具有降低的葡萄糖抑制作用的纤维素酶变体

摘要

提供了一种家族6纤维素酶变体酶，其包含选自以下的一个或多个氨基酸替换：103位的碱性、极性或非极性氨基酸，136位的缬氨酸或异亮氨酸，186位的酪氨酸，365位的谷氨酸或谷氨酰胺以及410位的谷氨酰胺(所述位置通过将亲本家族6与SEQ ID NO：1进行比对来确定)。本发明还提供了包含编码所述家族6纤维素酶变体的DNA序列的遗传构建体及经遗传修饰的微生物。本发明的家族6纤维素酶相比于亲本家族6纤维素酶，显示出葡萄糖抑制作用的降低。这种纤维素酶提供了多种工业上的应用，例如水解经过预处理的木质纤维素原料，该应用需要当存在能够抑制亲本纤维素酶活性的葡萄糖浓度时保持纤维素酶活性。

说明书

技术领域

本申请要求享受2008年1月18日提交的在先临时申请No 61/022,101的优先权。

本发明涉及纤维素酶变体。更具体地说，本发明涉及降低了葡萄糖抑制作用的家族6纤维素酶变体。本发明还涉及包含编码家族6纤维素酶变体的核苷酸序列的遗传构建体、由宿主菌株生产家族6纤维素酶变体的方法，以及家族6纤维素酶变体在纤维素水解中的用途。

背景技术

纤维素是一种由β-(1→4)糖苷键连接的无分支的葡萄糖聚合物。纤维素链之间可通过氢键彼此相互作用，形成具有高机械强度和化学稳定性的结晶固体。纤维素链必须解聚成葡萄糖和短的低聚糖，然后微生物(例如在乙醇生产中使用的发酵微生物)才能将其用作代谢燃料。纤维素酶催化原料中纤维素的水解(水解β-(1，4)-D-葡聚糖连接)而形成产物，例如葡萄糖、纤维二糖或其他纤维低聚糖。纤维素酶作为常用术语意指多酶混合物，包括可以通过大量植物和微生物生产的外切纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡糖苷酶(βG)等。里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶包括CBH1(一般称作Cel7A)、CBH2(Cel6A)、EG1(Cel7B)、EG2(Cel5)、EG3(Cel12)、EG4(Cel61A)、EG5(Cel45A)、EG6(Cel74A)、Cip1、Cip2、β-葡糖苷酶(包括如Cel3A)、乙酰木聚糖酯酶、β-甘露聚糖酶及纤维素膨胀因子(swollenin)。

纤维素酶协同发挥作用，将纤维素水解成葡萄糖。CBH1和CBH2作用于纤维素链的相反末端(Barr等，1996)，而内切葡聚糖酶作用于纤维素的内部位点。上述酶的初级产物是纤维二糖，其进一步被一种或多种的β-葡糖苷酶水解为葡萄糖。

纤维素酶水解不溶性纤维素底物的酶促水解动力学不遵循简单的米氏动力学(Zhang等，1999)。具体来说，在水解反应中增加纤维素酶的剂量不会在给定时间内线性地提高所产生的葡萄糖量。同时，随着纤维素水解的进行，反应速率会显著地降低(Tolan，2002)。现在已经提出了几种原因来解释反应速率的降低；主要的假说包括底物异质性(Nidetsky和Steiner，1993；Zhang等，1999)、酶失活(Caminal等，1985；Converse等，1988；Gusakov和Sinitsyn，1992；Eriksson等，2002)，以及产物抑制(Lee和Fan，1983；Caminal等，1985；Holtzapple等，1990；Gusakov和Sinitsyn，1992；Eriksson等，2002；Gruno等，2004)。

人们早已认识到了催化反应的产物对酶的抑制作用；上述现象已经被Henri、Michaelis及Menten等酶学领域的先驱们所认知(Frieden和Walter，1963)。产物抑制的性质可能是竞争，由于产物与底物竞争与酶形成相同的相互作用，但也可能存在其他形式的抑制作用。事实上，由于纤维素不可溶性，并且难于将其作为动力学研究的底物，因此关于纤维素酶体系中的抑制性质有许多矛盾的结论(Holtzapple等，1990及其参考文献)。纤维二糖水解酶受到其直接产物纤维二糖的抑制作用，并且在较低的程度上受到纤维二糖被β-葡糖苷酶进一步水解的产物葡萄糖的抑制。一种降低纤维素酶抑制作用的技术是提高体系中β-葡糖苷酶的量(美国专利No.6,015,703)，因为纤维二糖对纤维素酶的抑制作用比葡萄糖更强(Holtzapple等，1990；Teleman等，1995)。可以通过推理性设计或随机进行的DNA诱变来改变蛋白质的一级序列，以降低抑制作用。例如，通过推理性设计以Cel5A(一种内切葡聚糖酶)中的Y245残基为靶标进行诱变，提高了其纤维二糖抑制常数(美国专利公开号No.2003/0054535)。

改造Cel6A(也被称作纤维二糖水解酶II或CBH2，里氏木霉(也称作红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))纤维素酶系中一种主要的纤维二糖水解酶)以获得期望特性的报道相对很少。St-Pierre等(美国专利公开号No.2008/0076152)显示，将里氏木霉Cel6A序列的第231、305、410及413位等同位置的天然氨基酸替换成丝氨酸或苏氨酸(第231及305位)、谷氨酰胺或天冬酰胺(第410位)或脯氨酸(第413位)可以提高家族6纤维素酶的热稳定性、嗜热性和/或嗜碱性。Wohlfahrt等已经通过诱变E107、D170及D366位残基而形成酰胺羧酸对，从而提高了蛋白质的稳定性(美国专利公开号No.2004/0152872)。推理性设计也适用于相关的纤维二糖水解酶(来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的Cel6B)，以降低纤维二糖的抑制作用(Zhang等，2000)。已显示，Cel6B中等同于Cel6A序列中W269、H266及E399的残基的突变可以降低纤维二糖的抑制作用，但是对结晶纤维素的活性有显著损失。另一种方法基于对来自不同物种的Cel6A序列进行比对而产生的共有序列(美国专利公开号No.2006/0205042)，鉴定了与提高热稳定性相关的38个氨基酸(具体是：V94、P98、Gl 18、M120、M134、T142、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、1212、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、1333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S390、F411、S413、A416、Q426及A429)。作者推测，这些突变也可能影响产物抑制和/或酶的加工能力，但没有提供基于建模的数据或具体假说而将这些特性改变与所述残基关联起来。共同的方法是设计产生提高热力学稳定性的蛋白变体(Steipe，2004)，但并不能预见到其他任何生化特性的提高。

虽然之前已经描述了纤维素酶组合物，但是仍然需要提供一种新的改进组合物，用于将纤维素转化为可发酵的糖，以及用于纤维素材料加工相关的领域，例如制浆和造纸、纺织和动物饲料。具有提高性能的纤维素酶能降低生产成本，并且与类似的化学和/或物理方法相比通常能获得巨大的环境益处。例如，从纤维素生产燃料乙醇提供了巨大的环境益处和经济效益。与汽油相比，使用乙醇作为燃料显著降低了净碳排放量，这通过将燃烧过程中释放的二氧化碳固定成生物质生成，作为进一步生产乙醇的原料来实现。利用农业生物质作为原料还可以刺激农村经济，并减少对外国石油的依赖。用纤维素而不是淀粉(例如玉米乙醇)或糖来生产乙醇，这具有避免与人类和动物食品生产相竞争的额外好处。据美国农业部和能源部估算，作为世界上最大的石油市场，美国有30％的运输用燃料可以通过使用纤维素燃料进行替代，而不影响食品收成(Perlack等，2005)。此外，由于生产纤维素生物质所需的能量输入低，据估计，使用纤维素乙醇与汽油相比会降低88％的净温室气体排放，而使用玉米生产乙醇仅降低18％(Farrell等，2006)。

发明内容

本发明涉及家族6纤维素酶变体。更具体地说，本发明涉及降低了葡萄糖抑制作用的家族6纤维素酶变体。本发明还涉及包含编码家族6纤维素酶变体之核苷酸序列的遗传构建体、用宿主菌株生产家族6纤维素酶变体的方法，以及家族6纤维素酶变体用于纤维素水解的应用。

本发明的一个目的是提供葡萄糖抑制作用被降低的改良的纤维素酶。

本发明涉及家族6纤维素酶变体，其包含选自以下的一个或多个氨基酸替换：

103位的碱性、非极性或脯氨酸残基(X103H、K、R、A、V、L、P、M)，

136位的缬氨酸或异亮氨酸残基(X136V、I)，

186位的酪氨酸或赖氨酸残基(X186Y、K)，

365位的酸性、谷氨酰胺或丝氨酸残基(X365D、E、Q、S)，和

410位的丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸残基(X410A、F、L、Q、S)。

所述氨基酸替换的位置通过将该家族6纤维素酶变体与如SEQ ID NO：1所示的里氏木霉Cel6A的氨基酸序列进行序列比对而确定。103位的碱性氨基酸可以是组氨酸、精氨酸或赖氨酸，或者103位的非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸。本发明家族6纤维素酶变体相比于其来源的亲本家族6纤维素酶，显示出葡萄糖抑制作用降低至少约1.4倍。例如，所述家族6纤维素酶变体相比于其来源的亲本家族6纤维素酶，显示出至少低约1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4、5、6，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍的葡萄糖抑制作用。

