一种适用于猪骨骼肌基因表达的启动子的分离克隆及核心区域的鉴定

摘要

本发明属于动物基因工程领域。从猪基因组中克隆了一个猪骨骼肌特异表达基因上游七个不同长度的启动子Six1-P、P1、P2、P3、P4、P5与P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1；2；3；4；5；6；和7所示，序列长分别为1692、180、530、844、1143、1135和1494bp。对猪Six1基因不同长度的启动子片段在三种真核细胞中的活性分析表明，猪Six1基因的启动子是一个肌肉特异性的启动子，除P1启动子外其它几个启动子P2、P3、P4、P5与P6均具有启动基因表达的能力，并且在P2、P3、P4、P5与P6这5个启动子中，除P2外，其它几个启动子均表现出肌肉特异性。本发明公开了这七个启动子及其相应表达载体的制备方法，以及利用双荧光素酶报告系统对猪Six1基因启动子活性的鉴定。

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种适用于猪骨骼肌基因表达的启动子的分离克隆及核心区域的鉴定。

背景技术

基因的表达(gene expression)是指从DNA到蛋白质的过程，而对这个过程的调节称为基因的表达调控。而基因的表达调控是一个多层次的复杂过程，受不同的调节因素控制。它是通过多阶段水平的调节来实现的，即转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平的调控。高等生物的生长发育就是由不同基因在时间和空间上的有序表达和协同作用实现的，而在此过程中基因表达的开启、关闭、表达部位、表达量的高低等都将会受到各阶段水平的精细控制。基因表达在高等生物中虽然是一个多级调控系统，但转录作为基因表达调控中的第一个具有高度选择性的环节，是基因表达调控中最关键的环节，而启动子作为转录水平上的一个重要顺式元件，是驱动基因的转录所必需的。因此，深入研究启动子的结构、功能、作用模式等对于回答分子生物学中的一些基本理论问题具有重大意义(Hochheimer & Tjian，2003；Smale，2001；Wray et al.，2003)。

启动子(promoter)是指一段能使基因进行转录的DNA序列，在真核生物中，根据启动子所结合的RNA聚合酶不同可分为三种不同的启动子，即rRNA基因启动子(I型)、mRNA基因启动子(II型)和tRNA基因启动子(III型)。而II型启动子相对复杂，主要包括TATA框或起始子(initiator)核心元件，核心元件能够保证转录的精确起始，同时也可影响转录的速率；以及CAAT框、GC框和等上游调控元件，这些元件在结构上并不恒定，在位置、序列、距离和方向都不完全相同，它们能够与不同的转录因子结合，从而对基因的表达起调控作用；有的还存在远距离的调控元件，如增强子(enhancer)、减弱子(dehancer)等，这些远端调控元件对启动子的转录活性起调节。

另外，根据启动子作用的方式及功能不同可以大致分为四类：即组成型启动子(constitutive promoters)、诱导型启动子(inducible promoters)、组织或发育阶段特异型启动子(tissue-specific or developmental-stage-specific promoters)和合成性启动子(synthetic promoters)。结构基因在组成型启动子的调控下，其表达不具有时间、空间与强度间的明显差异；结构基因在诱导型启动子的调控下，如果存在某些特定的物理或化学信号的刺激下，其转录水平将会发生显著的变化；如果结构基因在组织或发育阶段特异性启动子的启动子的调控下，基因往往只在某些特定的组织器官中表达，并表现出发育调节的特性。

随着基因工程的飞速发展，如何使外源基因按照人们的意愿正确、高效和稳定的在生物体内表达成为研究的热点。启动子作为基因表达调控系统中转录调控水平上的一个重要调控元件，它们是基因进行转录的必要元件。因此，发现一些重要的特异性的或特定条件能诱导的启动子，并利用它们构建一系列能够高效表达外源基因的表达载体，同时结合转基因技术将这些外源基因导入生物体内，培育出能够完全按照人们的设计初衷来表达外源基因的动植物新品种或新品系成为现代分子育种的最终落脚点。因此，鉴定大量的各具特色的诱导型启动子与组织或发育阶段特异型启动子在动植物的遗传改良中具有十分重要的意义。

