一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体

摘要

本发明属于分子生物学领域，公开了一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体。该嵌合启动子是在大肠杆菌rRNArrnB操纵元启动子P1的上下游分别插入乳糖操纵元的两个lacO1启动子；或者在大肠杆菌rRNA操纵元启动子P1的上下游分别插入阿拉伯糖操纵元的araI1和araO2启动子，形成环状DNA结构实现对启动子P1的控制。该诱导型表达载体由载体pET29a的T7启动子被所述的rRNArrnBP1嵌合启动子代替所得。本发明所述嵌合启动子及表达载体pRNP2和pRBB可以方便的实现在多种大肠杆菌菌株中进行外源基因的高效表达，其中pRBB还可以用于基因的定向进化。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体，特别涉及一种含DNA环调控元件的rRNA rrnB P1嵌合启动子，及含有该嵌合启动子的表达载体。

背景技术

在大肠杆菌中，核糖体的数量是由染色体上七个拷贝的rRNA操纵元的转录水平控制的。当大肠杆菌代时是20 min时，每个细胞中的核糖体数量约有7万个，当生长速率较慢时，每个细胞中也大约有2万个。核糖体在细胞中如此巨大的数量说明了rRNA操纵元启动子的超强能力。

E.coli rRNA操纵元中的启动子P1是由包括-10区和-35区的核心启动子、位于-35区上游的富含AT碱基的UP元件和位于UP元件上游的3到5个转录因子 (Fis) 的结合位点组成的。尽管已经证明rRNA启动子P1具有超强能力，但它仍未被用于E.coli进行高水平表达，其主要原因是，rRNA的体内合成从属于细胞生长速度的控制。在细胞快速增殖期，P1是活化的，当细胞处于生长的静息期，则P1被负调节。所以，rRNA启动子在前诱导期将持续活化，故难以对其进行调控。因此，实现rRNA启动子P1的可调控将对外源基因进行高水平表达具有重要的意义。

在目前常用的表达载体中，使用的大部分大肠杆菌启动子均来自相应操纵元，它们都带有可与阻遏蛋白特异性结合的操纵子区域。

在lac操纵元中有3个操纵子，除了主要的操纵子lacO1 (O1) ，还有两个辅助的lacO，它们是lacO2 (O2) 和lacO3 (O3) ，O2中心位于O1下游401 bp处lacZ基因的内部，O3中心位于O1上游92 bp处，它们都与阻遏作用有关，Lac阻遏蛋白可以同时结合在两个操纵子位点上从而形成DNA环，稳定的DNA环使得阻遏效果达到最大程度的。

在ara操纵元中有4个操纵子，分别是araI1，araI2，araO1和araO2。当没有阿拉伯糖存在时，调节蛋白同时结合在araI1和araO2上，形成稳定的DNA环，P_BAD启动子的转录被抑制。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术难以对大肠杆菌rRNA启动子P1进行调控的不足，根据基因表达中的DNA环状调控结构设计特殊的rRNA rrnB P1嵌合启动子，以期实现rrnB P1启动子的可控表达。

本发明的另一目的是提供含有该嵌合启动子的表达载体。

本发明的又一目的是提供一种β-1,4-葡聚糖内切酶基因重组表达载体以及利用该重组表达载体表达β-1,4-葡聚糖内切酶的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现:

一种rRNA rrnB P1嵌合启动子，该嵌合启动子是在大肠杆菌rRNArrnB操纵元启动子P1的上下游分别插入乳糖操纵元的两个lacO1启动子；或者在大肠杆菌rRNA操纵元启动子P1的上下游分别插入阿拉伯糖操纵元的araI1和araO2启动子，形成环状DNA结构实现对启动子P1的控制。

其中，所述的大肠杆菌rRNA操纵元启动子P1的上下游分别插入乳糖操纵元的两个lacO1启动子， rRNA rrnB P1嵌合启动子序列为SEQ ID NO. 1，命名为P_16S-2。

所述的在大肠杆菌rRNA操纵元启动子P1的上下游分别插入阿拉伯糖操纵元的araI1和araO2启动子， rRNA rrnB P1嵌合启动子序列为SEQ ID NO. 2，命名为P_16S-B。