在本发明的一个实施方案中，本发明的家族6纤维素酶变体具有与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有至少约45％至约100％同一性的氨基酸序列。例如，所述家族6纤维素酶变体可具有与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有至少约55％至约100％同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有至少约63％至约100％同一性的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本发明的家族6纤维素酶变体具有与SEQ IDNO：1的第83-447位氨基酸具有至少约95％同一性的氨基酸序列。

所述家族6纤维素酶变体可以来源于亲本家族6纤维素酶，所述亲本家族6纤维素酶在对应于所述家族6纤维素酶变体的替换位置包含一个或多个天然氨基酸，但在其他方面与该家族6纤维素酶变体相同，例如来自Neocallimastix patriciarum、Orpinomyces或Thermobifidia fusca的天然家族6纤维素酶。所述亲本家族6纤维素酶可以包含其他位置的一个或多个氨基酸替换，只要上述替换也存在于相应的家族6纤维素酶变体中即可。

本发明还包括如上定义的家族6纤维素酶变体，其进一步包含以下一个或多个：134位的异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、酪氨酸或谷氨酰胺残基，215位的异亮氨酸残基以及413位的脯氨酸残基。包含这些突变的家族6纤维素酶变体可以来自丝状真菌，例如里氏木霉。

本发明还涉及相比于其来源的亲本家族6纤维素酶显示出至少低约1.4倍的葡萄糖抑制作用的家族6纤维素酶变体，所述家族6纤维素酶变体选自：

TrCel6A-Y103A-S413P(SEQ ID NO：37)；

TrCel6A-Y103H-S413P(SEQ ID NO：38)；

TrCel6A-Y103K-S413P(SEQ ID NO：39)；

TrCel6A-Y103L-S413P(SEQ ID NO：40)；

TrCel6A-Y103M-S413P(SEQ ID NO：41)；

TrCel6A-Y103P-S413P(SEQ ID NO：42)；

TrCel6A-Y103R-S413P(SEQ ID NO：43)；

TrCel6A-Y103V-S413P(SEQ ID NO：44)；

TrCel6A-L136I-S413P(SEQ ID NO：45)；

TrCel6A-L136V-S413P(SEQ ID NO：46)；

TrCel6A-S186K-S413P(SEQ ID NO：47)；

TrCel6A-S186Y-S413P(SEQ ID NO：48)；

TrCel6A-G365D-S413P(SEQ ID NO：49)；

TrCel6A-G365E-S413P(SEQ ID NO：50)；

TrCel6A-G365Q-S413P(SEQ ID NO：51)；

TrCel6A-G365S-S413P(SEQ ID NO：52)；

TrCel6A-R410A-S413P(SEQ ID NO：53)；

TrCel6A-R410F-S413P(SEQ ID NO：54)；

TrCel6A-R410L-S413P(SEQ ID NO：55)；

TrCel6A-R410Q-S413P(SEQ ID NO：56)；

TrCel6A-R410S-S413P(SEQ ID NO：57)；

TrCel6A-M134V-L136I-S413P(SEQ ID NO：62)；

TrCel6A-L136I-L2151-S413P(SEQ ID NO：63)；

TrCel6A-M134V-L136I-L215I-S413P(SEQ ID NO：71)；

HiCel6A-Y107K(SEQ ID NO：78)；

HiCel6A-Y107L(SEQ ID NO：79)；

HiCel6A-Q139T(SEQ ID NO：80)；

HiCel6A-L141V(SEQ ID NO：81)；

HiCel6A-A194Y(SEQ ID NO：82)；

PcCel6A-Y98K(SEQ ID NO：83)；

PcCel6A-Y98L(SEQ ID NO：84)；

PcCel6A-L131I(SEQ ID NO：85)；

PcCel6A-L131V(SEQ ID NO：86)；

PcCel6A-S182K(SEQ ID NO：87)；

PcCel6A-S182Y(SEQ ID NO：88)；

PcCel6A-G359Q(SEQ ID NO：89)；

PcCel6A-R404Q(SEQ ID NO：90)。

另外，本发明还涉及指导在宿主微生物中表达和分泌家族6纤维素酶变体的遗传构建体，所述宿主微生物包括但不限于里氏木霉或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

本发明涉及包含编码家族6纤维素酶变体的DNA序列的基因构建体，其中所述变体具有103位的碱性、非极性或脯氨酸残基，136位的缬氨酸或异亮氨酸残基，186位的酪氨酸或赖氨酸残基，365位的酸性、谷氨酰胺或丝氨酸残基，或者410位的丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸残基，其中所述DNA序列与调节其在宿主微生物中表达及分泌DNA序列有效连接。优选地，所述调节家族6纤维素酶变体的表达及分泌的DNA序列是来源于用于表达所述分离的纤维素酶的宿主微生物。所述宿主微生物可以是酵母(例如酿酒酵母)，或丝状真菌(例如里氏木霉)。

本发明还涉及如上定义的遗传构建体，其中该遗传构建体所编码的家族6纤维素酶变体进一步包含以下一个或多个：134位的缬氨酸或苏氨酸残基，215位的异亮氨酸残基以及413位的脯氨酸残基。优选地，所述调节家族6纤维素酶变体的表达及分泌的DNA序列来源于丝状真菌，包括但不限于里氏木霉。

本发明还涉及经遗传修饰的微生物，所述微生物包含编码家族6纤维素酶变体的遗传构建体，并能表达并分泌家族6纤维素酶变体，所述家族6纤维素酶变体包含以下一个或多个：103位的碱性、非极性或脯氨酸残基，136位的缬氨酸或异亮氨酸残基，186位的酪氨酸或赖氨酸残基，365位的酸性、谷氨酰胺或丝氨酸残基，或者410位的丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸残基。在一个实施方案中，所述家族6纤维素酶变体进一步包含以下一个或多个：134位的缬氨酸或苏氨酸残基，215位的异亮氨酸残基以及413位的脯氨酸残基。优选地，所述经遗传修饰的微生物是酵母或丝状真菌。更优选地，所述经遗传修饰的微生物是酵母属(Saccharomyces)、毕氏酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、肉座菌属(Hypocrea)、木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)或脉孢霉属(Neurospora)。

本发明还涉及家族6纤维素酶变体用于水解纤维素底物的用途，所述变体包含以下一个或多个：103位的碱性、非极性或脯氨酸残基，136位的缬氨酸或异亮氨酸残基，186位的酪氨酸或赖氨酸残基，365位的酸性、谷氨酰胺或丝氨酸残基，410位的丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸残基。

本发明还涉及生产如上所述家族6纤维素酶变体的方法，包括用包含编码家族6纤维素酶变体的DNA序列的遗传构建体转化酵母或真菌宿主，筛选表达该家族6纤维素酶变体的重组酵母或真菌，并且在诱导该家族6纤维素酶变体表达的条件下在液体发酵培养基中培养筛选到的重组菌株。

本发明的家族6纤维素酶变体相比于其来源的亲本家族6纤维素酶显示出葡萄糖抑制作用的降低，所述变体包含以下一个或多个：103位的碱性、非极性或脯氨酸残基，136位的缬氨酸或异亮氨酸残基，186位的酪氨酸或赖氨酸残基，365位的酸性、谷氨酰胺或丝氨酸残基，或者410位的丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸残基。

本文所述家族6纤维素酶变体可用于多种工业应用中，所述应用需要高浓度的纤维素底物以及在来源上述底物的通常为抑制浓度的葡萄糖存在下保持高活性的酶。例如，本文所述家族6纤维素酶变体可用于木质纤维素原料的糖化作用，用于生产可发酵糖，或提高饲料在反刍及非反刍动物中的消化性。

附图说明

图1显示了里氏木霉Cel6A(TrCel6A；SEQ ID NO：1)的83-447位氨基酸与35种真菌家族6纤维素酶变体的氨基酸序列比对。每种纤维素酶的氨基酸编号显示在每个序列的左侧和右侧。103、134、136、186、215、365、410和413位(相对于TrCel6A)的氨基酸残基用箭头表示。对于具有纤维素结合结构域的纤维素酶，只给出催化核心序列。CfCel6B(SEQ ID NO：2)；HiCel6A(SEQ ID NO：3)；HiCel6B(SEQ ID NO：4)；MtCel6A(SEQ ID NO：5)；NpCel6A(SEQ ID NO：6)；OpC2Cel6F(SEQ ID NO.7)；PcCel6A(SEQ ID NO：8)；PE2Cel6A(SEQ ID NO：9)；TfCel6A(SEQ ID NO：10)；TfCel6B(SEQ ID NO：11)。