目前为止，在植物基因工程领域以及人类疾病的基因治疗领域已鉴定了许多特异性的启动子，植物育种工作者将这些特异性的启动子已逐渐应用到植物的遗传改良中，并取了显著的成效(Buchner，Rochat，Wuilleme，& Boutin，2002；Rossak，Smith，& Kunst，2001；Sandhu et al.，2000；Vasconcelos et al.，2003；Wu，Suzuki，Washida，& Takaiwa，1998)；而在基因治疗领域，科研工作都正在将一些组织特异性的启动子应用到各种疾病的治疗中(Bauerschmitz et al.，2008；Boulaire，Balani，& Wang，2009；Dae et al.，2009；Huang et al.，2010；Tominaga et al.；Tu，Liu，Huang，Mo，& Yang，2009；Yao et al.，2009)。而特异性启动子在动物基因工程领域中的鉴定与应用具有很大的局限性，一方面是由于目前所鉴定的很有价值的靶基因少，另一方面就是可利用的诱导型启动子与组织或发育阶段特异型启动子甚少，所构建的表达外源基因的载体，利用转基因技术导入动物体内之后，外源基因很难按照人们的意愿表达。与植物基因工程领域及人类疾病研究领域相比，特异性启动子在动物基因工程领域的应用相对滞后，但也取得了一定的进展(Costessi，Devescovi，Baralle，& Muro，2006；Coulon et al.，2007；Heidt & Black，2005；Pacak，Sakai，Thattaliyath，Mah，& Byrne，2008；Park et al.，2009)。随着动物基因工程的蓬勃发展，特异性启动子在动物基因工程领域定会得到广泛的应用。

肉类是人类营养的主要来源，而猪肉在所有肉类消费中所占的比例是最大的。随着社会的发展与人们生活水平的提高，人们对肉类的消费观念已由原来的对量的追求向质的追求转变。过去的几十年里，传统的育种方法在提高猪的生长速度，瘦肉率以及饲料转化率等方面发挥了积极重要的作用，并取得了显著的成绩，育种计划相当成功。但同时随着对高生长率与高瘦肉率的强度选择导致了猪肉品质的严重下降，特别是导致了肌肉脂肪的大幅度下降，肌纤维增粗(快肌比例增加)，劣质猪肉的大量涌现。因此，对猪肌肉特异表达启动子的分离克隆及深入研究，不仅有助于阐明肌肉品质形成的分子机制，还可以指导转基因育种，将能促进肌内脂肪形成，促进慢型肌纤维形成的优良靶基因构建到含肌肉特异表达启动子的载体中，然后通过转基因技术将目的基因导入猪体内，培育出高肌肉脂肪、高品质肌纤维的优质转基因新品种猪，从而可以大大改善猪肉品质，创造巨大的经济效益和社会效益，更好的为人类生产生活服务。应用基因工程技术来改良猪肉品质不失为一个科学有效的方法。本发明就是利用相关的分子生物学技术，从梅山猪基因组中分离克隆了同一个猪肌肉特异表达基因上游不同长度的启动子区域，将不同长度的启动子构建到含luc+的pGL3-Basic载体中，并将这些构建的缺失载体转入三种真核细胞系，通过检测不同长度的启动子片段所驱动的luc+报告基因的活性来确定控制表达模式的核心区域。

发明内容

本发明的目的在于克服猪基因工程研究中的肌肉组织特异表达启动子数目不足的问题，从中国地方猪种“梅山猪”基因组中分离克隆并鉴定出具一种适用于猪骨骼肌基因表达的启动子，有望将这些启动子用于猪的基因工程改良中。在本发明中，申请人扩增了猪Six1-180、Six1-530、Six1-844、Six1-1143、Six1-1335和Six1-1494共6个不同长度的启动子缺失片段。然后将这些启动子缺失片段插入pGL3-Basic载体中，对不同长度启动子的活性进行了鉴定，为日后该启动子在猪育种的应用奠定了基础。本发明是这样实现的(技术路线见图1)：

在人与鼠上的研究表明，Six1基因是一个与肌肉发育紧密相关的基因(Grifone et al.，2004；Laclef et al.，2003；Spitz et al.，1998)，申请人初步将猪Six1基因作为猪骨骼肌基因表达的启动子的侯选基因，然后利用反转录PCR(以下简称RT-PCR)方法分析了猪Six1基因在不同组织中的表达情况，结果表明猪Six1基因在骨骼肌中的表达量明显高于其它所检测的组织。接下来，申请人利用美国国家生物技术信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的猪基因组序列信息获得了该基因的启动子序列，并设计特异扩增引物分离克隆了猪Six1基因的启动子序列，将该启动子序列命名为Six1-P序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。然后以所获的Six1-P序列为模板设计了6对扩增不同长度的启动子序列的缺失引物，将所扩增的不同长度的启动子序列命名为P1、P2、P3、P4、P5与P6，它们的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示，它们分别是由启动子Six1-P截短的核心区180bp、530bp、844bp、1143bp、1335bp与1494bp的序列。然后，将所扩增的不同长度的启动子序列构建到与luc+融合的pGL3-Basic启动子载体转染真核细胞，通过检测不同长度启动子所驱动的luc+报告基因的活性来确定控制表达模式的核心区域。实验结果表明，除P1外其它五个片段均具有独立的启动基因表达的功能。

