钝齿棒杆菌N-乙酰谷氨酸激酶突变提高精氨酸产量的方法

摘要

L-精氨酸是人体内所需半必需碱性氨基酸之一，具有多种独特的生理和药理作用。高产精氨酸突变菌株C.crenatum SYPA5-5以循环途径合成精氨酸，乙酰谷氨酸激酶(NAGK)是其合成途径中关键酶，受到产物精氨酸的反馈抑制。利用重叠PCR技术用编码天冬氨酸的GAT密码子取代了编码NAGK蛋白中287位的甘氨酸的GGA密码子，突变后获得高活性且受精氨酸的反馈抑制作用明显降低的NAGK。将argBSD基因通过pJCl-tac引入高产精氨酸的钝齿棒杆菌中，进一步提高关键酶的表达量。最终产酸水平由原来的28g/L提高至36.3g/L，L-精氨酸产量提高了29.7％。

说明书

技术领域

本发明涉及工业微生物生产，具体涉及产生精氨酸的方法。更具体的，本发明涉及精氨酸生产关键酶——N-乙酰谷氨酸激酶的用途，对其进行改造，是一种新的突变N-乙酰谷氨酸激酶和一种含有该酶的基因工程重组钝齿棒杆菌生产精氨酸的方法。

背景技术

L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物，具有多种独特的生理和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品以及有关生物研究领域中用途广泛。发酵法是目前L-精氨酸商业化生产比较有效和经济的方法。

在原核微生物中，合成精氨酸的途径有线性途径和循环途径两种。线性途径中的L-精氨酸的合成是从谷氨酸开始，经历了8种酶催化而成。首先，谷氨酸的氨基基团在由argA基因编码的乙酰谷氨酸合成酶的作用下乙酰化，乙酰化作用既阻止了自发环化又阻止了谷氨酸羧基基团被修饰形成脯氨酸。此途径的第5步是乙酰鸟氨酸在酶的作用下脱去乙酰基团形成鸟氨酸，即乙酰鸟氨酸在由argE基因编码的乙酰鸟氨酸酶的水解作用下形成精氨酸前体物——鸟氨酸。因此根据脱乙酰基团方式的不同，L-精氨酸的另一种合成途径为循环途径，即乙酰鸟氨酸在由argJ基因编码的鸟氨酸乙酰转移酶的作用下形成鸟氨酸的同时，乙酰基团被转移至谷氨酸形成乙酰谷氨酸，在此途径中，鸟氨酸乙酰转移酶表现出二重功能—既具有乙酰鸟氨酸酶的功能又具有乙酰谷氨酸合成酶的功能，故此途径又称为经济循环途径肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞铜绿菌(Pseudomonas aeruginosa)及古细菌中的硫化裂片菌(Sulfolobussolf ataricus)以线形途径生产精氨酸，而迄今研究过的所有其他原核微生物，包括嗜温性古细菌、杆状脂肪嗜热菌(Bacillus stearothermophilus)、奈瑟氏淋球菌(Neisseriagonorrboeae)及杆菌属，以及真核微生物都采用循环途径。有报道表明，在肠杆菌中，合成精氨酸的第1个酶——乙酰谷氨酸合成酶是终产物精氨酸反馈抑制的靶目标；而采用循环途径的微生物，被精氨酸抑制的关键酶是合成途径的第2个酶——乙酰谷氨酸激酶或第5个酶——鸟氨酸乙酰转移酶。谷氨酸棒杆菌中被精氨酸抑制的关键酶是乙酰谷氨酸激酶，此酶不仅被精氨酸反馈抑制亦被其反馈阻遏。

随着我国医药营养水平的提高，对精氨酸的需求日益增长，但传统生产L-精氨酸的高产菌株大多采用诱变筛选的方法获得，但此法有盲目性高、工作量大，且存在突变株生理失调、易退化等局限性；DNA重组技术出现以后，人们开始探索利用DNA重组技术调控合成精氨酸代谢途径，以达到提高精氨酸产量的目的。钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)是我国研究者分离到的一种钝齿状、无芽孢的革兰式阳性菌，其突变株在国内氨基酸生产中被广泛应用，但对其遗传背景的研究还处于空白状态。C.crenatum SYPA5-5是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株。C.crenatum利用循环途径合成精氨酸，乙酰谷氨酸激酶(NAGK)等是合成途径中的关键酶，经证明此酶受到产物精氨酸的反馈抑制和反馈阻遏。