图2显示了质粒载体YEp352/PGK91-1ΔNheI-a_SS-TrCel6A-S413P，其指导亲本及变体TrCel6A纤维素酶在重组酿酒酵母中表达及分泌。

图3显示了质粒载体Yep352/91-1ΔNheI-a_SS-6H-Hi(Pc)Cel6A，其指导天然及变体HiCel6A或PcCel6A在重组酿酒酵母中表达及分泌。

图4显示的数据证实了TrCel6A-S413P对用不含Cel7A和Cel6A的纤维素酶处理过的Sigmacell50的活性。在开始采集数据时加入不含纤维二糖水解酶的纤维素酶，对表观吸光度没有可分辨的影响。开始采集数据后五分钟，加入TrCel6A-S413P，表观吸光度开始下降。Cel6A的活性与吸光度下降曲线的线性部分的斜率成正比。不存在葡萄糖以及存在所用最高浓度(50g/L)葡萄糖时的酶活性如图所示。数据代表5个重复试验的平均值，误差条代表标准差。

图5显示了提高葡萄糖浓度对TrCel6A-S413P活性的影响。

图6显示了逐渐提高的葡萄糖浓度对TrCel6A-S413P和TrCel6A-Y103K-S413P活性的影响。

图7显示了逐渐提高的葡萄糖浓度对TrCel6A-S413P和TrCel6A-M134T-S413P活性的影响。

图8显示了逐渐提高的葡萄糖浓度对TrCel6A-S413P和TrCel6A-L136I-S413P活性的影响。

图9显示了逐渐提高的葡萄糖浓度对TrCel6A-S413P和TrCel6A-S186Y S413P活性的影响。

图10显示了逐渐提高的葡萄糖浓度对TrCel6A-S413P和TrCel6A-G365Q-S413P活性的影响。

图11显示了逐渐提高的葡萄糖浓度对TrCel6A-S413P和TrCel6A-R410F-S413P活性的影响。

图12显示了逐渐提高的葡萄糖浓度对TrCel6A-S413P和TrCel6A-M134V-L136I-S413P活性的影响。

图13显示了逐渐提高的葡萄糖浓度对TrCel6A-S413P和TrCel6A-L136I-L215I-S413P活性的影响。

图14显示了逐渐提高的葡萄糖浓度对TrCel6A-S413P和TrCel6A-M134V-L136I-L215I-S413P活性的影响。

图15显示了当存在10g/L葡萄糖时，TrCel6A-S413P和TrCel6A-L215I-S413P的活性。

图16显示了亲本家族6纤维素酶以及如实施例8(TrCel6A-S413P)、实施例13(HiCel6A变体，A图)纯化的家族6纤维素酶变体及PcCel6A变体(B图)的SDS-PAGE分析。通过考马斯蓝染色使纯化的家族6纤维素酶可见。

发明详述

本发明涉及家族6纤维素酶变体。更具体地，本发明涉及与其来源亲本家族6纤维素酶相比具有降低的葡萄糖抑制的家族6纤维素酶变体。本发明还涉及包含有编码家族6纤维素酶变体的核苷酸序列的遗传构建体、从宿主菌株生产家族6纤维素酶变体的方法，以及家族6纤维素酶变体在纤维素水解方面的应用。

以下的描述是仅用于举例的优选实施方案，而不限制实施本发明的必要技术特征的组合。

定义

家族6纤维素酶变体

家族6(以前称作家族B)纤维素酶是通过倒置异构碳的构型来水解纤维素中β-1，4糖苷键的一组酶(Claeyssens，M.和Henrissat，B.1992)。迄今为止鉴定的大部分家族6纤维素酶是嗜温的。然而，该家族也包含来自褐色嗜热裂孢菌的热稳定纤维素酶(图1中TfCel6A和TfCel6B)和来自特异腐质霉(Humicola insolens)的嗜碱纤维素酶(图1中HiCel6A和HiCel6B)。

图1和表1显示，大部分家族6纤维素酶之间的一级氨基酸序列具有高度保守性。35种目前已知的家族6纤维素酶氨基酸序列之间的多重比对表明，大多数天然存在的真菌来源家族6纤维素酶与TrCel6A的83-447位氨基酸表现出约47％到约100％的氨基酸序列同一性(图1和表1)；细菌来源的家族6纤维素酶则表现出与TrCel6A低得多的氨基酸序列同一性。

如果一种纤维素酶包含其他家族6纤维素酶共有的氨基酸(包括可作为催化残基的两个天冬氨酸(D)残基)，则其被分类为家族6纤维素酶。这些天冬氨酸残基存在于175位和221位(见图1；基于TrCel6A编号)上。“TrCel6A编号”表示对应于以TrCel6A的氨基酸序列(表1；图1；SEQ ID NO：1)为基础的氨基酸位置的编号。如图1所示，家族6纤维素酶显示出显著的序列相似性。因此，通过将氨基酸进行比对以优化纤维素酶之间的序列相似性并使用TrCel6A的氨基酸编号作为编号的基础，可以相对于TrCel6A来确定其他纤维素酶中氨基酸的位置。比对氨基酸序列的方法对于本领域技术人员是公知的并可获得的，包括可用于比对两个序列的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，参见URL：blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)以及可用于比对两个或更多序列的CLUSTALW(参见URL：ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)。

整体三维结构的保守性为比对家族6纤维素酶的一级氨基酸序列提供了进一步的指导。家族6催化结构域的拓扑结构是带有中心β桶的α/β桶的变体，含有通过五个α螺旋连接的七条平行的β链。家族6纤维二糖水解酶与内切β-1，4-葡聚糖酶之间一个重要差别是N端和C端环的长度，所述N端和C端环存在于活性位点两侧并且负责它们对纤维素的功能性行为。在纤维二糖水解酶中，延伸的C端环与N端环形成了围绕活性位点的通道。这赋予了纤维二糖水解酶攻击结晶纤维素末端的独特特性，其中N端和C端环将单个纤维素链保持在活性位点中，并有利于底物的连续降解。在内切β-1，4-葡聚糖酶中，C端环长度减少，N端环将其拉离活性位点，并且也可以更短，导致更开放的活性位点，允许接近纤维素的内部β-1，4糖苷键进行水解。通过缺失粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)纤维二糖水解酶Cel6B中C端环的十五个氨基酸来模拟内切β-1，4-葡聚糖酶的特性，从而证实了这些环在家族6酶对纤维素的功能性行为中的作用(Meinke.A.等.1995.)。该突变增强了酶对可溶性纤维素(例如羧甲基纤维素)的内切β-1，4-葡聚糖酶活性，并改变了其对不溶性纤维素的纤维二糖水解酶活性。

就本发明的目的而言，“家族6纤维素”定义为这样的酶，其能够通过转换机制水解多糖，并且其特征为具有带有中心β桶的α/β桶结构，其含有通过五个α螺旋连接的七条平行的β链，其氨基酸序列与代表TrCel6A家族6催化域的SEQ ID NO：1中83-447位氨基酸具有约47％到约100％的同一性。例如，家族6纤维素酶可以具有与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有约47％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。本领域技术人员可以理解，给定家族6纤维素酶的氨基酸序列可以通过添加、缺失或替换一个或多个氨基酸而进行修饰，但仍然认为是家族6纤维素酶。改变氨基酸序列的技术包括但不限于定点诱变、盒式诱变、随机诱变、合成寡核苷酸构建、克隆及其它本领域技术人员所熟知的基因工程技术(Eijsink VG，等2005，通过引用并入本文)。可根据本文所述一般手段和方法进行修饰的家族6纤维素酶的非限制性实例在表1中给出。

表1：家族6纤维素酶

“家族6纤维素酶变体”或“经修饰的纤维素酶”意指包含一个或多个以下氨基酸替换的家族6纤维素酶：103位的氨基酸被碱性、非极性或脯氨酸残基替换，136位的氨基酸被缬氨酸或异亮氨酸残基替换，186位的氨基酸被酪氨酸或赖氨酸残基替换，365位的氨基酸被酸性、谷氨酰胺或丝氨酸残基替换；或410位的氨基酸被丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸残基所替换；所述位置通过将所述分离的纤维素酶与如SEQ ID NO：1所定义里氏木霉Cel6A氨基酸序列进行比对而确定。应当理解的是，家族6纤维素酶变体可以衍生自任何家族6纤维素酶。例如，家族6纤维素酶变体可衍生自野生型纤维素酶，或者衍生自已含有其他氨基酸替换的纤维素酶。在本发明的一个实施方案中，相对于其来源的相应亲本家族6纤维素酶来说，家族6纤维素酶变体显示出降低的葡萄糖抑制作用。

“野生型”或“天然”家族6纤维素酶是指这样的家族6纤维素酶，其具有天然产生该家族6纤维素酶的微生物基因组所编码的氨基酸序列，而没有引入任何替换、缺失、添加或修饰。例如，野生型TrCel6A、野生型HiCel6A和野生型PcCel6A分别指没有任何氨基酸替换的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：30的纤维素酶。