本发明的具体步骤是：

首先通过大量的查找文献资料，根据以往文献所报道的Six1基因的生理生化功能，初步将猪Six1基因是一个影响猪肌肉生长发育的重要侯选基因。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)工具从猪的EST数据中调取同源性序列，筛选与之同源性大于80％的猪EST，并进行EST序列拼接，所拼接的序列即为猪的mRNA，然后以拼接的序列为模板设计引物进行PCR，分离克隆了猪Six1基因的全长mRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。以所获得的猪Six1基因的mRNA序列为模板，设计了1对检测猪Six1基因表达的定量引物，利用反转录PCR(以下简称RT-PCR)方法分析了猪Six1基因在不同组织中的表达情况，结果表明猪Six1基因在骨骼肌中的表达量明显高于其它所检测的组织。接下来，申请人同样利用美国国家生物技术信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的猪基因组序列信息，以所获得的猪的mRNA为信息探针，通过同源序列比对，在猪的基因组数据中获得了该基因的启动子序列，并设计了2对特异性引物(其编号分别为SP5F，SP5R和SP3F和SP3R)扩增猪Six1基因启动子，在此基础之上，通过一个融合PCR技术将SP5F，SP5R和SP3F、SP3R所扩增的序列融合在一起，获得一条完整的启动子序列，将其命名为Six1-P序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列全长为1692bp，并将这条序列克隆到pMD18-T载体上(附图8所示)。与此同时，申请人以所获得的Six1-P序列为模板设计了6对扩增不同长度的启动子序列的缺失引物，以克隆到pMD18-T载体上的Six1-P序列为模板，扩增不同长度的启动子序列，并命名为P1、P2、P3、P4、P5与P6，分别是序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示的序列，它们分别是由启动子Six1-P截短的核心区180bp、530bp、844bp、1143bp、1335bp、1494bp的序列。然后，将所扩增的不同长度的启动子序列构建到与luc+融合的pGL3-Basic启动子缺失载体转染真核细胞，通过检测不同长度启动子所驱动的luc+报告基因的活性来确定控制表达模式的核心区域。为了提高实验的可靠性，申请人同时利用了2个物种的三种细胞进行实验，实验结果表明，除P1外其它五个片段在所用的三种细胞中均具有独立的启动基因表达的功能。

本发明的优点在于：

(1)本发明首次分析了猪Six1基因在不同组织的表达情况，鉴定了该基因适用于猪骨骼肌基因表达的启动子序列Six1-P，以及控制基因表达量以及表达模式的核心启动子区。为猪基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。

(2)本发明同时利用多种真核生物的细胞系进行了验证，提高了实验的可靠性与真实性，所鉴定的核心启动子可直接应用到猪转基因工程和分子育种。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪骨骼肌基因表达启动子Six1-P的核苷酸序列，其长度为1692bp。

序列表SEQ.ID.NO：2是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆所得到的作为另一个启动子P1应用的核苷酸序列，其长度为180bp。

序列表SEQ ID NO：3是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子P2应用的核苷酸序列，其长度为530bp。

序列表SEQ ID NO：4是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子P3应用的核苷酸序列，其长度为844bp。

序列表SEQ ID NO：5是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子P4应用的核苷酸序列，长度为1143bp。

序列表SEQ ID NO：6是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子P5应用的核苷酸序列，其长度为1335bp。

序列表SEQ ID NO：7是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子P6应用的核苷酸序列，其长度为1494bp。

序列表SEQ ID NO：8是本发明克隆的猪肌肉特异表达启动子Six1-P在基因组中所驱动的基因(Genbank登录号为：GU225952)编码的氨基酸序列，编码284个氨基酸。

图1：是本发明的技术路线图。

图2：利用RT-PCR的方法来分析启动子Six1-P在基因组中所驱动的基因(Genbank登录号为：GU225952)在不同组织中的表达模式。

图3：是本发明中利用SP3F、SP3R引物对所扩增的猪Six1基因的部分启动子序列电泳检测图。图中：泳道M：DNA分子标准(DL2000 ladder)。

图4：是本发明中利用SP5F、SP5R引物对所扩增的猪Six1基因的部分启动子序列电泳检测图。图中：泳道M：DNA分子标准(DL2000 ladder)。

图5：是本发明中利用SP5F，SP5R和SP3F、SP3R所扩增的序列融合在一起所获得一条完整的猪的启动子序列电泳检测图。图中：泳道M：DNA分子标准(DL2000 ladder)。

图6：是本发明中利用6对缺失引物从启动子Six1-P序列中所扩增的猪Six1基因的不同长度的启动子序列电泳检测图。图中：1为Six1-P序列；2，3，4，5，6，7分别为P6、P5、P4、P3、P2、P1启动子缺失片段；泳道M：DNA分子标准(DL2000 ladder)。

图7：是本发明中所构建的猪Six1基因的6个不同长度的启动子序列pGL3-Basic双荧光素酶报告载体双酶切电泳检测图。图中：1为双荧光素酶报告载体pGL3-Basic空载体双酶切图；2，3，4，5，6，7分别为插入了P6、P5、P4、P3、P2、P1启动子缺失片段的pGL3-Basic双荧光素酶报告载体双酶切图；泳道M：DNA分子标准(DL2000 ladder)。