一种大肠杆菌诱导型表达载体，该诱导型表达载体由载体pET29a的T7启动子被本发明所述的rRNA rrnB P1嵌合启动子代替所得。

所述的诱导型表达载体优选由载体pET29a的T7启动子被序列为SEQ ID NO. 1的rRNA rrnB P1嵌合启动子代替所得，命名为pRNP2。

所述的诱导型表达载体优选由载体pET29a的T7启动子被序列为SEQ ID NO. 2的rRNA rrnB P1嵌合启动子代替所得，命名为pRBB。

一种β-1,4-葡聚糖内切酶基因重组表达载体，该重组表达载体是将β-1,4-葡聚糖内切酶基因cel5G插入到本发明所述大肠杆菌诱导型表达载体的XhoI和NdeI位点之间所得。

所述的β-1,4-葡聚糖内切酶基因重组表达载体优选将β-1,4-葡聚糖内切酶基因cel5G插入到大肠杆菌诱导型表达载体pRNP2的XhoI和NdeI位点之间所得，命名为pRNP2-cel5G。

所述的β-1,4-葡聚糖内切酶基因重组表达载体优选将β-1,4-葡聚糖内切酶基因cel5G插入到大肠杆菌诱导型表达载体pRBB的XhoI和NdeI位点之间所得，命名为pRBB-cel5G。

一种利用pRBB-cel5G重组表达载体表达β-1,4-葡聚糖内切酶的方法，包括如下步骤：

（1）构建调节蛋白AraC重组表达载体：以载体pET22b为出发载体，用含自身启动子的araC基因替代载体pET22b中的T7启动子得到所述的调节蛋白AraC重组表达载体；

（2）构建pRBB-cel5G重组表达载体；

（3）利用步骤（1）和步骤（2）构建的重组表达载体共转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在同时含有氨苄青霉素和卡那霉素的双抗性LB平板上筛选单菌落；

（4）培养步骤（3）筛选得到的阳性菌株表达β-1,4-葡聚糖内切酶。

本发明所述的表达载体pRNP2和pRBB构建方法，包括以下步骤：

1) 根据待合成的嵌合启动子序列设计一对重叠引物，其中上游引物包含一个调节蛋白结合位点及rRNA rrnB核心启动子序列、UP元件和转录因子 (Fis) 结合位点，下游引物包含一个调节蛋白结合位点，使得扩增获得的启动子上下游各有一个调节蛋白位点，一个位于核心启动子-10区下游，另外一个位于Fis结合位点上游。

2) 以PCR技术或重叠延伸PCR技术，用DNA聚合酶进行PCR扩增，获得嵌合启动子片段P_16S-2及P_16S-B；

3) 将扩增获得的嵌合启动子片段与商品化的pMD18-T载体混合，按照T载体使用说明书上介绍的方法进行操作，通过转化子菌落颜色，筛选出菌落呈白色的阳性克隆，提取质粒，酶切并测序鉴定阳性克隆子，得到含目的片段的重组T载体p16S-2和p16S-B。

4) 将步骤3)中得到的含正确目的片段的重组T-载体用限制性内切酶双酶切，回收目的片段，用T4 DNA连接酶与同样双酶切后回收的pET29a连接，转化克隆宿主菌，提取转化子质粒，测序鉴定阳性重组子，得到表达载体pRNP2和pRBB。

本发明的有益效果：

1) 通过DNA环来调控启动子的活性，实现了对rrnB P1强启动子的人工控制并用于基因表达，DNA环的形成在很大程度上提高了阻遏的水平，它大大地消除了在诱导前不希望的本底转录。

2) 表达载体pRNP2可以利用多种不同类型的大肠杆菌作为宿主菌，比如E. coli DH10B、DH5a和BL21 (DE3)，优选为E. coli DH10B，调控严谨性优选为E. coli BL21 (DE3) 。在BL21 (DE3) 中，在没有诱导剂诱导的情况下，外源基因被完全抑制表达，因此不会造成质粒的不稳定，细胞生长速度的下降和重组蛋白产量的降低。另外在表达有毒蛋白时，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响。表达载体pRBB可以高效的用于外源基因的表达，在AraC缺乏的大肠杆菌菌株中，该载体可以不受控表达，并且广泛的宿主范围，因此可以用于外源基因的定向进化。