“亲本家族6纤维素酶”是指这样的家族6纤维素酶，其显示出至少低1.4倍的葡萄糖抑制作用，并在对应于家族6纤维素变体的突变位置上包含一个或多个天然存在的氨基酸，但是其与家族6纤维素酶变体在其它方面均相同。亲本家族6纤维素酶不包括这样的纤维素酶，即其中103位的天然氨基酸是碱性、非极性或脯氨酸残基，136位的天然氨基酸是缬氨酸或异亮氨酸残基，186位的天然氨基酸是酪氨酸或赖氨酸残基，365位的天然氨基酸是酸性、谷氨酰胺或丝酸残基，和/或410位的天然氨基酸是丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸残基。该定义包括在其它位置上含有一个或多个通过基因工程或其他技术引入的额外氨基酸替换的亲本家族6纤维素酶，只要这些替换也出现在相应的家族6纤维素酶变体中即可。例如，亲本纤维素酶可以包含413位(TrCel6A编号)的氨基酸突变为脯氨酸以提高其热稳定性。家族6纤维素酶变体的非限制性实例在表2中列出。

表2：家族6纤维素酶变体

降低的葡萄糖抑制作用

通过测定抑制常数K_G来测量纤维素酶的葡萄糖抑制，K_G定义为使纤维素酶活性降低50％时的葡萄糖浓度。K_G值不依赖于产物抑制的性质--例如，竞争性、非竞争性或混合型。具有较低葡萄糖抑制作用的纤维素酶将具有较高的K_G值--即，使其酶活性降低50％需要更高的葡萄糖浓度。

就本发明目的而言，如果K_G为亲本家族6纤维素酶的至少约1.4倍，或至少约1.8倍，则该家族6纤维素酶变体与相应的亲本家族6纤维素酶相比显示出葡萄糖抑制作用的降低。K_G值是导致分离的亲本家族6纤维素酶活性降低50％的葡萄糖浓度，其通过实施例9详述的测定进行测量。

家族6纤维素酶变体可具有为相应亲本家族6纤维素酶的约1.4倍或约1.8倍的K_G。例如，家族6纤维素酶变体可具有为相应亲本家族6纤维素酶的至少约1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、10.0、12.0、15.0或20.0倍的K_G。

显示葡萄糖抑制作用降低的家族6纤维素酶变体的实例如表2所示。

编码家族6纤维素酶变体的遗传构建体

本发明还涉及遗传构建体，其包含编码家族6纤维素酶变体的DNA序列，所述序列与用于指导在宿主微生物中表达和分泌该家族6纤维素酶变体的调节性DNA序列有效连接。“调节性DNA序列”意指启动子和编码分泌信号肽的DNA序列。所述调节性DNA序列优选在真菌宿主中有功能。所述调节性DNA序列可以来源于在工业发酵条件下在该宿主微生物中高表达并分泌的基因。在一个优选的实施方案中，调节性DNA序列来源于任何一种或多种里氏木霉纤维素或半纤维素基因。

遗传构建体可进一步包含选择标记基因，以使得能够如本领域技术人员所知分离出转化有该构建体的遗传修饰微生物。选择标记基因可以赋予抗生素抗性或者使其有能力生长在对宿主微生物来说缺乏特定养分而本来无法生长的培养基上。本发明并不受限于选择标记基因的选择，本领域的技术人员可以很容易地确定合适的基因。在一个优选的实施方案中，选择标记基因赋予对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、遗传霉素或G418的抗性，对宿主微生物的trp、arg、leu、pyr4、pyr、ura3、ura5、his或ade基因之一的缺陷进行回补，或者赋予其在乙酰胺作为唯一氮源时的生长能力。

遗传构建体可以进一步包含其它DNA序列，例如，转录终止子、DNA编码肽标签、可将多种DNA序列连接到一起的合成序列、复制起点等等。本发明的实施不受限于任何一种或多种其他此类DNA序列的存在。

生产家族6纤维素酶变体的遗传修饰微生物

所述家族6纤维素酶变体可以通过用编码家族6纤维素酶变体的遗传构建体转化宿主微生物而在遗传修饰微生物中进行表达和分泌。宿主微生物可以是酵母或丝状真菌，包括但不限于，酵母属、毕氏酵母属、汉逊酵母属、木霉属、肉座菌属、曲霉属、镰孢霉属、腐质霉属或链孢霉属的物种。例如，宿主微生物可以是酿酒酵母或里氏木霉的工业菌株。特别地，宿主微生物不包含编码家族6纤维素酶的基因，或者其中编码任何或所有家族6纤维素酶的基因已被缺失。

遗传构建体可以通过微生物转化领域技术人员已知的任意多种方法引入宿主微生物中，所述方法包括但不限于用CaCl₂处理细胞、电穿孔、生物射弹轰击、PEG介导的原生质体融合(例如，White等，WO2005/093072，通过引用并入本文)。选择出表达家族6纤维素酶变体的重组真菌菌株后，在诱导所述家族6纤维素酶变体表达的条件下在液体发酵中培养所选重组菌株。

家族6纤维素酶变体在纤维素底物水解中的用途

本发明的家族6纤维素酶变体应用于纤维素的酶促水解。本发明的家族6纤维素酶变体尤其可用于含有纤维素的底物在存在或累积了抑制性葡萄糖水平的条件下的水解。例如，本发明的家族6纤维素酶变体可以用于这样的方法，其中纤维素的起始浓度为约20g/L并且其中约50％的纤维素将被转化为葡萄糖，或者纤维素的起始浓度高达约200g/L并且其中约5％的纤维素将被转化为葡萄糖。例如，纤维素的起始浓度可以是20、30、40、50、60、80、100、120、150或200g/L并且分别约50％、33％、25％、20％、17％、12％、10％、8％、7％或5％的纤维素将被转化为葡萄糖。在上述过程中以亲本TrCel6A-S413P为例，葡萄糖的浓度可以接近于该酶的K_G值，并使其活性降低约50％(表5，图5)。

例如，本发明的家族6纤维素酶变体可用于存在于“经预处理的木质纤维素原料”中的纤维素的酶促水解。经预处理的木质纤维素原料是植物来源的材料，其在预处理前包含至少20％的纤维素(干重)及至少10％的木质素(干重)，并且已经使用物理和/或化学方法使得纤维更容易被纤维素酶的作用所接近和/或识别。预处理后，木质纤维素原料可包含大于约20％的纤维素和大于约10％的木质素。在一个实施方案中，经过预处理的木质纤维素原料包含大于约20％的纤维素和大于约12％的木质素。预处理方法的非限制性实例包括使用以下进行的化学处理：硫酸或亚硫酸或其他酸；氨、石灰、氢氧化铵或其他碱；乙醇、丁醇或其他有机溶剂或加压水(参见美国专利No.4,461,648，5,916,780，6,090,595，6,043,392，4,600,590，Weil等(1997)以及，K.，等(2005))。

可用于本发明的木质纤维素原料包括但不局限于农业残留物例如玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、稻草、燕麦秸秆、油菜秸秆、大豆秸秆；纤维加工残余物例如玉米纤维、甜菜浆、制浆机精浆及筛渣或者甘蔗渣，林业残余物例如白杨木，其他硬木、软木、锯末；或者草本植物如柳枝稷(switch grass)、芒草(miscanthus)、米草(cord grass)及草芦(reed canary grass)。木质纤维素原料可以首先通过一些方法破碎，包括但不限于碾、磨、搅拌、粉碎、压缩/膨胀或其他类型的机械作用。通过机械作用破碎的方法可以任何适于该目的设备来实施，例如但不限于锤磨机(hammer mill)。

术语“酶促水解”意指纤维素酶或其混合物(包括本发明的家族6纤维素酶变体)作用于纤维素以将其全部或部分转化成可溶性糖的过程。术语“纤维素酶混合物”意指酶混合物，其可以分解纤维素，并包含一种或多种“内切葡聚糖酶”(水解纤维素链内的β-1，4糖苷键的酶)、“纤维二糖水解酶”或“外切葡聚糖酶”(可以从纤维素链的还原或非还原末端上连续切割纤维二糖的酶，以及一种或多种“β-葡糖苷酶”(将纤维二糖水解为葡萄糖的酶)。纤维素酶混合物除内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶之外还可以包含其他的酶或蛋白质。

酶促水解的过程优选地可将约80％至约100％(或其间任何范围)的纤维素转换为可溶性糖。例如，酶促水解的过程可将约90％至约100％(或其间任何范围)的纤维素转换为可溶性糖。在一个优选的实施方案中，酶促水解的过程可将约98％至约100％(或其间任何范围)的纤维素转换为可溶性糖。

优选地，初级纤维素酶是通过一种或多种浸没式液体培养物发酵生产的，并且在发酵结束后从所述细胞中分离。细胞可以通过过滤、离心或其他本领域技术人员熟悉的方法与纤维素酶分离开。之后，将无细胞的包含纤维素酶的级分进行浓缩(例如，通过超滤)、保存和/或稳定后待用。此外，初级纤维素酶也可以不从细胞中分离，而是与细胞一起加入酶促水解中。