图8：是本发明中用于克隆的T载体结构示意图。

图9：是本发明中用于分析猪Six1基因的不同长度的启动子活性的pGL3-Basic双荧光素酶报告载体结构示意图。

图10：是本发明中所用的pGL3-Control阳性对照载体结构示意图。

图11：是本发明中用于分析猪Six1基因的不同长度的启动子活性所用的pRL-TK内参载体结构示意图

图12：是本发明猪Six1基因的6个不同长度的启动子序列P1，P2，P3，P4，P5，P6启动子在小鼠成肌细胞与小鼠胚胎成纤维细胞两种真核细胞中的活性分析比较。图中：pGL3-Control为阳性对图；pGL3-Basic为阴性对。结果用最小二乘均值±标准差(LSM±SD)表示。显著水平用T检验方法时行检测，图中^**表示P≤0.01；^*表示P≤0.05。

图13：是本发明猪Six1基因的6个不同长度的启动子序列P1，P2，P3，P4，P5，P6启动子在小鼠成肌细胞与猪肾细胞两种真核细胞中的活性分析比较。图中：pGL3-Control为阳性对图；pGL3-Basic为阴性对。结果用最小二乘均值±标准差(LSM±SD)表示。显著水平用T检验方法时行检测，图中^**表示P≤0.01；^*表示P≤0.05。

图14：是本发明克隆的猪Six1基因启动子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO：1所示的序列，该片段大小为1692bp。图中下划线为正、反向引物。

图15：是本发明克隆的猪Six1基因启动子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO：2所示的序列，该片段大小为180bp，图中下划线为正、反向引物。

图16：是本发明克隆的猪Six1基因启动子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ IDNO：3所示的序列，该片段大小为530bp，图中下划线为正、反向引物。

图17：是本发明克隆的猪Six1基因启动子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO：4所示的序列，该片段大小为844bp，图中下划线为正、反向引物。

图18：是本发明克隆的猪Six1基因启动子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO：5所示的序列，该片段大小为1143bp，图中下划线为正、反向引物。

图19：是本发明克隆的猪Six1基因启动子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO：6所示的序列，该片段大小为1335bp，图中下划线为正、反向引物。

图20：是本发明克隆的猪Six1基因启动子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO：7所示的序列，该片段大小为1494bp，图中下划线为正、反向引物。

图21：是本发明克隆的猪Six1基因的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO：8所示的序列，该片段大小为2201bp，图中下划线为Six1基因半定量正、反向引物。

具体实施方式

实施例1：猪肌肉特异表达候选基因(Genbank登录号为：GU225952)在不同组织中的表达谱验证

1.主要试剂：Taq DNA聚合酶(Fermentas公司产品)、dNTP(Roche公司，4738284001)、DL-2000 Marker(广州东盛生物科技有限公司)、AC柱式快捷型琼脂糖DNA回收试剂盒(Bio Teke公司产品，DP1701)；总RNA提取试剂为Trizol Reagent(Invitrogen公司产品，Cat no：15596-026)；ReverTra Ace  qPCR RT Kit(TOYOBO公司产品，Code no：FSQ-101)反转录试剂盒。

2.组织样品：采集了4月龄中国地方猪种“梅山猪”的心、肝、脾、肺、肾、胃、骨髓、膀胱、子宫、卵巢、睾丸、附睾、背脂、脑、小肠、淋疤结、皮肤、背最长肌、腹脂、股二头肌20个组织样，样品采集后迅速置于液氮中，然后于-80℃保存，以备总RNA的提取。

3.半定量引物设计：

首先以人的Six1基因cDNA为信息探针，利用美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)工具从猪的EST数据与HTGS数据库中调取同源性序列，采用Primer 5.0软件设计引物对扩增猪Six1基因，其Genbank登录号为GU225952。然后以所获得的猪Six1基因的序列为模板，设计了1对跨内含子的半定量引物(Six1-5F：CGTGTTGCGGGAGTGGTA，Six1-5R：TGCTTGTTGGAGGAGGAGTT，扩增的片段大小为189bp)。与此同时，申请人还设计了1对跨内含子的内参基因β-actin引物(β-actin-F：CCAGGTCATCACCATCGG，β-actin-R：CCGTGTTGGCGTAGAGGT，扩增的片段大小为158bp)。

4.猪组织总RNA的提取与cDNA的合成：

各组织总RNA的提取采用Invitrogen公司的Trizol Reagent试剂盒，按照该试剂盒的说明书进行操作，总RNA利用1.0％琼脂糖胶电泳来检测它的完整性(28S、18S两条主带清晰)，总RNA的纯度利用NanoDrop 2000 Spectrophotometer(美国NanoDrop公司)检测(OD260/OD280＝1.8-2.0)。总RNA质量合格后才进行后续试验。cDNA第一链的合成利用TOYOBO公司ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒进行，按该试剂盒的说明书操作。具体步骤如下：首先取1μg各组织总RNA溶液于200μl的灭菌小PCR管中，于65℃变性5min，使二级结构打开，然后立即置于冰上。然后分别加入4μl 5×RT buffer，1μl Primer Mix，1μl RT Enzyme Mix，再补Nuclease-free Water 20μl，于37℃逆转录15min，接着98℃进行5min酶灭活，反应结束后于-20℃保存。

