纯的包含睡茄根的生物活性成分的植物提取物。

图1：用PE(1g/kg)或载体处理雄性APP/PS1小鼠(9月龄)，总期限为30天，在这期间评价它们在RAM上的行为。(a)评价实验时间作为完成任务的时间。(b)评价参考记忆误差(RME)作为第一次进入非诱饵臂的次数。(c)评价正确工作记忆误差(CWE)作为再次进入诱饵臂的次数。(d)评价不正确工作记忆误差(ICWE)作为再次进入非诱饵臂的次数。WT-Veh和WT-Trt对于所有的参数在RAM中表现相似。数据被描述为平均值±标准差(n＝6)。星号表示值与对照组有显著性差异(p＜0.05)。处理组被分为载体处理转基因组(Tg-Veh)；植物提取物处理转基因组(Tg-Trt)；载体处理野生型(WT-Veh)和植物提取物处理野生型(WT-Trt)。

根据本发明的一个具体实施方案，提供催眠睡茄提取物，其包含约70-80％睡茄内酯和约15-25％的睡茄皂苷。

根据本发明的一个具体实施方案，提供催眠睡茄提取物，其包含75％睡茄内酯和20％的睡茄皂苷。

本发明的另一个具体实施方案，提供催眠睡茄提取物，其包含约75％睡茄内酯和约20％的睡茄皂苷，其中所述提取物不含睡茄素。

本发明另一具体实施方案，提供催眠睡茄提取物，所述催眠睡茄提取物包含约75％睡茄内酯和约20％的睡茄皂苷，其中所述提取物是从催眠睡茄的根得到。

本发明一个具体实施方案提供催眠睡茄提取物，其包含约75％睡茄内酯和约20％的睡茄皂苷，其中所述提取物用于治疗神经退行性疾病，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病或老年性痴呆。

本发明另一具体实施方案提供催眠睡茄提取物，其包含约75％睡茄内酯和约20％睡茄皂苷，其中所述提取物为粉末、液体、胶囊或片剂的形式。

本发明另一具体实施方案提供催眠睡茄提取物，其包含约75％睡茄内酯和约20％睡茄皂苷，其中所述提取物用于治疗阿尔茨海默病。

本发明另一具体实施方案提供催眠睡茄提取物，其包含约75％睡茄内酯和约20％睡茄皂苷，其中所述提取物用于治疗阿尔茨海默病，其中用于治疗阿尔茨海默病的提取物的有效剂量是在0.5g/天/kg体重至1g/天/kg体重的范围内。

在本发明的另一具体实施方案中，提供一种药物组合物，其包含催眠睡茄提取物，该提取物包含约70-80％睡茄内酯和约15-25％睡茄皂苷和药学可接受载体。

本文提供一种营养组合物，其包含催眠睡茄提取物，该提取物包含约70-80％睡茄内酯和约15-25％睡茄皂苷。

本发明进一步提供一种草药组合物，其包含催眠睡茄，该催眠睡茄包含约70-80％睡茄内酯和约15-25％睡茄皂苷。

在本发明的一个具体实施方案中，提供制备催眠睡茄植物提取物的方法，所述方法包括提供睡茄根，用有机溶剂在室温提取所述根约60-75小时以得到根提取物；从根提取物中除去溶剂得到干燥根提取物；用10％甲醇-氯仿混合物处理干燥根提取物得到根提取物的活性部分。

在本发明的一个具体实施方案中，提供制备催眠睡茄植物提取物的方法，所述方法包括提供睡茄根，用有机溶剂在室温提取所述根约60-75小时以得到根提取物；从根提取物中除去溶剂得到干燥根提取物；用10％甲醇-氯仿混合物处理干燥根提取物得到根提取物的活性部分，其中有机溶剂为氯仿和甲醇的混合物。

在本发明的一个具体实施方案中，提供制备催眠睡茄植物提取物的方法，所述方法包括提供睡茄根，用有机溶剂在室温提取所述根约60-75小时以得到根提取物；从根提取物中除去溶剂得到干燥根提取物；用10％甲醇-氯仿混合物处理干燥根提取物得到根提取物的活性部分，其中有机溶剂为氯仿和甲醇的混合物，其中氯仿和甲醇的比为2∶3、1∶1或3∶2。