降低家族6纤维素酶的葡萄糖抑制作用

通过将酶在不同浓度葡萄糖下在底物存在下进行孵育来检测家族6纤维素酶变体的葡萄糖抑制常数。纤维素酶的活性可以通过以不可溶性酸溶胀纤维素作为底物通过浊度测定进行检测。“浊度测定(turbidometric assay)”意指一种测定流体中微粒悬液的光密度的测定，其中测量入射光中不被微粒散射并因此而直接透过该悬液的部分。“散射比浊法(nepholometry)”是一种测量被微粒散射的一部分光的相关技术，通常是从入射光的90度观察角度。

通过亲本家族6纤维素酶TrCel6A-S413P、HiCel6A及PcCel6A变体的比较研究来确定彼此组合或与134及215位的额外氨基酸替换相组合的103、136、186、365及410位氨基酸替换对413位丝氨酸替换为脯氨酸的TrCel6的葡萄糖耐受的影响。

家族6纤维素酶变体的绝对K_G值以及与亲本家族6纤维素酶相比的葡萄糖抑制相对降低如下表3所示：

表3：家族6纤维素酶变体降低的葡萄糖抑制作用

“相对K_G”意指家族6纤维素酶变体的绝对K_G与该家族6纤维素酶变体来源的亲本家族6纤维素酶的绝对K_G的比值。因此，可以说家族6纤维素酶变体相比于其来源的亲本家族6纤维素酶显示多少“倍”的葡萄糖抑制作用的降低。例如，如表3所示的黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)家族6纤维素酶的Y98K变体的相对K_G为3.22，因而与Y98K变体来源的野生型黄孢原毛平革菌家族6纤维素酶细胞相比，其葡萄糖抑制作用降低3.22倍。

实施例

本发明将通过以下的实施例进一步阐明。然而，应当理解，这些实施例仅限于阐述的目的，而不应以任何方式用于限制本发明的范围。

实施例1描述了以下实施例中所使用的菌株和载体。实施例2-5描述了TrCel6A-S413P基因的克隆和酵母转化、进行易错PCR和Cel6A的位点饱和诱变文库，以及产生组合突变体。实施例6和7描述了从微量培养物中表达TrCel6A-S413P变体以及用于鉴定具有降低的葡萄糖抑制作用的家族6纤维素酶变体的高通量筛选。实施例8和9描述了表达和表征具有降低的葡萄糖抑制作用的分离的及亲本家族6纤维素酶。实施例10-14描述了PcCel6A-His6、HiCel6A-His6及其变体的构建、表达、纯化以及表征。实施例15描述了测定TrCel6A变体浓度的免疫测定。

实施例1：菌株和载体

酿酒酵母菌株YDR483W BY4742[14317](MATα his3Δ1 leu2Δ0lys2Δ0 ura3Δ0 Δkre2)得自ATCC(#4014317)。特异腐质霉和黄孢原毛平革菌得自(分别为#22082^TM和#201542^TM)。大肠杆菌菌株DH5α(80lacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(r_k^-，m_k⁺)phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1λ^-)得自Invitrogen。YEp352/PGK91-1载体由国立卫生研究院提供。YEpFLAGΔKpn10-S413P载体公开于美国专利申请60/841,507中。YEpFLAG-1载体作为氨基末端酵母FLAG表达试剂盒的一部分得自Sigma公司。pGEM T-easy载体得自Promega公司。

实施例2：将TrCel6A-S413P基因克隆到YEp352/PGK91-1载体中并转化酵母

为了便于使用NheI和KpnI限制性内切酶进行克隆，用DNA聚合酶I大片段(Klenow)将YEp352/PGK91-1载体1936位的NheI单位点补平，得到YEp352/PGK91-1ΔNheI。使用引物5′NheCel6A和3′BglKpnCel6A，通过PCR从YEpFLAGΔKpn10-S413P载体(美国专利申请号No.60/841,507)中扩增TrCel6A-S413P基因。平行地，使用引物(5′Bg1AlphaSS和3′NheAlphaSS)通过PCR从YEpFLAG-1载体(Sigma)中扩增酵母α因子前导序列，以向扩增子中引入5’端的BglII和3’端的NheI限制性酶切位点。

通过BglII/NheI消化分离酵母α因子前导序列，并与TrCel6A-S413P基因(通过NheI/BglII消化分离)和YEp352/PGK91-IΔNheI载体(通过BglII消化分离)进行三片段连接。通过Gietz，R.D.和Woods，R.A.(2002)所述方法将得到的载体YEp352/PGK91-IΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P(图2)转化到酵母菌株BY4742中。引物序列如下列出：

5’BglAlphaSS： 5’ACC AAA AGA TCT ATG AGA TTT CCT TCA ATT(SEQ ID NO：91)

3’NheAlphaSS： 5’TGA GCA GCT AGC CCT TTT ATC CAA AGA TAC(SEQ ID NO：92)

5’NheCel6A：   5’AAA AGG GCT AGC TGC TCA AGC GTC TGG GGC(SEQ ID NO：93)

3’BglKpnCel6A：5’GAG CTC AGA TCT GGT ACC TTA CAG GAA CGA TGG GTT(SEQ ID NO：94)。

实施例3：产生易错PCR文库

使用两种方法产生随机诱变文库：II DNA聚合酶法和Mn²⁺/偏好性dNTP混合法。对于II DNA聚合酶法，使用10、20、30、40ng的YED352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P载体和II DNA聚合酶，以YalphaN21和3′PGK-term为引物进行4个独立的PCR。进行25个循环的扩增。合并这4种PCR产物并稀释至10ng/μL。使用30ng合并的PCR产物与II DNA聚合酶及同样的引物进行30个扩增循环的第二次PCR诱变步骤。将YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P载体用NheI和KpnI消化并分离空载体片段。将这种线性片段和最终的扩增子同时转化并通过体内重组克隆到酵母菌株BY4742中(Butler等，2003)。

对于Mn²⁺/偏好性dNTP混合法，使用25ngYEp352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P载体、200μM  dATP、200μM dCTP、240μM dGTP、200μM dTTP和640μM Mn²⁺以及TaqDNA聚合酶(Sigma)，以YalphaN21和3′PGK-term为引物进行30个扩增循环的PCR。如上文所述将最终的扩增子克隆到YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P载体中。

YalphaN21：  5’AGC ACA AAT AAC GGG TTA TTG(SEQ ID NO：95)

3’PGK-term：5’GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC(SEQ ID NO：96)。

实施例4：制备位点饱和诱变文库

通过高通量筛选(实施例7)选择了TrCel6A-S413P的七个氨基酸位点(M134、L136、L215、Y103、S186、G365和R410)用于位点饱和诱变，以便找到能进一步提高葡萄糖耐受的氨基酸。位点饱和诱变是使用NNS引物(如下所列)、YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P载体(作为模板)和Taq DNA高保真聚合酶进行的大引物PCR扩增(两步式PCR反应)。第一步PCR是使用NNS引物和互补的外部引物(YaIphaN21或3′PGK-term)进行扩增。使用纯化的扩增子(作为第二步PCR的大引物)和另一互补的外部引物来扩增完整的突变基因。将这种最终的扩增子如实施例3所述克隆到YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P载体中。

3’M134x：5’GAG TAT CTA GCC ASN NAA AAG AGG GAA C(SEQ ID NO：97)

3’L136X：5’CTT GTC AAG AGT ATC SNN CCA CAT AAA AG(SEQ ID NO：98)

3’L215X：5’GCT CAA TAA CCA GSN NGG T℃C GGA TAT C(SEQ ID NO：99)

3’Y103X：5’CTT CAG AGG CGT ASN NTG CAT TGG CCC(SEQ ID NO：100)

3’S186x：5’CAC CAT CGG CAA TSN NGT ATT CGC CAT TC(SEQ ID NO：101)

5’G365X：5’CAG CAA CAG TGG NNS GAC TGG TGC AAT G(SEQ ID NO：102)

5’R410X：5’GAC AGC AGT GCG CCA NNS TTT GAC CCC CAC TGT GC(SEQ ID NO：103)。

实施例5：产生组合突变体

基于实施例7对葡萄糖耐受进行筛选而鉴定出的TrCel6A-S413P阳性变体，在亲本TrCel6A-S413P的基础上设计出三种多重突变体和一种单突变体(M134V-L136I、L136I-L215I、M134V-L136I-L215I和M134V)。对于M134V-L136I突变体，以YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P载体作为模板，使用诱变引物5′M134V-L136I、外部引物3′PGK-term和Taq高保真DNA聚合酶(Invitrogen)进行两步式反应的大引物PCR。使用纯化的扩增子作为第二步PCR的大引物，并使用外部引物YalphaN21来扩增完整的突变基因。将最终扩增产物和经XhoI和NruI消化的纯化的YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P载体同时转化并通过体内重组克隆到酵母菌株BY4742中。对于L136I-L215I突变体，将NheI-EcoRV纯化片段和经XhoI和NruI消化的纯化的YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P-L215I载体(在实施例7中分离)同时转化并通过体内重组克隆到酵母菌株BY4742中。对于M134V-L136I-L215I突变体，将如上述纯化的大引物和经XhoI和NruI消化的纯化的YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P-L215I载体(在实施例7中分离)同时转化并通过体内重组克隆到酵母菌BY4742中。最后，对于M134V突变体，以YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P载体为模板，使用诱变引物5′M134V、外部引物3′PGK-term和Yaq高保真DNA聚合酶(Invitrogen)进行大引物PCR的两步反应。纯化后的扩增产物作为大引物用于第二步PCR扩增，使用YalphaN21外部引物扩增出完整的突变基因。将最终的扩增子和经XhoI和NruI消化的纯化的YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_SS-TrCel6A-S413P载体同时转化并通过体内重组克隆到酵母菌BY4742中。