5.猪Six1基因的组织表达分析：

以所合成的梅山猪20个组织样的第一链cDNA为模板，利用设计的检测目的基因Six1的半定量引物(Six1-5F和Six1-5R)进行PCR扩增，同时对进行纠正的猪的内参基因β-actin(DQ845171)进行扩增。PCR反应条件：94℃5min，94℃40sec，59℃40sec，72℃20sec，26或29个循环(制备目的基因Six1采用29循环，制备看家基因β-actin采用26个循环)，72℃10min。PCR产物经1.5％琼脂糖胶电泳检测。检测结果见附图2所示。结果显示，候选基因(Genbank登录号为GU225952)在骨骼肌中的表达量显著高于其它所检测的组织。

实施例2：猪肌肉特异表达启动子Six1-P及相应缺失片段的获取

1.主要试剂：

试验用的DNA提取试剂盒(购自Bio Teke公司，货号：DP1901)；TransEco FastPfu DNA Polymerase(购自北京全式金生物技术有限公司，货号：AP231)；2×GC Buffer(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号：DRR20GCI)、LA Taq聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号：DRR20BG)、dNTP(购自Roche公司，货号：47382001)、DL-2000 Marker(购自广州东盛生物科技有限公司)、AC柱式快捷型琼脂糖DNA回收试剂盒(购自Bio Teke公司，DP1701)、载体pMD18-T Vector(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号：D101A)等。

2.猪背最长肌组织基因组DNA的抽提：

本发明中的DNA提取采用Bio Teke公司的核酸提取试剂盒(Bioteke Corporation货号：DP1901，下述试剂均为该试剂盒自带)，具体方法如下：

(1)将“梅山猪”背最长肌组织在液氨中迅速研磨成细粉，取20-50mg细粉转移到1.5ml离心管中，加入200μL组织裂解液TL，用蓝枪头吹打均匀。

(2)加入20μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)，颠倒充分混匀。

(3)将裂解物放在55℃中水浴1-3小时，或者直到组织完全消化，期间轻柔振荡几次帮助裂解

(4)加入200μL结合液CB，剧烈颠倒，充分混匀，70℃放置10min。

(5)冷却后加入100μL异丙醇，剧烈摇动混匀。

(6)用蓝枪头去除不溶物，以免下面的不溶物堵塞离心柱。

(7)将上一步剩余的混合物加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，10,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液。

(8)加入500μL抑制物去除液IR，12,000r/min离心30s，弃废液。

(9)加入700μL漂洗液WB(确保该漂洗液是已经加入无水己醇的)，12,000r/min离心30s，弃掉废液。

(10)加入500μL漂洗液WB，12,000r/min离心30s，弃掉废液。

(11)将吸附柱AC放回收集管中，1于3,000r/min离心2min，尽量去除漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。

(12)取出AC吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间部位加入100μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，于室温下放置3-5min，12,000r/min离心1min，将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置5分钟，再12,000r/min离心1min。

将所提取的DNA于-20℃下可长期存放备用。

3.猪Six1基因启动子Six1-P片段的获取：

申请人首先利用美国国家生物技术信息中心即NCBI(见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的猪基因组序列信息，以所获得的猪的mRNA为信息探针，通过同源序列比对，在猪的基因组数据中获得了该基因的启动子序列，设计了2对特异性引物(其编号为SP5F，SP5R和SP3F、SP3R)扩增猪Six1基因的启动子片段，分别命名为AB与CD序列。检测结果见附图3与4所示

PCR反应体系：5μl 5×TransEco FastPfu Bμffer，0.5μl 10mM dNTP，0.5μl 10μM/L上下游引物(其编号为SP5F，SP5R和SP3F、SP3R)，2.5U/μl TransEco FastPfu DNA Polymerase 0.5μl，DNA 1μl，补灭菌超纯水至25μl。

PCR反应条件：95℃预变性2min；95℃变性20s；60℃退火40s；72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸5min；25℃保存。设计的引物见表1所示。

表1 本发明所设计的扩增启动子的引物序列信息

表1说明：下划线部分表示为KpnI酶切位点，阴影区部分表示保护碱基。

在此基础之上，申请人利用宝生物工程(大连)有限公司生产的LA Taq聚合酶通过一个融合PCR将SP5F，SP5R和SP3F、SP3R所扩增的序列融合在一起，获得一条完整的AD启动子序列，检测结果见附图5所示。具体操作步骤如下：