利用代谢工程提高L-精氨酸产量最重要的策略之一就是提高关键酶酶量，借助于基因克隆与表达技术，通过理性蛋白质设计和定点突变等技术对精氨酸生产途径中关键酶N-乙酰谷氨酸激酶进行改造，从而获得解除产物精氨酸反馈抑制作用的N-乙酰谷氨酸激酶，将其突变基因导入生产菌中，从而增强菌体内酶促反应的强度，强化表达，达到提高精氨酸产量的目的。

发明内容

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是革兰氏阳性生产L-精氨酸的工业用菌株，本发明涉及在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中构建在精氨酸的生物合成中起关键作用的突变的和高活性及抗精氨酸反馈抑制的N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)。

在本发明中，提出来用argB基因中编码天冬氨酸残基的GAT密码子取代编码NAGK蛋白中287位的甘氨酸的GGA密码子。氨基酸序列中氨基酸残基的取代导致了具有天然活性水平的突变蛋白的表达。发现上述突变NAGK变得对精氨酸的反馈抑制作用明显降低。然后本发明人发现用具有突变的argB^SD基因的DNA转化的钝齿棒杆菌产精氨酸能力提高，因此完成了本发明。

本发明提供了以下内容：

1、对来自钝齿棒杆菌的N-乙酰谷氨酸激酶进行改造，使得其受到精氨酸的反馈抑制作用下调。突变NAGK可以包含在287位以外的一个或多个位置的一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，前提是NAGK活性没有破坏。“NAGK活性”表示催化用ATP从谷氨酸生成N-乙酰谷氨酸磷酸的反应的活性。

(1)含有如序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N-乙酰谷氨酸激酶，其中对应于SEQ ID NO：1的287位的甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代。

(2)根据(1)的任意一项的N-乙酰谷氨酸激酶，其中该酶克隆自钝齿棒杆菌SYPA5-5。

(3)根据(1)和(2)的N-乙酰谷氨酸激酶，包含一种在序列表中的SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的287位以外(如281位，268位等)的一个或多个位置具有一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列。

(4)根据(1)或(3)的N-乙酰谷氨酸激酶，其中对应于序列表中SEQ ID NO：1的287位的甘氨酸残基被天冬氨酸残基以外的氨基酸取代。

2、本发明在大肠杆菌中引入NAGK酶的突变，用包含在属于大肠杆菌中起作用的载体和突变的argB基因的重组DNA转化大肠杆菌和钝齿棒杆菌，其中所用的生产菌株为钝齿棒杆菌。

用于引入突变argB^SD基因的载体的例子为质粒载体，pBR322，pUC18，pET系列载体等，本发明中用的质粒载体为pET28a。用于钝齿棒杆菌的克隆表达载体为本发明人自行构建的大肠杆菌——钝齿棒杆菌穿梭表达载体pJC1-tac。将获得的降低或解除反馈抑制的argB^SD基因通过pJC1-tac引入产精氨酸的生产菌株钝齿棒杆菌中，从而进一步增加L-精氨酸的产量。

附图说明

图1表示引物P1，P2和P3，P4的相对位置及重叠PCR示意图。

图2表示重叠PCR核酸电泳图

1：DL2000Marker；2，3：第一轮PCR产物；4：第二轮PCR产物；

图3重组菌全细胞蛋白及NAGK纯化后SDS-PAGE电泳分析

1.Protein markers(kDa)；；2.重组E.coli BL21/pET-28a(+)-argB^SD；3.纯化后NAGK

具体实施方法

实施例1.克隆突变argB^SD基因

用PCR程序进行扩增，获得野生型argB基因，并克隆至载体pET28a，产生质粒pET28a-argB。将钝齿棒杆菌的基因组DNA作为模板，SEQ ID NO：3和4中描述的寡核苷酸P1和P2用作引物，PCR扩增参数为94℃变性90s，55℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环。所得胶回收产物与pMD18-T载体连接，测序。测序结果为SEQ ID NO：2中显示的核苷酸序列。利用重叠PCR的方法经过两轮PCR获得突变的argB基因。两轮PCR扩增参数为94C变性30s，52℃复性30s，72℃延伸30s，25个循环。提取质粒pMD18-T-argB作为进行定点突变第一轮反应的模板，分别以SEQ ID NO：3和6以及SEQ ID NO：5和4进行PCR扩增，获得的产物为突变argB基因的两端产物，再以这两段产物为模板，以引物SEQ IDNO：3和4进行第二轮PCR反应，从而获得了突变的argB^SD基因。(图2)