5’M134V-L136I：5’GTT CCC TCT TTT GTG TGG ATA GAT ACT CTT GAC(SEQ ID NO：104)

5’M134V：      5’GTT CCC TCT TTT GTG TGG CTA GAT ACT(SEQ ID NO：105)。

实施例6：从微孔板培养物中表达和分离TrCel6A-S413P及其变体

本实施例描述了使用高通量筛选法(实施例7)从酿酒酵母中筛选和表达TrCel6A-S413P变体。

将从实施例2-5得到的酿酒酵母转化体在含有合成完全培养基(SC：2％琼脂(w/v)，0.17％酵母氮源(w/v)，0.078％Ura清除补充剂(Ura drop-out supplement)(w/v)，2％葡萄糖(w/v)，2％酪蛋白氨基酸(w/v)，0.5％硫酸铵(w/v)，pH5.5)和0.12％偶氮大麦β-葡聚糖(Megazyme)的平板中30℃培养4天。

在45℃过夜孵育后，选择显现出清晰可见晕圈的菌落通过牙签接种至96孔板中进行液体培养基预培养，所述96孔板中为150μL合成的完全培养基(SC：0.17％酵母氮源(w/v)，0.078％Ura清除补充剂(w/v)，2％葡萄糖(w/v)，2％酪蛋白氨基酸(w/v)，0.5％硫酸铵(w/v)，pH 5.5)。将预培养物在30℃300rpm条件下过夜培养(16-18小时)至稳定期。为进行表达培养物接种，将25μL的预培养物接种至含有1mL SC培养基的包含一个玻璃珠的深孔微孔板中。将表达培养物在30℃250rpm并控制湿度的条件下培养3天。以3000rpm离心上述微孔板5分钟获得沉淀细胞，将上清液吸出用于筛选测定(实施例7)。对于剩余的预培养物，通过添加终浓度为15％的甘油来制备存贮液并保存在-80℃。

实施例7：从里氏木霉的Cel6A基因文库中筛选葡萄糖耐受的家族6纤维素酶变体

本实施例描述了通过与克隆到酿酒酵母中的亲本TrCel6A-S413P比较，筛选出葡萄糖抑制作用降低的里氏木霉TrCel6A-S413P变体。

以96孔板形式，在0.25mL柠檬酸缓冲的(pH5)纤维素水解测定中对如实施例6所述从酵母微量培养物得到的TrCel6A-S413P变体进行测试。将来自每个变体的上清液等分试样加入到包含有30g/L葡萄糖的第一孔以及不合有葡萄糖的第二孔中，并与0.067％w/v浓度的纤维素一起在50℃下孵育19小时。向酵母上清液中补充里氏木霉的Cel7B和Cel5A(40mg蛋白质/g纤维素)以及125IU/g纤维素的黑曲霉β-葡糖苷酶。每个96孔板中包含6个亲本TrCel6A-S413P对照用于比较。通过比浊法测定纤维素酶活性。用存在葡萄糖时的纤维素酶活性除以不存在葡萄糖时的纤维素酶活性，计算出所有TrCel6A变体与亲本TrCel6A-S413P的±葡萄糖活性比值。将每个TrCel6A-S413P变体的±葡萄糖活性比值与特定微孔板中的6个亲本TrCel6A-S413P对照的平均值进行比较，使用t检验在95％置信区间选择阳性结果。将所有的阳性变体再次用微量培养物产生，再次筛选以降低假阳性的数量。表4总结了用EP-PCR文库(实施例3)和7个SSM文库(实施例4)获得的筛选结果。

表4：EP-PCR文库和SSM文库的筛选结果

  文库  筛选的变体数  阳性变体数  EP-PCR  4800  43  SSM-M134  100  11  SSM-L136  40  2  SSM-L215  68  0  SSM-Y103  110  16  SSM-S186  83  5  SSM-G365  104  8  SSM-R410  142  7

实施例8：从大规模培养物中表达并浓缩TrCel6A-S413P及其变体

用转化酿酒酵母的10mL过夜培养物接种两个500mL体积的无菌SC^＊-Ura培养基(0.77g/L-Ura清除补充剂，1.7g/L酵母氮源，5g/L(NH₄)₂SO₄，20g/L酪蛋白氨基酸，20g/L葡萄糖)，所述酿酒酵母由从琼脂板上新挑取的细胞培养而成。随后将培养物在30℃200rpm振摇条件下孵育96小时。

孵育后，将这两个500mL酵母培养物合并，9000rpm离心10分钟并弃去沉淀(含酵母细胞)。将上清液pH值调整至5.0，然后在4℃冷却1小时。冷却后，加入625g(NH₄)₂SO₄使酵母上清液至93％的饱和度。在4℃持续搅拌16小时使产生沉淀。第二天将沉淀物以9000rpm离心15分钟并弃去上清液。

加入pH7.0的总体积10mL的50mM磷酸钠溶液使沉淀重悬。一旦沉淀被重悬，通过轻柔颠倒将溶液混合30分钟。然后将溶液以3000rpm离心3分钟，以沉淀任何不溶性物质。将上清液用移液管小心的移出以防止沉淀混入，并保存。通过使用TrCel6A特异性抗体的ELISA，以下文实施例15中描述的纯化TrCel6A-S413P的标准曲线测定上清液中TrCel6A-S413P的浓度。通过SDS-PAGE分析(如图16中以TrCel6A-S413P显示的)来验证样品纯度。

实施例9：家族6纤维素酶变体的酶学表征

使用本领域技术人员熟知的方法从Sigmacell50中制得酸溶胀纤维素(ASC)。将ASC加pH5.0的150mM柠檬酸中进行浆化，使其终浓度为1.8g纤维素/L，并在不断搅拌下真空脱气5分钟。

通过以水或葡萄糖溶液稀释至0.6g纤维素/L的浆体在加入纤维素后600nm吸光度的降低来监测TrCel6A-S413P的活性。在数据采集过程中样品保持在50℃并持续搅拌。采用双光束吸收装置对每个样品实时减去无酶对照浆体的吸光度。在开始数据采集之后，立即在所有试管中加入50mg/g纤维素的缺少Cel7A和Cel6A的木霉纤维素酶。在不存在纤维二糖水解酶时，底物颗粒的大小没有明显的改变，因此表观吸光度由于散射物的粒径近乎不变而没有变化。在这段时间中，无纤维二糖水解酶的酶混合物生成新的链末端，该链末端是纤维二糖水解酶的酶活性作用位点。开始数据采集后的5分钟，添加亲本家族6纤维素酶或者家族6纤维素酶变体至总量为50mg/g。纤维二糖水解酶(如亲本家族6纤维素酶或者家族6纤维素酶变体)通过水解作用使底物颗粒的粒径减小，记录吸光度降低的最初斜率作为活性的度量。由于仅使用活性曲线的线性部分并且只有纤维二糖水解酶(例如亲本家族6纤维素酶或家族6纤维素酶变体)能够降低底物的表观吸光度，因此该测定仅对Cel6A活性有特异性，而不受任何潜在的非纤维二糖水解酶抑制所影响。再者，这些酶的任何影响在将亲本家族6纤维素酶与葡萄糖抑制作用降低的家族6纤维素酶变体进行比较时都是相同的。图4显示了TrCel6A-S413P的典型实验中收集的数据。

当缺乏葡萄糖时或存在浓度为10、20、30、40及50g/L的葡萄糖时，收集活性数据。在上述每种条件下收集5个重复数据组。以吸光度斜率对葡萄糖浓度绘制吸光度曲线，并用Microsoft Excel中Solver功能，以简单线性抑制模型进行拟合。采用标准统计学方法计算出最佳K_G值拟合值和95％置信区间。在缺乏葡萄糖时测定的斜率平均值作为比活性的测量值。用2型双尾t检验将每种TrCel6A-S413P变体的K_G值和比活性与亲本酶的参数值进行比较。

如下文表5中的结果以及图5-15中所示，所有的TrCel6A-S413P变体与亲本TrCel6A相比显示出至少1.8倍、高至6.73倍的葡萄糖抑制作用的降低。

表5：来源于TrCel6A-S413P的家族6纤维素酶变体的葡萄糖抑制常数

  氨基酸替换  K_c(g/L)  95％置信区间  相对K_c  P值  None(TrCel6A-S413P)  9.2  7.7-11.0  1.00  1.00  Y103A  25.1  21.2-30.2  2.73  1.5E-08