3）pAC+pRBB共表达体系中通过pAC的高表达，实现了pRBB的严谨控制表达。

4）本发明所述嵌合启动子及表达载体pRNP2和pRBB可以方便的实现在多种大肠杆菌菌株中进行外源基因的高效表达，其中pRBB还可以用于基因的定向进化。

附图说明

图1  E.coli rRNA启动子P1结构图

图2  嵌合启动子P_16S-2结构图

图3  嵌合启动子P_16S-2调控图

图4  表达载体pRNP2构建示意图

图5  嵌合启动子P_16S-B结构图

图6  嵌合启动子P_16S-2调控图

图7  表达载体pRBB构建示意图

图8  重组质粒pAC构建示意图。

具体实施方式

实施例1：启动子片段P_16S-2的扩增及中间质粒p16S-2的构建

根据E. coli rRNA rrnB P1启动子序列及lac操纵子lacO序列设计PCR引物，具体为：

上游引物S1：SEQ ID NO. 3（含SphI酶切位点），下游引物S2：SEQ ID NO. 4。用重叠长引物对S1/S2互为模板扩增获得P_16S-2启动子片段。PCR条件为：10 μL 5×PrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ plus)，50 μM dNTP Mixture，0.5 μM S1，0.5 μM S2，1.25 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶 (TAKARA)，用无菌水调反应体积至50 μL。PCR扩增反应程序为：98 ℃，10 s，55 ℃，15 s，72 ℃，30 s，循环29次；72 ℃，10 min。

用2%的琼脂糖凝胶电泳提纯PCR产物，并利用Taq酶能使扩增片段末端加脱氧腺苷的特性，再次进行PCR使每个片段的粘性末端都被补平并加上一个dA。PCR条件为：2.5 μL 10× Taq Buffer (Mg²⁺ plus)，50 μM dNTP Mixture，10 ng DNA回收片段，1 UTaqDNA聚合酶，用无菌水调反应体积至25μL。PCR扩增反应程序为：72 ℃，20 min；10 ℃，10 min。

T/A克隆是对PCR产物直接克隆的一种方法，利用Taq酶具有延伸酶活性，将一个A残基添加到已完全延伸的PCR产物的3’末端，然后利用含有单个胸腺嘧啶 (T) 3’突出端的线性化载体与带有单个腺苷酸 (A) 3’突出端的插入片段来进行的。pMD18-T simple载体是由改建而成的，具有同pUC18载体完全相同的功能。该载体的多接头区域位于基因内部，因此能用蓝/白斑筛选来鉴定含有插入片段的阳性克隆。载体含有氨苄青霉素抗性基因，可用于筛选含有载体的细菌。

经PCR加“A”尾反应后的DNA片段与pMD18-T Vector按2:1比例混合，在连接液作用下，16 ℃水浴过夜。酶连产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在氨苄青霉素(100 μg·mL-1)LB平板上于37 ℃培养过夜。转化子经PCR及测序鉴定后得到中间质粒p16S-2。酶连采用Takara公司的酶连试剂盒进行，其反应体系为

pMD18-T   simple 载体0.5 μLPCR 产物4.0 μL连接溶液 I5 μL总反应体系10 μL

本专利中下述所有酶连过程均采用相同的酶连反应体系。

实施例2：表达载体pRNP2的构建

将p16S-2和pET29a质粒用NdeI和SphI双酶切得到启动子片段P16S-2和去除T7启动子的pET29a的双酶切片段，纯化回收后按照2:1比例混合酶连。酶连产物转化E.coli DH10B感受态细胞，涂布含有50 μg·mL-1卡那霉素的LB平板。转化子经PCR及测序鉴定后得到表达载体pRNP2。

实施例3：含有β-1,4葡聚糖内切酶基因 (cel5G)重组质粒pRNP2-cel5G及表达菌株的构建

将pRNP2以及本实验室已经构建好的重组质粒pET29a-cel5G (崔中利等，中国专利申请号：201010018298.0) 分别用XhoI和NdeI进行双酶切。 酶切体系为：

NdeI酶 (10 U·μL   ^-1) 1.0 μLXhoI酶 (10 U·μL   ^-1) 1.0 μL10×通用缓冲液5.0 μLpET29a-cel5G20.0 μL双蒸水24.0 μL总体积50.0 μL

在37 ℃水浴中反应3 h以上，酶切产物进行0.75%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收，方法同上。

酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后用DNA凝胶回收试剂盒回收。然后将双酶切得到的cel5G基因片段和pRNP2双酶切片段于16 ℃酶连过夜后转化E.coliDH10B新鲜感受态细胞，涂布含有50 μg·mL^-1卡那霉素的LB平板。挑选阳性克隆，得到重组表达菌株pRNP2-cel5G (DH10B) 。

再将重组表达质粒pRNP2-cel5G分别转化E.coliDH5a，BL21 (DE3) 新鲜感受态细胞，得到表达菌株pRNP2-cel5G (DH5a) ，pRNP2-cel5G [ BL21 (DE3) ]。