在本发明的一个具体实施方案中，提供制备催眠睡茄植物提取物的方法，所述方法包括提供睡茄根，用有机溶剂在室温提取所述根约60-75小时以得到根提取物；从根提取物中除去溶剂得到干燥根提取物；用10％甲醇-氯仿混合物处理干燥根提取物得到根提取物的活性部分，其中有机溶剂为氯仿和甲醇的混合物，其中氯仿和甲醇的比为1∶1。

在本发明的另一具体实施方案中，提供改善神经退行性疾病的方法，其包括给予需要它的患者治疗有效量的催眠睡茄植物提取物，所述提取物包含约70-80％睡茄内酯和约15-25％睡茄皂苷。

在本发明的另一具体实施方案中，提供改善神经退行性疾病的方法，其包括给予需要它的患者治疗有效量的催眠睡茄植物提取物，所述提取物包含75％睡茄内酯和20％睡茄皂苷。

本发明的另一具体实施方案提供改善神经退行性疾病的方法，其包括给予患者治疗有效量的催眠睡茄植物提取物，所述提取物包含约70-80％睡茄内酯和约15-25％睡茄皂苷，其中神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病或老年性痴呆。

本发明的另一具体实施方案提供改善神经退行性疾病的方法，其包括给予需要它的患者治疗有效量的催眠睡茄植物提取物，所述提取物包含约70-80％睡茄内酯和约15-25％睡茄皂苷，其中神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

本发明的另一具体实施方案提供改善神经退行性疾病的方法，其包括给予需要它的患者治疗有效量的催眠睡茄植物提取物，所述提取物包含约70-80％睡茄内酯和约15-25％睡茄皂苷，其中所述催眠睡茄植物提取物是以约0.5g/天/kg体重至1g/天/kg体重的剂量给予患者。

在本发明的另一具体实施方案中，提供包含约70-80％睡茄内酯和约15-25％睡茄皂苷的催眠睡茄提取物在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病或老年性痴呆。

在本发明的另一具体实施方案中，提供包含75％睡茄内酯和20％睡茄皂苷的催眠睡茄提取物在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病或老年性痴呆。

虽然与优选的具体实施方案结合描述本发明，但应了解这并不旨在将本发明限制于这些具体实施方案。相反，其旨在覆盖所有可能包括在本发明主旨和范围内的可供选择物、修改物和等同物，正如随附权利要求所定义。

实施例

应了解以下本文描述的实施例只是用于例举目的，根据本说明书的各种修饰或改变将给本领域技术人员提示并将包括于本申请的主旨和权限内和随附权利要求的范围内。

实施例1

从催眠睡茄分离活性部分

制成粉末的植物材料，即催眠睡茄的根是从阿里亚维迪亚维沙拉，喀拉拉邦，印度(Arya Vaidya Shala，Kottakkal，India)得到。制备植物提取物如下：向圆底烧瓶中的根粉末加入CHCl₃/MeOH(1∶1)，使用机械搅拌器在室温搅拌72小时。过滤内含物，使用旋转蒸发仪在35-40℃(优选37℃)在减压下从澄清滤液中除去溶剂。向提取的植物材料中加入新鲜的CHCl₃/MeOH(1∶1)并重复提取操作四次。在TLC上使用CHCl₃和CHCl₃/MeOH(90∶10)溶剂系统检测所有四份提取物，以确保关于它们化学组分的同质性。所有四份提取物被发现含有相似的组分并因此而合并。使用以上提到的条件从合并的提取物中除去溶剂直至开始起泡。通过室温空气干燥法除去溶剂残留痕迹，并将干燥的提取物标记为WS-1。

检测WS-1试验样品在各种从非极性到极性溶剂中的溶解性，所述溶剂即石油醚、CHCl₃、CH₃COCH₃和MeOH。最后选择CHCl₃/MeOH(90∶10)用于进一步分馏。因此，用CHCl₃/MeOH(90∶10)(3x400ml)处理空气干燥部分WS-1以溶解大部分可溶性组分。如上从其中除去溶剂并发现余下部分为有活性的，将其标记为WS-1a(药物)。也将不可溶性部分干燥并将其标记为WS-1b。在HP-TLC上检测从不同批次得到的活性部分(WS-1a)并发现其以相同的比例含有相似的组分。提取物的收率约为每千克根粉末20gm。