(1)配制融合PCR反应体系：12.5μl 2×GC Bμffer，0.5μl 10mM dNTP，0.25μl 5U/μl LA Taq Polymerase，以AB与CD PCR产物各1μl为模板，补灭菌超纯水至25μl。

(2)PCR产物的融合：94℃预变性4min；94℃变性40s；60℃退火80s；72℃延伸80s。

(3)加入反应引物：在反应体系中分别加入0.5μl 10μM/L SP5与SP3引物，轻轻混均。

(4)融合序列的获取：94℃预变性2min；94℃变性20s；60℃退火40s；72℃延伸140s；30个循环；72℃延伸10min；25℃保存。

PCR产物的回收纯化；PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下从琼脂糖凝胶上将含有目的片段的凝胶切下，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(货号：DP1701，购自北京百泰克生物技术有限公司)纯化PCR产物。

连接反应：将纯化的PCR产物与pMD18-T载体(购自TAKARA公司)连接，连接反应总体积是10μl，其中包括2.5μl 2×ligation buffer，0.3μl载体，7.2μl纯化PCR产物，4℃过夜连接。

转化：无菌状态下取50～100μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5～10μl的连接产物加入轻轻混匀，在冰上放置30min后42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后迅速冰浴3～4min，加入200μl无抗生素的LB培养液，37℃，220rpm/min温浴复苏45-60min。然后5000rpm/min离心5min，去除适量的上清，将剩余的菌体与培养基轻轻混匀，含氨苄青霉素(Amp)浓度为100μg/mL的平板上，涂匀，37℃正置培养1h后倒置培养，14-16小时后观察有无菌落长出。

阳性克隆子的鉴定及测序：从平板上挑取单克隆接入1.5mL含500μL氨苄青霉素(Amp)浓度为100μg/mL的LB培养液中，并于37℃摇床220rpm/min培养约4-6h左右。以菌液为模板，选用扩增启动子P1，P2，P3，P4，P5与P6特异性引物(表1所示)进行PCR扩增。电泳检测，挑取阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由北京奥科生物技术有限责任公司完成。测序结果显示所扩增的序列为猪Six1基因的启动子序列，将该启动子命名为Six1-P。

4.猪Six1基因启动子不同缺失片段的获取：

以所获得的Six1-P序列为模板设计了6对扩增不同长度启动子的缺失引物，6个5’缺失片段共用同一个下游引物，命名为PdR(该引物的序列见SEQ ID NO：19)。将上游引物分别命名为P1F、P2F、P3F、P4F、P5F与P6F，它们分别对应序列表中SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：14与SEQ ID NO：13所示的序列，上述引物以及相应的信息如表1所示。在每条上游引物5′端都引入KpnI酶切位点(以下划线部分表示)及相应的保护碱基(以阴影区表示)。而在下游引物PdR的5′端添加XhoI酶切位点(以下划线部分表示)及相应的保护碱基(以阴影区表示)。P1F、P2F、P3F、P4F、P5F与P6F所扩增的启动子片段的长度分别为180bp、530bp、844bp、1143bp、1135bp与1494bp，分别命名为P1、P2、P3、P4、P5与P6序列，它们分别对序列表中的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6与SEQ ID NO：7。

将含有Six1-P的阳性克隆扩大培养，并提取质粒，质粒命名为pMD18-T-Six1-P，然后以此质粒为模板，利用所设计的特异性缺失引物进行不同长度启动子的扩增。所扩增的不同长度的启动子片段电泳结果如图6所示。将所获得的不同长度启动子的PCR产物进行回收纯化、连接、转化、阳性克隆的筛选以及阳阳克隆测序，具体操作步骤如3.猪Six1基因启动子Six1-P片段的获取所述。然后将含有P1、P2、P3、P4、P5与P6序列的阳性克隆扩大培养，并提取质粒，质粒命名为pMD18-T-P1、pMD18-T-P2、pMD18-T-P3、pMD18-T-P4、pMD18-T-P5与pMD18-T-P6。

实施例3：猪肌肉特异表达启动子相应缺失片段转染载体的构建

1.主要试剂：

内切酶KpnI与XhoI(Fermentas，Cat.#ER0527/Cat.#ER0691)，质粒提取试剂盒OMEGA公司(OMEGA，Cat.D6950-01)，T4 ligase(Fermentas，Cat.#EL0334)，pGL3-Basic载体(Promega公司，Cat.#E1751)。

2.双荧光素酶报告载体pGL3-Basic双酶切

用KpnI、XhoI双酶切pGL3-Basic载体，双酶切体系20μl：2μl 10×Tang^TM Buffer，2μl KpnI，2μl XhoI，4μl pGL3-Basic载体，补灭菌超纯水至20μl。37℃过夜酶切。酶切产物用纯化试剂盒(DP1701，购自北京百泰克生物技术有限公司)回收纯化。回收产物置于-20℃冰箱保存。