实施例2.构建具有argB^SD突变基因的重组大肠杆菌突变株

将实施例1中经过两轮PCR获得的argB^SD突变基因经过EcoRI和SalI双酶切，胶回收argB^SD片段，将其与经同样酶切的质粒pET-28a连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性转化子，获得阳性转化子BL21/pET-28a-argB^SD。挑选阳性转化子接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，次日按1％的接种量转接于装有50mL培养基的250mL的三角瓶中继续培养4h至对数生长期，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)，16℃过夜诱导表达。利用大肠杆菌表达载体pET-28a中含有6·HisTag编码序列，可用Ni-NTA柱纯化目标蛋白的方法纯化乙酰谷氨酸激酶NAGK。对纯化得到的NAGK进行蛋白活性的测定，并添加精氨酸测定其抑制浓度。与未经突变的NAGK酶活相比，第287为氨基酸残基突变后的NAGK酶活并未降低，但其抑制浓度I_0.5^Arg从0.4mM提高至0.2M，抑制浓度提高了500倍。继续对NAGK进行其它位点的突变，最终获得抗精氨酸反馈抑制的N-乙酰谷氨酸激酶。实施例3.构建具有argB突变基因的重组钝齿棒杆菌突变株

利用实施例2中构建重组质粒pET-28a-argB^SD的构建方法构建重组质粒pJC1-tac-argB^SD。提取质粒pJC1-tac-argB^SD，用电转法转化钝齿棒杆菌SYPA，涂布于含10μg/mLKan的含葡萄糖LB平板，约36h后长出转化子。随机挑取若干菌落于LB培养基中培养后，提取质粒。质粒的酶切结果及线性化大小都与目的质粒一致，证明钝齿棒杆菌重组菌C.C.(pJC1-tac-argB^SD)构建成功。

成功获得重组钝齿棒杆菌C.C.(pJC1-tac-argB^SD)后，随即挑取一个转化子在精氨酸发酵培养基中培养菌体至对数生长期，利用超声波破碎法对钝齿棒杆菌菌体破碎，测定其胞内NAGK酶活与精氨酸抑制浓度等参数。结果表明，在其胞内的NAGK酶活性比野生型钝齿棒杆菌酶活提高了40.8％，其受到精氨酸的抑制浓度I_0.5^Arg提高至0.13M。而钝齿棒杆菌发酵产精氨酸产量达0.17M，因此可以确定在此产量的基础上，已初步解除了其受到产物精氨酸的产物抑制作用。

实施例4.通过具有突变argB基因的菌株进行发酵产精氨酸

随即挑取了6个重组钝齿棒杆菌转化子C.C(pJC1-tac-argB^SD)和出发菌株C.crenatumSYPA同时摇瓶发酵，每个转化子做3个发酵平行，振荡培养96h后，测定其精氨酸产量，其中转化子C.C(pJC1-tac-argB^SD)产量最高，较出发菌株C.crenatum SYPA产酸水平提高了约29.7％，具体结果如表1所示。