实施例2

转基因动物

动物

本研究使用杂合B6C3Tg两种性别的动物，其包括年轻的(9月)和年老的(23月)小鼠以及与年龄相匹配的非转基因同窝出生仔畜。B6C3Tg双转基因小鼠表达嵌合的小鼠/人类淀粉样前体蛋白(Mo/HuAPP695swe)和突变的人类早老蛋白1(PS1-dE9)。APP中的瑞典型突变(K595N/M596L)和PS1中外显子9缺失通过有利于通过β-分泌酶途径的过程提升了转基因产生的A-β的量。小鼠是从Jackson lab，USA获得的(Borchelt等人，1996；Jankowsky等人，2001)。通过基因型分析定期追踪新生小鼠的基因组成。

通过基因型分析定期追踪新生小鼠的基因组成。通过从尾部提取的基因组DNA的PCR扩增进行子代转基因存在的基因型分析。

提取物和饲养计划

将植物提取物(0.1-1gm/kg体重)悬浮于乙醇中，以便于可以每天口服给予单一剂量25μl，持续30天。口服喂养中年和老年小鼠植物提取物或载体(乙醇)一个月。处理程序包括无行为评价处理3天，随后是接着的28天的处理和行为评价。

行为范例

在放射臂迷宫(RAM)中训练小鼠，所述放射臂迷宫由从中央八角形平台放射出的八个相同和等距的臂组成，并升高75cm的高度。使用RAM作为评价空间和工作记忆的方法。在RAM中的行为评价包括检测正确工作记忆误差(再次进入诱饵臂的次数)、不正确工作记忆误差(再次进入非诱饵臂的次数)、参考记忆误差(第一次进入非诱饵臂的次数；每次试验最大为4次)以及实验时间(完成试验的时间)(Yee等人2004)。

进行行为测试28天，其包括以下内容：

(i)3天适应环境；

(ii)10天预训练；

(iii)15天训练和记录。训练的最后三天还包括显像记录。

实施例3

免疫组织化学和染色方案

用药物和载体处理动物一个月最后处死。提取脑、分离脑半球，将左脑半球保持在4％的多聚甲醛中固定并保持24小时。然后将脑保持在30％蔗糖溶液中直到脑浸入溶液中。然后使用低温恒温器在30μm厚度对其切片。将切片保持在流动的PBS溶液中。每10个切片固定在玻片上。

银染色

将切片在蒸馏水中洗涤三次，每次三分钟(洗涤步骤)，然后浸泡在10％预热硝酸银溶液中15分钟。重复洗涤步骤，将洗涤的切片保持在氨的硝酸银溶液中30-45分钟。然后将切片放入显影液中直到显色。然后将切片保持在1％氨溶液中以停止反应。再次重复洗涤步骤，然后将切片保持在5％硫代硫酸钠中5分钟以除去过量染色剂(Beech R，Davenport H 1933)。然后给予所述切片梯度乙醇处理和二甲苯处理以脱水，然后用DPX盖片。在显微镜下取得图像，使用由莱卡(Leica)提供的IM50软件测定斑块负荷。

免疫组织化学

在蒸馏水中洗涤切片三次，每次三分钟(洗涤步骤)。然后将切片浸泡入柠檬酸钠缓冲液中并保持在高压锅中直到第一次鸣笛，用以抗原修复。然后将切片在PBS中制得的3％H₂O₂中淬灭20分钟。重复洗涤步骤。使用常规山羊血清(3-5％)进行封闭1小时。然后将切片在4℃保持在封闭溶液中的初级抗体溶液(1∶500)中过夜。再次重复洗涤步骤。然后将切片保持在PBS中的二级抗体中(1∶500)并在室温保持1-2小时。重复洗涤步骤。使用抗生素蛋白-生物素复合物法(购自Vector)完成信号放大。最后使用DAB或NOVA红试剂盒(购自Vector)显示最后的颜色。用蒸馏水洗涤切片以停止反应。然后在DAB情况下给予切片梯度乙醇处理和二甲苯处理以脱水，而在Nova红情况下只使用二甲苯以脱水，然后使用DPX盖片。在显微镜下取得图像并用IM50软件测定斑块负荷。