实施例4：β-1,4葡聚糖内切酶Cel5G活力测定

将构建好的表达菌株pRNP2-cel5G(DH10B)、pRNP2-cel5G (DH5a) 、pRNP2-cel5G [ BL21 (DE3) ]及pET29a-cel5G [ BL21 (DE3) ]接入含卡那霉素的LB试管中以固定转速200 r·min^-1振荡培养过夜，然后按1%接种量转接至100 mL新鲜的含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.6；加入IPTG至终浓度0.1 mM，20 ℃诱导培养20 h；同时以不加IPTG诱导的三个表达菌株作为对照。6000 r·min^-1、4℃离心10 min,收集菌体。按照10 mL·g^-1湿细胞的比例用50 mM柠檬酸缓冲液 (pH4.8) 悬浮菌体沉淀，并加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为0_·1 mM，用超声处理破碎菌体细胞，12000 r·min^-1、4 ℃离心15 min后，所得上清即为含重组酶Cel5G的粗酶液。测定β-1,4葡聚糖内切酶的表达量及其活性，结果显示，cel5G基因可以在P_16S-2-表达系统中很好的表达。在P_16S-2-表达系统中，目的蛋白经IPTG诱导后酶活达到T7-表达系统中的50%且未经诱导的目的蛋白的酶活仅为诱导后的2%，在T7-系统中本底表达的目的蛋白的酶活也达到了诱导后蛋白酶活的25%。由此可见，DNA环确实在转录调控中起到了重要的作用，DNA环的形成在很大程度上提高了阻遏水平。另外，构建在pRNP2表达载体上的cel5G基因可以在不同的宿主菌中很好的诱导表达，但是表达效果不尽相同。Cel5G在E.coli DH10B中的表达水平最高，在E.coli  BL21 (DE3) 中的表达水平最低，并且在E.coli BL21 (DE3) 中的非诱导条件下，cel5G基因完全处于沉默状态而没有转录。

实施例5：启动子片段P_16S-B的扩增及中间质粒p16S-B的构建

根据E. coli rRNA rrnB P1启动子序列及ara操纵子araI1和araO2序列设计PCR引物，具体为：上游引物S1：SEQ ID NO. 5（含SphI酶切位点）， 下游引物S2：SEQ ID NO. 5（含XbaI酶切位点）。用引物对S1/S2以大肠杆菌基因组DNA为模板（常规方法提取）扩增获得P16S-B启动子片段。PCR条件为：10 μL 5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)，50 μM dNTP Mixture，0.5 μM S1，0.5 μM S2，1μL DNA模板，1.25 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶 (TAKARA)，用无菌水调反应体积至50 μL。PCR扩增反应程序为：98 ℃，10 s，55 ℃，15 s，72 ℃，30 s，循环29次；72 ℃，10 min。

用2%的琼脂糖凝胶电泳提纯PCR产物，并利用Taq酶能使扩增片段末端加脱氧腺苷的特性，再次进行PCR使每个片段的粘性末端都被补平并加上一个dA。PCR条件为：2.5 μL 10× Taq Buffer (Mg²⁺ plus)，50 μM dNTP Mixture，10 ng DNA回收片段，1 UTaqDNA聚合酶，用无菌水调反应体积至25μL。PCR扩增反应程序为：72 ℃，20 min；10 ℃，10 min。

经PCR加“A”尾反应后的DNA片段与pMD18-T Vector按比例混合，在连接液作用下，16 ℃水浴过夜。酶连产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，在氨苄青霉素(100 μg·mL^-1)LB平板上于37 ℃培养过夜。转化子经PCR及测序鉴定后得到中间质粒p16S-B。

实施例6：表达载体pRBB的构建

将p16S-B和pET29a质粒用XbaI和SphI双酶切得到启动子片段P_16S-B和去除T7启动子的pET29a的双酶切片段，纯化回收后按2:1例混合酶连。酶连产物转化E.coliTOP10感受态细胞，涂布含有50 μg·mL^-1卡那霉素的LB平板。转化子经PCR及测序鉴定后得到表达载体pRBB。

实施例7：重组质粒pAC的构建

将扩增获得的带自身启动子的araC基因片段回收纯化后经NdeI和SphI双酶切，与pET22b双酶切去除T7启动子的纯化片段按2:1摩尔比混合，在连接液作用下，16 ℃水浴过夜。酶连产物转化E.coliTOP10感受态细胞，涂布含有100 μg·mL^-1氨苄青霉素的LB平板。转化子经酶切及测序鉴定后得到重组质粒pAC。酶切体系为：

