一种来源于肝转移灶的大肠癌细胞系CJF及其构建方法

摘要

本发明提供了一种来源于肝转移灶的大肠癌细胞系CJF及其构建方法，所述细胞系由如下方法获得：取大肠癌肝转移灶的组织，用胶原酶/透明质酸酶消化成单细胞后，MACS分选出CD133+细胞接种于NOD/SCID鼠皮下，成瘤后取出肿瘤组织，经体外培养获得可稳定传代的富含大肠癌干细胞的大肠癌细胞系CJF。本发明CJF细胞是从结肠癌人肝转移灶取材的，对大肠癌肝转移的研究有其他大肠癌细胞系无法比拟的优点；本发明CJF细胞稳定表达CD133+的细胞亚群约为10％，这株细胞系在大肠癌肝转移过程及肿瘤干细胞在转移机制中的作用研究具有广泛的应用前景。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种来源于肝转移灶的大肠癌细胞系CJF及其构建方法。

(二)背景技术

大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是常见恶性肿瘤之一，在发达国家发病率居恶性肿瘤第三位，死亡率居第二位。我国结直肠癌发病率居第三位且呈上升趋势，死亡率居第五位。侵袭和转移是影响大肠癌患者治疗失败和致死的主要原因，其中最常见的转移部位是肝脏，因此大肠癌的肝转移机制是当今肿瘤研究的重要课题。近年认为肿瘤干细胞具有自我更新及多向分化潜能的一类未分化的细胞群体，研究表明，大多数细胞处于G₀/G₁期，表达多种耐药基因，所以对多种化疗药物不敏感，传统的肿瘤化疗药物只能消灭大部分的非肿瘤干细胞而不能杀灭肿瘤干细胞，这些残存的细胞是肿瘤复发、转移和治疗失败原因。可见，消灭肿瘤干细胞是预防复发和转移的关键。这就需要我们深入研究在肿瘤发生发展过程中，调控肿瘤干细胞的自我更新、分化及肿瘤细胞远处转移的生物学机制。

近年来根据细胞表面的某些特异标记，陆续鉴定出一些实体瘤的干细胞或干细胞样细胞。O’Brien在大肠癌中利用CD133+作为肿瘤干细胞分子标记，成功分离出CD133+的肿瘤细胞具有很强的成瘤能力，100～1000个肿瘤细胞就能在免疫缺陷鼠皮下成瘤，而相同数量的CD133-则不能成瘤。目前认为肿瘤细胞CD133+是大肠癌干细胞的特异性标记之一。

但是自从发现大肠癌干细胞至今，还没有建立一个很好的肿瘤干细胞的研究平台，国内外均无富含大肠癌干细胞的人大肠癌细胞系的建立的报道，极大阻碍了大肠癌干细胞在大肠癌的复发和转移相关机制的研究。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种来源于肝转移灶的富含大肠癌干细胞的人大肠癌细胞系，为大肠癌干细胞的研究建立良好的实验平台，有助于对大肠癌的发生机制、转移复发、已及大肠癌干细胞的治疗进行深入的研究。

本发明采用的技术方案是：

一种来源于肝转移灶的大肠癌细胞系CJF，由如下方法获得：取大肠癌肝转移灶的组织，用胶原酶/透明质酸酶消化成单细胞后，MACS分选出CD133+细胞接种于NOD/SCID鼠皮下，成瘤后取出肿瘤组织，经体外培养获得可稳定传代的富含大肠癌干细胞的大肠癌细胞系CJF。

具体的，大肠癌细胞系CJF为人结肠癌肝转移细胞CJF，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No：C 200956，保藏日期：2010年01月26日。

本发明利用人大肠癌肝转移病变组织，通过分选出CD133+细胞接种至NOD/SCID鼠皮下，再从NOD/SCID鼠取材，采用体外培养结合动物体内再接种生长方式交替进行，建立来源于大肠癌肝转移灶的富含大肠癌干细胞的细胞系CJF，为大肠癌的研究特别是大肠癌的干细胞相关研究及肿瘤的转移提供了适宜的实验材料。

本发明还涉及构建所述大肠癌细胞系CJF的方法，所述方法包括：取大肠癌肝转移灶的组织，用胶原酶/透明质酸酶消化成单细胞后，MACS分选出CD133+细胞接种于NOD/SCID鼠皮下，成瘤后取出肿瘤组织，经体外培养获得可稳定传代的富含大肠癌干细胞的大肠癌细胞系CJF。

具体的，所述方法如下：

(1)取大肠癌肝转移灶的组织，用胶原酶/透明质酸酶消化成单细胞；

(2)步骤(1)消化获取的细胞用CD133磁珠孵育30min，然后通过MACS分选柱，用PBS将被吸附的CD133+细胞从分选柱上冲洗至收集管中，离心弃去上清，取沉淀重悬至无血清的RPMI1640中，接种至4～5周龄的NOD/SCID鼠皮下，接种后的NOD/SCID鼠培养在标准SPF环境中；