  Y103H  21.0  18.2-24.6  2.28  2.2E-07  Y103K  39.1  35.3-45.2  4.26  3.2E-11  Y103L  32.0  28.1-36.9  3.48  2.6E-10  Y103M  26.0  18.8-36.4  2.83  1.4E-07  Y103P  26.8  22.9-32.2  2.91  4.4E-09  Y103R  24.2  19.8-29.9  2.63  4.2E-08  Y103V  26.2  21.1-32.8  2.85  1.5E-08  M134I  31.7  23.0-44.3  3.45  1.7E-04  M134Q  23.7  20.6-27.7  2.58  2.3E-08  M134T  31.2  25.1-39.4  3.39  1.1E-08  M134V  24.6  20.9-29.4  2.67  2.0E-08  M134Y  23.4  18.1-30.1  2.54  1.1E-03  L136I  39.5  35.5-44.7  4.29  2.8E-11  L136V  24.9  21.7-28.5  2.71  8.9E-09  S186K  19.9  14.2-27.5  2.16  2.6E-05  S186Y  23.8  17.5-33.3  2.59  2.2E-03  G365D  17.6  12.4-24.7  1.91  3.5E-04  G365E  21.1  16.8-27.3  2.29  3.8E-03  G365Q  38.7  33.1-46.2  4.20  4.1E-11  G365S  29.8  23.2-38.6  3.23  3.7E-09  R410A  25.0  17.0-37.4  2.72  1.0E-06

  R410F  37.0  26.9-51.7  4.02  5.1E-10  R410L  49.5  27.0-97.9  5.38  8.1E-10  R410Q  37.8  28.6-51.2  4.11  2.0E-10  R410S  24.5  15.8-38.0  2.66  4.1E-06  M134V-L136I  48.6  42.3-57.0  5.28  5.8E-12  L136I-L215I  37.5  32.7-43.6  4.08  4.7E-11  M134V-L136I-L215I  61.9  50.9-76.3  6.73  1.1E-12

实施例10：产生HiCel6A和PcCel6A并将其克隆到Yep352/PGK91-1-α_SS-6His载体中Yep352/PGK91-1-α_SS-6His载体的构建

通过将引物AT044和AT045一起退火，制备含有SpeI、NheI、KpnI和EcoRI限制性位点的DNA接头。该接头在SpeI位点下游和Nhel位点上游含有6个组氨酸残基的编码序列。将接头插入到包含有pgk1启动子，α接合因子分泌信号和pgk1终止子序列的基于Yep的质粒(Yep352/PGK91-1α_SS)中，以获得质粒YEp352/PGK91-1/α_SS6HNKE。具体地，将接头作为NheI/EcoRI片段插入到位于α接合因子分泌信号下游和pgk1终止子上游的NheI和EcoRI位点之间。引物序列如下所示：

AT044：5’CTA GTC ATC ACC ATC ACC ATC ACG CTA GCT GAT CAC TGA GGT ACC G(SEQ IDNO：106)

AT045：5’AAT TCG GTA CCT CAG TGA TCA GCT AGC GTG ATG GTG ATG GTG ATG A(SEQIDNO：107)

产生YEp352/PGK91-1-α_SS-6H-HisCel6A载体

在300μL无菌水中重悬冻干的特异腐质霉，取50μL涂到Emerson YPSS pH7琼脂板上(0.4％酵母提取物，0.1％K₂HPO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，1.5％葡萄糖，1.5％琼脂)。在45℃孵育真菌6天，然后将孢子接种至Novo培养基中(按照Barbesgaard USP#4,435,307)：在100mL生长期培养基(2.4％CSL，2.4％葡萄糖，0.5％大豆油，pH调整到5.5，0.5％CaCO₃)中37℃孵育48小时，然后取6mL预培养物转移至100mL生产期培养基(0.25％NH₄NO₃，0.56％KH₂PO₄，0.44％K₂HPO₄，0.075％MgSO₄·7H₂O，2％Sigmacell，pH调整到7，0.25％CaCO₃)，将培养物孵育多至4天，然后收获生物质。按照生产商的方法，用Absolutely Miniprep试剂盒(Stratagene)从50mg生物质中分离总RNA。再按照生产商的方法，使用SuperScript^TMII逆转录酶(Invitrogen)用总RNA制备总cDNA。使用如下引物从cDNA扩增编码HisCel6A的基因：

5’HiCel6A-eDNA  5’CTA TTG CTA GCT GTG CCC CGA CTT GGG GCC AGT GC(SEQ ID NO：108)

3’HiCe16A-cDNA  5’CTA TTG AAT TCG GTA CCT CAG AAC GGC GGA TTG GCA TTA CGA AG(SEQID NO：109)

根据制造商的建议，通过TA-克隆将PCR扩增子克隆至-TEasy载体中。将pGEM-HiCel6A质粒用NheI和EcoRI消化，来释放HiCel6A基因。将该片段纯化并连接到YEp352/PGK91-1/α_SS6HNKE的NheI和EcoRI位点中，获得YEp352/PGK91-1/α_SS6H-HiCel6A。产生YEp352/PGK91-1-α_SS-6H-PcCel6A

将冻干的黄孢原毛平革菌在300μL无菌水中重悬，取50μL涂到PDA板上。将培养板在24℃培养4天。将黄孢原毛平革菌的孢子接种在PDA板上方的玻璃纸圈上，在24℃培养4-6天后收获生物质。然后，按照生产商的方法，用Absolutely Miniprep Kit(Stratagene)从50mg生物质中分离总RNA。再按照生产商方法，使用SuperScript^TMII逆转录酶(Invitrogen)从总RNA中制备总cDNA。使用如下的引物(该引物引入了N端的NheI位点以及C端的KpnI和EcoRI位点)从cDNA扩增编码PcCel6A的基因：

5’PcCel6A-cDNA    5’CTA TTG CTA GCT CGG AGT GGG GAC AGT GCG GTG GC(SEQ ID NO：110)

3’PcCel6A-cDNA    5’CTA TTG AAT TCG GTA CCC TAC AGC GGC GGG TTG GCA GCA GAA AC(SEQ ID NO：111)

根据制造商的建议，通过TA-克隆将PCR扩增子克隆至-TEasy载体中。将pGEM-PcCel6A质粒用NheI和EcoRI消化，以释放PcCel6A基因。将片段纯化并连接到YEp352/PGK91-1/α_SS6HNKE的NheI和EcoRI位点中，获得YEp352/PGK91-1/α_SS6H-PcCel6A。

实施例11：含有PcCel6A-His6、HiCel6A-His6及其变体的载体的诱变

使用两步式PCR法来构建HiCel6A和PcCel6A变体，其包括大引物合成以及随后PCR介导的重叠延伸(Vallejo等，1994)。所有的PCR反应都采用高保真iProof Taq聚合酶(BioRad)进行。对于特异腐质霉及黄孢原毛平革菌，分别以YEp352/PGK91-1-α_SS-6H-HiCel6A和YEp352/PGK91-1-α_SS-6H-PcCel6A作为模板。使用外部引物YαN21与对给定葡萄糖耐受变体具有特异性的内部反向引物(例如针对HisCel6AY107L的DK022；参考表6)相结合，扩增出诱变位点上游(并包含诱变位点)的大引物。同样的，使用外部引物PGKterm与对特定葡萄糖耐受变体具有特异性的内部正向引物(即，针对HisCel6A Y107L的DK021；参考表6)相结合，扩增出诱变位点下游(并包含诱变位点)的大引物。将内部引物设计成将期望的葡萄糖耐受突变引入Cel6A同源物中。使用SV Gel以及PCR Clean-Up系统(Promega)纯化大引物。

表6：用于将葡萄糖耐受突变引入特异腐质霉及黄孢原毛平革菌Cel6A同源物的引物列表。在原始残基与同源的里氏木霉序列不同的情况下，氨基酸为斜体。而对于引物序列，有下划线的核苷酸实现所期望的氨基酸替换。外部质粒引物也包括在内。

在第二轮PCR扩增中，使期望构建体的两种大引物退火，并延伸10个循环以形成最终的模板。然后加入外部引物YαN21和PGKterm再进行25个循环，以扩增最终的产物，随后将产物通过SV凝胶以及PCR Clean-Up系统纯化。采用Gietz和Woods(2002)所描述的方法，将纯化的PCR产物以及线性化的载体YED352/PGK91-1α_SS-6HNKE(用NheI+KpnI消化)进行转化，并通过体内重组克隆进酵母菌株BY4742中。对于每个构建体，采用改进于Hoffman和Winston(Hoffman和Winston，1987)中所描述的方法从转化的酵母菌中分离载体，并转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞中。采用Plus SV Minipreps DNA纯化系统(Promega)从大肠杆菌细胞中分离质粒。通过DNA序列分析来验证所有变体的克隆区域的完整性。