3.含启动子相应缺失片段的TA克隆载体双酶切

用KpnI、XhoI双酶切pMD18-T-P1、pMD18-T-P2、pMD18-T-P3、pMD18-T-P4、pMD18-T-P5与pMD18-T-P6载体，双酶切体系20μl：2μl 10×Tang^TM Buffer，2μl KpnI，2μl XhoI，6μl含有目的片段的TA克隆载体，补灭菌超纯水至20μl。37℃过夜酶切。酶切产物用纯化试剂盒(DP1701，购自北京百泰克生物技术有限公司)回收纯化。回收产物置于-20℃冰箱保存。

4.重组载体的构建

将双酶切回收后的P1、P2、P3、P4、P5与P6启动子片段连入双酶切后的pGL3-Basic载体上，所构建的载体分别命名为pGL3-Basic-P1、pGL3-Basic-P2、pGL3-Basic-P3、pGL3-Basic-P4、pGL3-Basic-P5与pGL3-Basic-P6。连接体系20μl：2μl 10×Buffer，1μl 5U/μl T4 ligase，2μl双酶切的pGL3-Basic载体，10μlP1、P2、P3、P4、P5或P6启动子片段，补灭菌超纯水至20μl。22℃孵育10min，70℃加热5min。然后取10μl转化入大肠杆菌DH5α。利用PCR来检测阳性克隆，阳性克隆送北京奥科生物技术有限责任公司进行测序。序列经测序确认正确后，对阳性克隆进行扩大培养，并抽提质粒。质粒提取用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取，质粒纯度与浓度纯度利用NanoDrop 2000 Spectrophotometer(美国NanoDrop公司)检测，所测的样品的OD260/OD280值在1.8-2.0才可用于后续的实验。另外，所提取的质粒再次进行双酶切鉴定，双酶切鉴定结果如图7所示。双酶切鉴定结果显示所构建的重组载体正确。

实施例4：猪肌肉特异表达启动子相应缺失片段的活性分析

1.主要试剂与耗材：

主要试剂：胎牛血清(FBS，GBICO，16000-044)，DMEM液体(GBICO，C11995)，D-PBS干粉，0.25％trypsin-EDTA溶液(GBICO，Cat.No.25200)，Lipofectamine^TM 2000脂质体转染试剂(Invitrogen公司，Cat.No.11668-027)，Dual-LuciferaseReporter Assay System(美国Promega公司，Cat.#E 1910)。

主要耗材：细胞培养24孔板(美国Corning公司，Cat.No.3524)、细胞培养瓶、一次性塑料移液管、0.22μm孔径的一次性滤器、一次性针头注射器、封口膜(Parafilm公司，PM-996)、橡胶手套，酶标板(美国Corning公司，Cat.No.3590)

2.细胞培养

PBS配制：试验过程中也可以购买商品化的PBS干粉，直接按照要求兑超纯水，然后灭菌使用。

细胞培养基的配制：1×DMEM液体(GBICO，C11995)中加入10％FBS(GBICO，16000-044)(v∶v)，过滤除菌。

0.25％trypsin-EDTA溶液：本试验所用试剂为配制好的商品试剂(GBICO，25200)，用1.5mL离心管分装成300μl/管使用。

在进行脂质体转染实验前的头一天晚上，将细胞消化后用生长培养基将细胞密度稀释成1-4×10⁵个/ml，并取500μl细胞悬液接种到24孔培养板中，每个样品进行3个重复。

3.脂质体转染

(1)转染质粒的准备，将需要转染的插入了不同启动子片段的目的质粒均稀释成0.2μg/μl，将内参质粒稀释成0.02μg/μl，然后取1μg目的质粒与0.05μg内参质粒混合(20∶1的比例)，轻轻吹打均匀。同时分别取1μg pGL3-Basic和pGL3-Control与0.05μg内参质粒混合，分别用于阴性与阳性对照。

(2)将(1)中混后的质粒用50μl的Opti-MEM无血清培养基稀释，轻轻混匀，室温放置5min。

(3)取适量的Lipofectamine^TM 2000脂质体转染试剂，用50μl的Opti-MEM无血清培养基稀释，轻轻混匀，室温放置5min。转染试剂量按所取质粒的量而定，本发明中转染试剂∶质粒的比例为2.5∶1。

(4)将(2)中所稀释混合质粒与(3)中所稀释的脂质体转染试剂混合，并轻轻混匀，室温放置20min。

(5)在静置转染复合物的时候，将前天晚上接种到24孔板中的细胞培养基去掉，换上新鲜的Opti-MEM无血清培养基。

(6)取100μl(4)中准备的转染复合物轻轻加入24孔板中，轻轻晃动培养板使转染复合物均匀分布在细胞培养液中。

(7)将细胞培养板置于5％CO₂培养箱中37℃培养中培养，4-6h后换上含血清的新鲜的培养基继续培养，24h后时行细胞的收集。

3.荧光素酶活性测定

(1)试剂的配制

1×PLB(细胞裂解液)：利用1倍体积的5×Passive Lysis Buffer(PLB)细胞裂解液母液，加入4倍体积的灭菌的超纯水，轻轻混匀，裂解液现配现用。