表1重组钝齿棒杆菌转化子的精氨酸产量

序列表

SEQ IDNO：1

Total amino acid number：316，MW＝33439

Max ORF starts at AA pos 1(may be DNA pos 1)for 316AA(948bases)，MW＝33439

1        M  N  D  L  I  K  D  L  G  S  E  V  R  A  N  V  L  A  E  A

21       L  P  W  L  Q  H  F  R  D  K  I  V  V  V  K  Y  G  G  N  A

41       M  V  D  D  D  L  K  A  A  F  A  A  D  M  V  F  L  R  T  V

61       G  A  K  P  V  V  V  H  G  G  G  P  Q  I  S  E  M  L  N  R

81       V  G  L  Q  G  E  F  K  G  G  F  R  V  T  T  P  E  V  M  D

101      I  V  R  M  V  L  F  G  Q  V  G  R  D  L  V  G  L  I  N  S

121      H  G  P  Y  A  V  G  T  S  G  E  D  A  G  L  F  T  A  Q  K

141      R  M  V  N  I  D  G  V  P  T  D  I  G  L  V  G  D  I  I  N

161      V  D  A  S  S  L  M  D  I  I  E  A  G  R  I  P  V  V  S  T

181      I  A  P  G  E  D  G  Q  I  Y  N  I  N  A  D  T  A  A  G  A

201      L  A  A  A  I  G  A  E  R  L  L  V  L  T  N  V  E  G  L  Y

221      T  D  W  P  D  K  S  S  L  V  S  K  I  K  A  T  E  L  E  A

241      I  L  P  G  L  D  S  G  M  I  P  K  M  E  S  C  L  N  A  V

261      R  G  G  V  S  A  A  H  V  I  D  G  R  I  A  H  S  V  L  L

281      E  L  L  T  M  G  G  I  G  T  M  V  L  P  D  V  F  D  R  E

301      N  Y  P  E  G  T  V  F  R  K  D  D  K  D  G  E  L

SEQ ID NO：2

SEQ  DNAMAN35：954 bp；

Composition  195 A；219 C；292 G；248 T；0 OTHER

Percentage：20.4% A；23.0% C；30.6% G；26.0% T；0.0%OTHER

Molecular Weight  (kDa)：ssDNA：295.79 dsDNA：588.17

ORIGIN

1      ATGAATGACT TGATCAAAGA TTTAGGCTCT GAGGTGCGCG CAAATGTCCT CGCTGAGGCG

61     TTGCCATGGT TGCAGCACTT CCGCGACAAG ATTGTTGTCG TGAAATATGG CGGAAACGCC

121    ATGGTGGATG ATGATCTCAA GGCTGCTTTT GCTGCCGACA TGGTCTTCTT GCGCACCGTG

181    GGCGCAAAAC CAGTGGTGGT GCACGGTGGT GGACCTCAGA TTTCTGAGAT GCTAAACCGT

241    GTGGGTCTCC AGGGCGAGTT CAAGGGTGGT TTCCGTGTGA CCACTCCTGA GGTCATGGAC

301    ATTGTGCGCA TGGTGCTCTT TGGTCAGGTC GGTCGCGATT TAGTTGGTTT GATCAACTCT

361    CATGGCCCTT ACGCTGTGGG AACCTCCGGT GAGGATGCCG GCCTGTTTAC CGCGCAGAAG

421    CGCATGGTCA ACATCGATGG CGTACCCACT GATATTGGTT TGGTCGGAGA CATCATTAAT

481    GTCGATGCCT CTTCCTTGAT GGATATCATC GAGGCCGGTC GCATTCCTGT GGTCTCTACG

541    ATTGCTCCAG GCGAAGACGG CCAGATTTAC AACATTAACG CCGATACCGC AGCAGGTGCT

601    TTGGCTGCAG CGATTGGTGC AGAACGCCTG CTGGTTCTCA CCAATGTGGA AGGTCTGTAC

661    ACCGATTGGC CTGATAAGAG CTCACTGGTG TCCAAGATCA AGGCCACCGA GCTGGAGGCC

721    ATTCTTCCGG GACTTGATTC CGGCATGATT CCAAAGATGG AGTCTTGCTT GAACGCGGTG

781    CGTGGGGGAG TAAGTGCTGC TCATGTCATT GACGGCCGCA TCGCGCACTC GGTGTTGCTG

841    GAGCTTTTGA CCATGGGTGG AATTGGCACG ATGGTGCTGC CGGATGTTTT TGATCGGGAG

901    AATTATCCTG AAGGCACCGT TTTTAGAAAA GACGACAAGG ATGGGGAACT GTAA

SEQ ID NO：3

PlargBF EcoRI：5′-cgcgaattcATGAATGACTTGATCAAAG-3′

SEQ ID NO：4

P2argBR SalI：5′-cgcgtcgacTTACAGTTCCCCATCCTTG-3′

SEQ ID NO：5

P3G287D  F：5′-CATGGGTGATATTGGCACGATGGTGCTG-3′

SEQ ID NO：6

P4G287D  R：5′-AGCACCATCGTGCCAATATCACCCATGG-3′