实施例12：从大规模培养物中表达并浓缩PcCel6A-His6、HiCel6A-His6及其变体

将转化酿酒酵母的10mL过夜培养物接种到两份500mL体积的无菌SC^＊-Ura培养基(0.77g/L Ura清除补充剂，1.7g/L的酵母氮源，5g/L(NH4)₂SO₄，20g/L酪蛋白氨基酸，20g/L葡萄糖)，所述酿酒酵母是由从琼脂平板上新挑取的细胞生长得到的。将然后培养物在30℃200rpm振摇条件下孵育96小时。

孵育后，将这两份500mL酵母培养物合并，9000rpm离心10分钟并弃去沉淀(含酵母细胞)。将上清液pH值调整至5.0，然后在4℃冷却1小时。加入BSA(0.1g)以帮助Cel6A共沉淀。随后冷却，加入559g(NH4)₂SO₄使酵母上清液达到85％饱和度。在4℃持续搅拌16小时以形成沉淀。第二天，将沉淀物以9000rpm离心15分钟并弃去上清液。

用移液器将沉淀重悬于总共50mL结合缓冲液(200mM NaCl，20mM磷酸钠，30mM咪唑，pH7.4)中。一旦沉淀被重悬，在4℃下轻柔颠倒30分钟，使溶液混合。然后，在如实施例13所描述的纯化步骤之前用玻璃纤维滤纸过滤溶液，以除去不溶性物质。

实施例13：PcCel6A-His6、HiCel6A-His6及其变体的纯化

为了进行活性测定(实施例14)，采用固定金属亲和层析从培养物上清液中纯化携带His标签的亲本腐质霉Cel6A及原毛平革菌Cel6A纤维素酶及其变体。在将蛋白质上样到His-trap柱前，用结合缓冲液(200mM NaCl，20mM磷酸钠，30mM咪唑，pH7.4)平衡Ni²⁺柱。将培养物上清液调整至与结合缓冲液相同的盐浓度和pH，然后以0.5-1.0mL/分钟的流速过1mL的His-trap柱(GE Healthcare)。随后用同样的结合缓冲液洗脱柱子，直到OD_280nm达到稳定的基线。结合的His标签Cel6A再用洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，500mM咪唑，pH 7.4)从柱子上洗脱。

通过更换缓冲液将洗脱缓冲液从纯化的蛋白质中除去，将5mL的洗脱级分加入15mL的50mM pH5.0柠檬酸缓冲液中并上样到Centricon Plus-20(聚醚砜膜，标称截留分子量5kDa)。在1600×g离心柱子10分钟或者直到保留在柱中的体积为2.5mL为止。此时，再向柱中加入17.5mL的50mM pH5.0柠檬酸缓冲液，并重复离心。最后一次离心以同样的方式进行最终直到柱子中仅保留1-2mL剩余物。通过Biorad蛋白测定，用已知蛋白浓度的里氏木霉纤维素酶检测最终上清液中的蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分析来验证亲本PcCel6A和HiCel6A及其变体的纯度(图16)。

实施例14：PcCel6A-His6、HiCel6A-His6及其变体的酶学表征

通过实施例9所描述的方法，使用纯化自实施例13所述酵母培养物滤液的亲本PcCel6A-His6和HiCel6A-His6纤维素酶及其变体进行活性测定。如下文表7的结果所示，所有的PcCel6A和HiCel6A变体与相应的亲本家族6纤维素酶对照比较，都显示出至少1.43倍、高至3.22倍的葡萄糖抑制作用降低。

表7：亲本PcCel6A和HiCel6A纤维素酶以及来源于PcCel6A和HiCel6A的家族6纤维素酶变体的葡萄糖抑制常数

实施例15：通过ELISA测定TrCel6A-S413P的浓度

用pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释上清液和纯化的标准品，并在4℃下在微量滴定板(Costar EIA#9018)中培养过夜。过夜孵育后，用含有0.1％Tween-20的PBS(PBS/Tween)清洗这些平板，然后室温条件下在含有1％牛血清白蛋白的PBS(PBS/BSA)中孵育1小时。将封闭后的微孔用PBS/Tween清洗。用PBS/BSA稀释TrCel6A特异性的兔多克隆抗血清，加入到微量滴定板中并在室温下孵育2小时。清洗平板并加入用PBS/BSA稀释至1/2000的偶联辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体(Sigma#A6154)，在室温下孵育1小时。清洗后，将100μL四甲基联苯胺(Sigma#8665)加入到孔中并在室温下孵育30分钟。测量每个孔在360nm下的吸光度，用TrCel6A标准曲线换算出蛋白质的浓度。

PBS包含：

组分       g/L

氯化钠     80

氯化钾     2

Na₂HPO₄    14.4

KH₂PO₄     2.4

参考文献

Barr，B.，Hsieh，Y.，Gahem，B.，and Wilson，D.(1996)Identification of two functionally different classes of exocellulases.Biochemistry 35：586.

Butler，T.and Alcalde，M.(2003)In Methods in Molecular Biology，vol.231：(F.H.Arnold and G.Georgiou，editors)，Humana Press Inc.Totowa(New Jersey)，pages 17-22.

Caminal，G.，Lopez-Santin，J.，and Sola，C.(1985)Kinetic modeling ofthe enzymatic hydrolysis of pretreated cellulose.Biotech.Bioeng.27：1282.

Claeyssens，M.and Henrissat，B.1992，Protein Science 1：1293-1297.

Converse，A.，Matsuno，R.，Tanaka，M.，and Taniguchi，M.(1988)A model of enzyme adsorption and hydrolysis of microcrystalline cellulose with slow deactivation of the adsorbedenzyme.Biotech.Bioeng.32：45.

Eriksson，T.，Karlsson，J.，and Tjerneld，F.(2002)A model explaining the declining rate in hydrolysis of lignocellulose substrates with cellobiohydrolase I(Cel7A)and endoglucanase I (Cel7B)of Trichoderma reesei.Appl.Biochem.Biotechnol.101：41.

Farrell，A.，Plevin，R.，Turner，B.，Jones，A.，O’Hare，M.，and Kammen，D.(2006)Ethanol can contribute to energy and environmental goals.Science 311：506.

Gietz，R.D.and Woods，R.A.(2002)Transformation of yeast by the Liac/ss carrier DNA/PEG method.In Methods in Enzymology，350：87-96.

Gruno，M.，Valjamae，P.，Pettersson，G.，and Johansson，G.(2004)Inhibition of the Trichoderma reesei cellulases by cellobiose is strongly dependent on the nature of the substrate.Biotech.Bioeng.86：503.

Gusakov，A.，and Sinitsyn，A.(1992)A theoretical analysis of cellulase product inhibition：Effect of cellulase binding constant，enzyme/substrate ratio，and β-glucosidase activity on theinhibition pattern.Biotech.Bi0eng.40：663.

Holtzapple，M.，Cognata，M.，Shu，Y.，and Hendrickson，C.(1990)Inhibition of Trichoderma reesei cellulase by sugars and solvents.Biotech.Bioeng.36：275.

Hoffman，C.S.，and Winston，F.(1987)A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.Gene，57：267-272.

Lee，Y-H.and Fan，L.T.(1983)Kinetic studies of enzymatic hydrolysis of insoluble cellulose：(II)Analysis of extended hydrolysis times.Biotech.Bioeng.25：939.

Meinke，A.，et a1.1995.J.Biol.Chem.270：4383-4386.

Nidetzky，B.and Steiner，W.(1993)A new approach for modeling cellulase-cellulose adsorption and the kinetics of the enzymatic hydrolysis of microcrystalline cellulose.Biotech.Bioeng.42：469.

Perlack，R.，Wright，L.，Tuhollow，A.，and Graham，R.(2005)Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry：The technical feasability of a billion-ton annual supply.Oak Ridge National Laboratory.

Steipe，B.(2004)Consensus-based engineering of protein stability：From intrabodies to thermostable enzymes.Meth.Enz.388：176.

Teleman，A.，Koivula，A.，Reinikainen，T.，A.，Teeri，T.T.，Drakenberg，T.，and Teleman，O.(1995)Progress-curve analysis shows that glucose inhibits the cellotriose hydrolysis catalysed by cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei.Eur.J.Biochem.231：250.

Tolan，J.，(2002)Iogen’s process for producing ethanol from cellulosic biomass，Clean Tech.andEnviro.Policy，3：339.

Vallejo，A.N.，Pogulis，R.J.and Pease，L.R.(1994)In vitro synthesis of novel genes：mutagenesis and recombination by PCR.PCR Methods Appl.，4：123-130.

Zhang，S.，Wolfgang，D.，and Wilson，D.(1999)Substrate heterogeniety causes the nonlinear kinetics of insoluble cellulose hydrolysis.Biotech.Bioeng.66：35.

Zhahg，S.，Irwin，D.，and Wilson，D.(2000)Site-directed mutation of noncatalytic residues of Thermobifida fusca exocellulase Cel6B.Eur.J.Biochem.267：3101.