(3)NOD/SCID鼠移植瘤生长至直径为2cm左右时，颈椎离断法处死小鼠，无菌条件下分离出肿瘤组织，胶原酶消化后制成单细胞悬液；

(4)取步骤(3)单细胞悬液进行体外扩增培养：先将细胞接种到RPMI1640培养基，培养3～5天后，将培养基吸去后，加入新鲜RPMI1640培养基继续培养，当培养至细胞长满瓶底约70％时，吸去培养基，加入胰蛋白酶消化液，置于37℃消化，在倒置显微镜下观察，待细胞变圆、脱壁时终止消化，离心，取沉淀加入新鲜RPMI1640培养基继续扩大培养，每隔3～4天更换1/2的RPMI1640培养基，细胞长满瓶底的80％～90％时消化传代，，体外培养到20代以后，细胞生长稳定，即获得稳定传代的富含大肠癌干细胞的大肠癌细胞系CJF。

本发明公开了一种来源于肝转移灶的富含大肠癌干细胞的细胞系及构建方法，其有益效果主要体现在：1、CJF细胞是从结肠癌人肝转移灶取材建立的细胞系，具有大肠癌细胞肝转移特殊表型，对大肠癌肝转移机制提供了适宜的材料；2、CJF细胞稳定表达CD133+的细胞亚群约为10％，这株细胞系在大肠癌肝转移过程及肿瘤干细胞在转移机制中的作用研究具有广泛的应用前景；3、在原代培养时期，由于肿瘤细胞经历一个从体内到体外微环境的改变过程，肿瘤细胞不容易存活，在一般体外培养条件下要使肿瘤细胞传代是非常困难的，本发明使用了磁珠分选的方法分离出CD133+细胞，接种NOD/SCID鼠皮下，能有效的提高成瘤率，从而能使其获得永生性的可能大大增加，经过体外稳定传代20代以后，一般培养条件就能使细胞存活并传代。

(四)附图说明

图1：分选出原代CD133+细胞接种NOD/SCID鼠皮下后形成移植瘤。

图2：第20代CJF细胞消化成单细胞悬液，在RPMI1640(II)培养条件下生长14天后，悬浮克隆球形成。

图3：悬浮克隆球在含10％胎牛血清RPMI1640(I)培养基条件分化。

图4：CJF细胞的染色体核型分析，大部分细胞呈48条染色体，部分细胞呈四倍体。

图5：CJF细胞的生长曲线图，在含10％胎牛血清的RPMI1640(I)条件下，细胞群体倍增时间为48小时。

图6：第20代CJF细胞CD133+的细胞亚群流式图，该细胞系中CD133+细胞组分为10％，曲线A为同型对照，曲线B为CD133+染色。

图7：第20代CJF细胞接种于0.5％软琼脂软琼脂克隆形成图。

图8：CD133+细胞与CD133-细胞成瘤能力对照图，黑色箭头为CD133+细胞成瘤，白色箭头为CD133-细胞未成瘤。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

一、材料

1.细胞培养液的配制方法

1.1培养液RPMI1640(I)组成如下：10％(v/v)胎牛血清(杭州四季青公司)，4ug/ml胰岛素，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素，溶剂为RPMI1640(1∶1)培养基(美国GIBCO公司)；

培养液RPMI1640(II)组成如下：20ng/ml B27(美国SIGMA公司)，20ng/mlEGF(美国SIGMA公司)，10ng/ml bEGF(美国SIGMA公司)，4ug/ml胰岛素，100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素，溶剂为RPMI1640(1∶1)培养基(美国GIBCO公司)。

1.2消化液：含0.1％(w/v)胶原酶和0.1％(w/v)透明质酸酶的RPMI1640培养基。

2.其他细胞培养材料

细胞筛；胰酶消化液：0.25％(w/v)胰酶+0.02％(w/v)EDTA溶液；细胞冻存液(FBS∶DMSO＝9∶1)；PBS缓冲液；

3.标本来源

浙江大学医学院附属第二医院肿瘤外科患者陈某某(住院号553705)，43岁，术前征得患者本人同意，签署知情同意书，术中切除的大肠癌肝转移标本。术后病理诊断为肝左外侧叶转移性中分化腺癌伴大片坏死(病理号2008-20226)。

4.实验动物

NOD/SCID鼠，鼠龄为4～5周，由中国科学院上海斯莱克实验动物中心提供。

二、方法

从人结肠癌肝转移灶中分别取材，采用消化法获取癌细胞，通过磁珠分选方法分选CD133+细胞接种NOD/SCID鼠进行体内培养，肿瘤细胞体外传代培养等步骤建立一株能在体外稳定传代的细胞系，具体方法如下：

1.肝转移灶癌细胞的获取

将新鲜大肠癌肝转移组织用眼科剪去除坏死组织，用含5倍浓度双抗(添加500u/ml青霉素和500ug/ml链霉素)PBS冲洗4次后剪成约1mm³大小，用含0.1％的胶原酶和0.1％的透明质酸酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的RPMI1640培养基在37℃下消化2小时，用40um孔径的细胞筛过滤，除去未消化组织，在滤液中加入PBS液3ml，1000rpm离心5min，弃去上清，用PBS液漂洗重悬于RPMI1640培养基，待进一步处理。