NdeI酶 (10 U·μL   ^-1) 1.0 μLSphI酶 (10 U·μL   ^-1) 1.0 μL10×通用缓冲液5.0 μLpET22b或PCR产物20.0 μL双蒸水24.0 μL总体积50.0 μL

在37 ℃水浴中反应3 h以上，酶切产物进行0.75%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收，方法同上。

 实施例8：含有β-1,4葡聚糖内切酶基因 (cel5G)重组质粒pRBB-cel5G表达菌株的构建

将pRBB以及本实验室已经构建好的重组质粒pET29a-cel5G (崔中利等，中国专利申请号：201010018298.0) 分别用XhoI和NdeI进行双酶切。 

酶切体系为：

NdeI酶 (10 U·μL   ^-1) 1.0 μLXhoI酶 (10 U·μL   ^-1) 1.0 μL10×通用缓冲液5.0 μLpET29a-cel5G20.0 μL双蒸水24.0 μL总体积50.0 μL

在37 ℃水浴中反应3 h以上，酶切产物进行0.75%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收，方法同上。

酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后用DNA凝胶回收试剂盒回收。然后将双酶切得到的cel5G基因片段和pRBB双酶切片段于16 ℃酶连过夜后转化E.coliTOP10新鲜感受态细胞，涂布含有50 μg·mL^-1卡那霉素的LB平板。挑选阳性克隆，得到重组表达菌株pRBB-cel5G (TOP10) 。

实施例9：β-1,4葡聚糖内切酶Cel5G活力测定

将等摩尔量的pAC和pRBB-cel5G质粒共转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在同时含有100 mg·L^-1氨苄青霉素和50 mg·L^-1卡那霉素的双抗性LB平板上筛选单菌落。

从双抗性LB平板上挑取单菌落接种于含有100 mg·L^-1氨苄青霉素和50 mg·L^-1卡那霉素的双抗性LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.6，加入L-阿拉伯糖至终浓度为0.2 g·L^-1，20 ℃继续振荡培养20 h后离心收集菌体，以不加L-阿拉伯糖诱导的表达菌株作为对照。超声破碎菌体细胞，离心去除细胞碎片后，所得上清即为含重组酶Cel5G的粗酶液。测定β-1,4葡聚糖内切酶的表达量及其活性，结果显示，共表达cel5G基因和araC基因后，未诱导的酶活力仅为诱导后酶活力的5%，说明araC基因产物可以有效地阻遏P_16S-B启动子的转录活性，进一步说明DNA环的形成在一定程度上提高了阻遏的水平。

<110>南京农业大学

<120>一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体

<160>6

 

 

<210>1

<211>143

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>rRNArrnBP1嵌合启动子P_16S-2

<400>1

gcatgcattggttgaatgttgcgcggtcagaaaattattttaaatttcctcttgtcaggc60

cggaataactccctataatgcgccaccaattgtgagcggataacaattcccttgtttaac120

tttaagaaggagatatacatatg                                        143

 

 

<210>2

<211>261

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>rRNArrnBP1嵌合启动子P_16S-B

<400>2

gcatgctcaggtaggatccgctaatcttatggataaaaatgctaatggcaatgacgccag60

gagctgaacaattattgcccgttttacagcgttacggcttcgaaacgctcgaaaaactgg120

cagttttaggctgatttggttgaatgttgcgcggtcagaaaattattttaaatttcctct180

tgtcaggccggaataactccctataatgcgccaccactgacacggaacaacggcaaacta240

tggacaattggtttctctaga                                          261

 

<210>3

<211>91

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增P_16S-2的重叠PCR上游引物序列

<400>3

gcatgcaattgtgagcggataacaattattggttgaatgttgcgcggtcagaaaattatt 60

ttaaatttcctcttgtcaggccggaataact                                91

 

 

<210>4

<211>92

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增P_16S-2的重叠PCR下游引物序列

<400>4

catatgtatatctccttcttaaagttaaacaagggaattgttatccgctcacaattggtg 60

gcgcattatagggagttattccggcctgacaa                               92

 

 

<210>5

<211>64

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增P_16S-B的PCR上游引物序列

<400>5

gcatgctcaggtaggatccgctaatcttatggataaaaatgctaatggcaatgacgccag 60

gagc                                                              64

 

 

<210>6

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增P_16S-B的PCR下游引物序列

<400>6

tctagagaaaccaattgtccatagtttgccgttgttccgtg                     41