实施例4

ELISA方案

组织制备

用药物和载体处理动物一个月并在最后剂量后24小时处死。解剖脑，分离脑半球并将右脑半球切割为五个主要部分：前额叶、脑皮层余下部分、海马体、小脑、脑的剩余部分。用液氮急剧冷冻组织，然后均质化并离心分离为整体匀浆、后核上清液和胞液部分。用胍-HCl(5M)处理整体匀浆。分别使用抗体12F4和11A50-B10(Signet covance)进行对β淀粉体1-42和1-40的Elisa。

板制备

使用包被缓冲液(蒸馏水中0.05M NaHCO₃、0.05M Na₂CO₃，pH 9.4)的浓度1.5μg/ml的捕获抗体(12F4或11A50-B10，Signet covance)在4℃包被ELISA板过夜。用洗涤缓冲液(0.15M NaCl，0.1％吐温)洗涤板孔15-30秒并吸出缓冲液，然后用300μL封闭溶液(0.14M NaCl，8mM Na₂HPO₄.2H₂O、1.5mM KH₂PO₄、2.6mM KCl、0.5％牛血清白蛋白，在水中，pH 7.4)封闭。将板覆盖并在室温孵化1至2小时。从板孔中吸出封闭溶液。将标准品和样品稀释于试验缓冲液(0.14M NaCl、8mM Na₂HPO₄.2H₂O、1.5mM KH₂PO₄、2.6mM KCl、0.5％牛血清白蛋白、0.1％吐温20，在水中，pH 7.4)中，并将其加入至包被板孵化2小时。吸出溶液，洗涤板孔四次(每次30秒)。稀释检测抗体(多克隆β淀粉体H-43，Santa Cruz Inc.)至0.5μg/ml，并将其加入板孔孵化一小时，然后进行洗涤步骤。在试验缓冲液中稀释生物素化的二级抗体并将其加入至板孔孵化1小时，然后洗涤。稀释链霉亲和素HRP并将其加入至板孔孵化30分钟。使用TMB试剂盒显色，并加入1NH₂SO₄以终止反应。使用Biorad的酵素免疫分析仪(ELISA read)在450nm读取OD。为了分析绘制标准曲线，并使用命令三的非线性回归完成曲线拟合，并计算样品浓度。

实施例5

用9月龄B6C3Tg小鼠使用植物提取物剂量＝1g/kg体重进行实验

行为

用植物提取物(PE)和载体以1gm/kg体重的剂量处理转基因小鼠9-10月龄(基因APP和PS1突变)一个月。在放射臂迷宫上训练和测定动物的空间学习和记忆。用PE处理的转基因小鼠显示记忆误差的减少(图1)。

染色

处死这些小鼠并对它们的脑进行染色和生物化学试验。使用银染法、β淀粉体免疫组织化学法(IHC)和泛素IHC对冷冻切片染色。

与载体处理的小鼠相比，植物提取物处理组导致斑块的完全消除。进行立体测量学，计算被斑块覆盖的脑皮层或海马体的百分比面积。(图2)

使用ELISA的淀粉体负荷

进行ELISA以定量不同形式的Aβ。使用ELISA测定相同小鼠的脑皮层、海马体和血清中Aβ1-40、Aβ1-42的β淀粉体负荷，并且发现在脑和血清中有明显的Aβ1-40和Aβ1-42的减少(图3-4)。

实施例6

用9月龄B6C3Tg小鼠使用植物提取物剂量0.1g/kg和0.5g/kg体重进行实验

使用两种不同剂量0.1g/kg和0.5g/kg体重重复上述试验。结果如下：

染色

甚至是低剂量的植物提取物可导致斑块负荷的明显减少(图5)。

使用ELISA的淀粉体负荷

我们观察到在0.5g/kg体重剂量下Aβ42和Aβ40的β淀粉体的显著减少(图6)。

实施例7

用23月龄B6C3Tg小鼠使用植物提取物剂量＝1g/kg体重进行实验

对23月龄转基因小鼠进行相似的实验。

行为

与载体处理的Tg小鼠相比，用植物提取物处理的更老的Tg小鼠在放射臂迷宫任务上表现的更好。与载体处理的小鼠相比，在记忆误差方面有显著减少。(图7)

染色

与载体处理的Tg动物相比，用植物提取物处理的Tg动物在斑块负荷方面有显著减少(图8)。

淀粉体负荷

使用ELISA测定相同小鼠的脑皮层、海马体和血清中Aβ1-40和Aβ1-42的β淀粉体负荷，并发现在脑和血清中Aβ1-40、Aβ1-42有显著的减少(图9)。