LARII荧光素酶分析底物：荧光素酶分析底物为粉末，本发明中的产品为Cat.#E1910，直接试剂盒中的10ml荧光素酶分析缓冲液II(Luciferase Assay Buffer II)加入瓶装的LARII荧光素酶分析底物(Luciferase Assay Substrate)的粉末中，用移液枪轻轻混匀。-70℃可保存。

1×Stop & Glo Reagent试剂：50×Stop & Glo Substrate 用Stop & Glo Buffer稀释成1×Stop & Glo Reagent进行实验，此试剂现配现用。

(2)细胞的裂解

转染24h后收集细胞，先用PBS漂洗一次，然后加入配制好的100μl细胞裂解液(1×PLB)裂解细胞，室温摇晃15mim，然后转入1.5ml的离心管中。

(3)取10μl裂解加入酶标板中，利用PerkinElmer公司的VICTOR^TM X² Multilabel Plate Reader仪器进行双荧光素酶活性测定。

a.先打开电脑，然后开启仪器。

b.启动软件，选择Tool工具中的Dispenser maintenance进入一个设置界面。

c.选择Flush，用灭菌的超纯水同时对进样柱进行清洗，洗1-2次。

d.洗完后选择Empty对进样柱进行排空，然后单独对两个进样柱进行清洗，检测进行柱是否能够正常进样。

e.选择第一根进样柱，选择Fill，用LARII填满，并将回收杯中流出的LARII回收重新利用。

f.选择第二根进样柱，用Stop buffer填满，并将回收杯中流出的Stop buffer回收重新利用。

g.将准备好的加入了10μl细胞裂解液的酶标板放入Multilaber Reader中。

h.在软件主界面中选择进样方式，如自动进样则选择Auto-dual-luciferase。

i.然后在Sample界面中选择所需要测定的样品，同时点击Save进行设置保存。

j.在Sample界面中右击选择Measure中的by wells，并点击运行进行样品测定。

k.测定后点Tool中Dispenser maintenance，选择排空项Empty对进样柱进行排空，并用灭菌的超纯水对进样柱进行清洗。

l.先关软件，然后关仪器，再后关电脑。

4.启动子活性统计分析

申请人利用SPSS 13.0软件中的单因素方差分析(One-wayANOVA)对猪Six1基因不同长度启动子活性进行了统计分析，并利用Duncan多重比较方法进行了显著性检验，统计结果如表2所示。

表2 不同长度启动子活性比较

表2说明：上标¹LSM(SE)代表最小二乘均值(标准误)，数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，表示差异显著

统计结果显示，在三种真核细胞所进行的实验中，除P1-180启动子与阴性对照pGL3-Basic不存在显著性差异外，其它启动子与阴性对照pGL3-Basic均存在显著性差异(P＜0.05)。因此，从实验结果可以推断除P1启动子外，其余启动子P2、P3、P4、P5与P6均具有独立的启动基因表达的能力，而且各启动子启动基因表达的能力因细胞系不同而存在差异。

进一步，申请人利用SPSS 13.0软件中自带的配对样T检验方法(Paired-Samples T test)对同一个长度的启动子在三种不同真核细胞中的活性进行显著性检验。统计结果如图12、图13所示。图12显示的是不同长度的启动子在小鼠成肌细胞与小鼠胚胎成纤维细胞两种真核细胞中的活性分析比较。图13显示的是不同长度的启动子在小鼠成肌细胞与猪肾细胞两种真核细胞中的活性分析比较。图中：pGL3-Control为阳性对照；pGL3-Basic为阴性对照。实验结果表明P1、P2、P3、P4、P5与P6启动子活性在小鼠成肌细胞的活性要高于其它两种真核细胞。除了P2-530启动子外，其它启动子在小鼠成肌细胞中的活性均显著或极显著的高于其它两种细胞。经生物信息学分析表明，在P2-530启动子区存在许多常见的转录因子结合位点，如有结合GC-box的SP1转录因子；有结合CAAT框CTF/NF1转录因子，这些转录因子可能在所有的细胞都存在，因此，在分析此片段的活性时细胞之间不存在明显的差异。而在其它更长的启动子片段中，很可能存在着一些肌细胞特异性转录因子结合的位点，从而使这些片段的启动子在小鼠成肌细胞中的活性要显著或极显著的高于其它两种细胞。

综合以上两个统计分析结果，申请人可以推断猪Six1基因的启动子是一个适用于猪骨骼肌基因表达的启动子，除P1启动子外其它几个启动子P2、P3、P4、P5与P6均具有很强的启动基因表达的能力，并且在P2、P3、P4、P5与P6这5个启动子中，除P2外，其它几个启动子均可以作为猪骨骼肌基因表达的启动子应用到猪的遗传改良中。

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