2.分选CD133+细胞接种NOD/SCID鼠进行体内培养

消化获取的原代细胞用CD133磁珠孵育(Miltenyi-Biotec GmbH，Germany)30min，然后使细胞悬液通过置于分选器上的MACS分选柱，再将分选柱撤出分选器，用PBS将被吸附的CD133+细胞从分选柱上冲洗至收集管中，1000rpm离心5min，弃去上清，重悬至200ul的RPMI1640培养基中，接种至4～5周龄的NOD/SCID鼠皮下，NOD/SCID鼠培养在标准SPF环境(参考《实验动物环境及设施》GB14925-2001)中，每周观察肿瘤生长情况，测量肿瘤直径大小。

3.肿瘤细胞体外传代

NOD/SCID鼠移植瘤生长至直径约2cm大小时，颈椎离断法处死小鼠，无菌条件下分离出肿瘤组织，胶原酶消化后制成单细胞悬液，肿瘤细胞体外扩增培养。

具体方法如下：先将细胞接种到培养瓶，培养3～5天后，部分肿瘤细胞凋亡，出现一些生长旺盛的“细胞岛”，将培养基吸去后，加入新鲜培养基继续培养。当培养至细胞长满瓶底约70％时，吸去培养基，加入2ml胰蛋白酶消化液，置于37℃消化，在倒置显微镜下观察，待细胞变圆、脱壁，加入含血清的RPMI1640(I)终止消化，1000rpm离心5min，加入新鲜RPMI1640(I)培养基继续扩大培养。

根据细胞的状态及培养液颜色的变化，每隔3～4天更换1/2的培养液(I)培养基，细胞长满瓶底的80％～90％即应及时消化传代，传代比率1∶2，接种细胞密度为5×10⁵/瓶。冻存体外培养到20代以后，细胞生长稳定。

三、实验结果

一)来源于肝转移灶的大肠癌细胞在体外连续传代半年多，目前已传至60多代，命名为CJF细胞(CCTCC No：C 200956)。

具体如下：

1.原代大肠癌细胞的获取

大肠癌肝转移组织经过消化后，获得单细胞悬液。

2.大肠癌细胞CD133+分选后接种NOD/SCID鼠体内扩增

获得的细胞悬液用MACS方法分选出CD133+细胞，全部接种至NOD/SCID鼠皮下，约2两周后形成直径0.5cm的肿瘤，6周后直径约2.0cm(图1)。

3.肿瘤细胞体外传代培养

经过体外扩增的肿瘤细胞，经过胰酶消化后，在一个底面为25cm²的培养瓶中培养，前15天，待细胞长至80％，按1∶2传代。此后细胞生长开始加速，每隔3天传代一次，传代比率为1∶3～4，培养液为RPMI1640(I)，目前已在体外传代培养约60余代。

二).细胞生物学特性

1.形态学

细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI1640(I)培养2天后，倒置显微镜下观察大多细胞呈梭形，胞浆丰富，核大，圆形，核仁多个而明显。消化成单细胞悬液后，在RPMI1640(II)中下培养7天，单细胞长成致密球形直径约0.1～0.3mm的团块细胞，肿瘤细胞呈球状悬浮生长，与文献描述相同(图2)。细胞球在含10％胎牛血清的RPMI1640(I)培养7天后贴壁生长，重新分化成梭形细胞(图3)。

2.染色体核型分析

挑选染色体分散良好的100个中期的分裂像细胞进行核型分析。统计显示，细胞染色体大部分成48条，其中3号、5号染色体呈三倍体，2号染色体有畸变，少部分细胞染色体呈四倍体(图4)。

3.细胞动力学

细胞生长曲线的绘制

CD133+细胞与CD133-细胞在含10％胎牛血清的RPMI1640(I)培养基中的生长曲线(图5)。利用半高度阀计算细胞群体倍增时间为48小时。

4.肿瘤干细胞标志物检测

第20代CJF细胞用流式细胞仪检测CD133+比例为10％(曲线A为同型对照，曲线B代表CJF细胞CD133+标记)。

5.冻存与复苏

冻存后的细胞复苏，细胞的存活率约为70％，活细胞培养状态良好。

6.克隆形成率

第20代CJF细胞接种于下层含0.5％软琼脂，上层含0.2％软琼脂的24孔板，每孔1000个细胞，37℃培养箱中培养21天，倒置显微镜观察计数克隆形成数目，通过计算得到肿瘤细胞的克隆形成率为21±4％(图7)。

7.异体成瘤

接种相同数量CD133+(黑色箭头)和CD133-(白色箭头)细胞至NOD/SCID小鼠皮下，观察肿瘤形成。2000个CD133+有肿瘤生长，而CD133-处未见肿瘤生长(图8)。10000个CD133-也可见肿瘤生长，但比相同数量的CD133+细胞形成肿瘤晚，而且体积小。